高血脂LPL基因检测试剂盒的制作方法

本实用新型提供了一种高血脂LPL基因检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

脂质代谢为三大物质代谢之一，具有储存和供应能量、组成细胞膜结构等重要生理功能。高脂血症是脂质代谢异常最常见疾病之一，主要由脂肪代谢或转运异常造成，可表现为高胆固醇症、高甘油三脂血症或两者兼有。临床可分为原发性与继发性型，前者多由遗传性因素导致的脂代谢紊乱引起，后者常由其它糖和蛋白代谢异常、饮酒、口服避孕药、内分泌环境改变（肾脏疾病、甲状腺功能减退）等引起。血脂异常与冠心病的发生和发展关系密切，会造成较为严重的并发症。我国人群血脂水平低于发达国家，但呈逐年上升的趋势，已逐渐接近发达国家水平。目前我国高脂血症发病率为10.4％-38.0％，引起临床广泛关注。

高脂血症多由原发性因素引起，即遗传与环境因素，少数继发于其他血液、内分泌、代谢类疾病。研究表明，该病发生与遗传、环境及饮食生活等因素关系密切。

研究发现，高脂血症的发生与LPL基因存在一定的关系。脂蛋白脂酶（LPL）作为脂质代谢的关键酶，主要催化乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯水解，释放游离脂肪酸供机体利用。大量研究表明高甘油三酯血症、糖尿病和冠心病患者都存在LPL基因突变。实验研究表明，LPL发生基因突变后影响其蛋白的质量和降低脂蛋白酶活性，造成高甘油三酯血症，并由此引起动脉硬化、冠心病及胰腺炎风险增加。

LPL是高甘油三酯代谢过程中的主要限速酶，以二聚体的形式存在血管内皮细胞表面，在乳糜微粒（CM）和极低密度脂蛋白（VLDL）代谢中发挥作用。基因变异容易使脂蛋白酯酶活性偏低，引起血脂整体升高，乳糜微粒和极低密度脂蛋白水平发生升高，低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平降低，导致I型高脂血症及其引发的冠心病、糖尿病的发生风险增加。研究发现，rs320（T>G）和rs285（T>C）与中国人群高血脂的发生具有密切的联系。

技术实现要素：

本实用新型的目的是提供一种检测高血脂LPL基因常见易感位点是否发生突变的试剂盒。

为实现以上目的，本实用新型提供了一种高血脂LPL基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括盒体、盒盖、衬垫、样本保存管、PCR扩增试剂管、PCR产物纯化试剂管、DNA测序试剂管。试管排列位置固定如图1所示。

本实用新型将样本采集、LPL基因常见易感位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便快捷，且成本更低。本实用新型基于直接测序技术，可以对PCR产物直接进行DNA序列分析，明确突变位点，是现有基因突变检测方法中最直接最准确的方法，使测序工作更加简便快捷，结果判读更直观。

附图说明

图1为本实用新型提供的一种高血脂LPL基因突变检测试剂盒结构示意图；

图2为rs320无突变的结果示意图，基因型为T；

图3为rs320发生突变的结果示意图，基因型为G；

图4为rs285无突变的结果示意图，基因型为T；

图5为rs285发生突变的结果示意图，基因型为C；

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例

如图1所示，为本实用新型提供的一种高血脂LPL基因突变检测试剂盒的结构示意图，包括盒体1、盒盖2、衬垫3、样本保存管4、PCR扩增试剂管5、PCR产物纯化试剂管6、DNA测序试剂管7。

测试步骤如下：

步骤1：采集检测样品

用口腔拭子2在被测者口腔左右两腮分别各上下刮20次，保证采集到足量的细胞样本，采集完毕，样本保存于样本保存管3中。

步骤2：采用硅胶吸附法抽提样本的基因组DNA。

步骤3：PCR扩增

取1 ul的DNA提取液，加入9ul的PCR反应液，得到总体积为10 ul的PCR扩增体系。

在ABI9700型PCR扩增仪上进行，反应条件为95℃预热10分钟；再进行35个循环的95℃、45秒，60℃、45秒，72℃、60秒；72℃、7分钟后，降温至4℃。

步骤4：PCR产物纯化

取4 ul的PCR产物纯化试剂和PCR产物3 ul的PCR扩增产物，得到7 ul的PCR产物纯化体系。反应条件为：37℃、60分钟；80℃、15分钟。

步骤5：DNA测序反应

取1 ul PCR纯化产物、4 ul DNA测序试剂，得到5 ul的DNA测序体系。反应条件为：96℃ 2分钟；25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟。

反应结束后加入1ul 125 mM乙二胺四乙酸EDTA和15 ul的无水乙醇，室温沉淀15分钟；3650转/分，4℃离心30分钟，轻轻倒去上清液；加30 ul 70%乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8 ul，上测序仪。

步骤4：结果分析

在测序仪上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果。

1. 未检出突变：未发现LPL基因存在突变；

2. 检出突变：发现LPL基因存在突变。