不溶性重组蛋白凝集体的制造方法与流程

本发明涉及利用从表达不溶性重组蛋白的重组细胞中分离该重组蛋白的不溶体的方法而制造不溶性重组蛋白凝集体的方法、以及利用该方法得到的不溶性重组蛋白凝集体。
背景技术：
：基因重组宿主细胞的利用使目的蛋白的工业规模的生产成为可能。也报道了很多对利用重组细胞生产的重组蛋白进行分离、纯化的方法。重组蛋白在重组细胞内以不溶体的形式密集地生成为不溶性颗粒的情况下，通过对包含宿主细胞来源的蛋白质等成分的悬浮液进行离心分离，能够以较高的收率和高纯度分离该不溶性颗粒。例如，报道了从利用氢氧化钠等金属氢氧化物进行了可溶化的不溶性的重组细胞分离目的蛋白的方法(专利文献1)等。另一方面，在重组蛋白在重组细胞内为可溶化状态、或者即使为不溶体但不同于密集的不溶性颗粒而难以通过离心分离进行分离的情况下，报道了例如以下的纯化方法。即，报道了下述方法：利用甲酸、丙酸等有机酸对宿主细胞来源的蛋白质进行水解处理，通过离心分离等除去宿主细胞来源的不溶性物质后，以未变性状态回收目的重组蛋白，利用色谱等方法进行纯化(专利文献2)等。在该报道中，即使添加该有机酸，目的蛋白也保持未变性状态，不会发生凝集。在重组细胞内，目的重组蛋白并不一定以不溶性颗粒的形式生成，已知不溶性颗粒的生成状况根据目的重组蛋白自身的性质、或者生产时的培养基组成、培养温度、生成速度等培养过程的各种参数而有较大变化。因此，为了尽可能生成容易进行离心分离的大的不溶性颗粒，对重组蛋白的改造或高效的生产方法的开发进行了研究。另一方面，如果有能够容易地通过离心分离、过滤等对难以离心分离或离心分离非常耗费时间的微细的不溶体或者不溶性颗粒进行分离的方法，则在工业上是极为有益的，但尚未获知这样的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2013-523665号公报专利文献2：日本特表2004-503204号公报技术实现要素：发明所要解决的问题本发明的目的在于提供从以不溶体的形式在细胞内表达目的重组蛋白的重组细胞中高效地分离该重组蛋白的不溶体的方法、以及利用该分离方法制造重组蛋白凝集体的方法。用于解决问题的方法本发明人对能够容易地将难以离心分离或离心分离非常耗费时间的微细的重组蛋白的不溶体或不溶性颗粒进行分离的方法进行了深入研究，结果发现，通过高效地使该不溶体或不溶性颗粒凝集而变得巨大，能够容易地分离重组蛋白，从而完成了本发明。即，本发明涉及例如以下的各发明。[1]一种重组蛋白凝集体的制造方法，其为从以不溶体的形式在细胞内表达重组蛋白的重组细胞中以凝集体的形式分离该重组蛋白的不溶体而制造重组蛋白凝集体的方法，其中，包括：将重组细胞破碎后，使重组蛋白的不溶体凝集，并分离所得到的凝集体。[2]如[1]所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，包括：以10000×g以下的离心力分离上述重组蛋白凝集体。[3]如[1]或[2]所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，包括：利用选自由分离板型离心分离机、篮型离心分离机和倾析器型离心分离机组成的组中的离心分离机分离上述重组蛋白凝集体。[4]如[1]所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，包括：通过自然沉降或过滤来分离上述重组蛋白凝集体。[5]如[1]～[4]中任一项所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，上述重组蛋白的不溶体的凝集通过添加选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上来进行。[6]一种重组蛋白凝集体的制造方法，其包括下述(a)～(c)的步骤。(a)将以不溶体的形式在细胞内表达目的重组蛋白的重组细胞破碎，得到包含重组蛋白的不溶体的破碎悬浮液的步骤(b)在(a)步骤中得到的破碎悬浮液中添加选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上，使重组蛋白的不溶体凝集，得到重组蛋白凝集体的步骤(c)将(b)步骤中得到的凝集体从悬浮液中分离的步骤[7]如[6]所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，在上述(b)步骤中，进一步包括进行加热。[8]如[7]所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，在上述(b)步骤中，进一步包括进行搅拌。[9]如[5]～[8]中任一项所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，上述金属盐为选自由碱土金属盐和土金属盐组成的组中的金属盐。[10]如[9]所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，上述金属盐为选自由碱土金属卤化物、碱土金属硝酸盐、碱土金属硫酸盐、土金属卤化物、土金属硝酸盐和土金属硫酸盐组成的组中的金属盐。[11]如[5]～[10]中任一项所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，上述酸为含氧酸。[12]如[11]所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，上述含氧酸为选自由乙酸、硫酸和柠檬酸组成的组中的含氧酸。[13]如[5]～[12]中任一项所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，上述阴离子型凝集剂为选自由聚丙烯酸盐、阴离子型聚丙烯酰胺和丙烯酰胺-丙烯酸盐共聚物组成的组中的阴离子型凝集剂。[14]如[1]～[13]中任一项所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，上述重组细胞的破碎为机械破碎。[15]如[1]和[6]～[14]中任一项所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，上述重组蛋白凝集体的分离通过过滤进行。[16]如[1]～[15]中任一项所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，上述重组细胞为转化了选自由细菌、酵母、丝状真菌、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞组成的组中的宿主的重组细胞。[17]如[1]～[16]中任一项所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，上述重组蛋白为结构蛋白。[18]如[17]所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，上述结构蛋白为选自由角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、蚕丝和蛛丝组成的组中的蛋白质来源的蛋白质。[19]如[1]～[18]中任一项所述的重组蛋白凝集体的制造方法，其中，利用电感应区法测定的所得到的重组蛋白凝集体的粒径为4μm以上且50μm以下。[20]一种重组蛋白凝集体，其为利用[1]～[18]中任一项所述的重组蛋白凝集体的制造方法得到的重组蛋白凝集体，其中，利用电感应区法测定的粒径为4μm以上且50μm以下。[21]一种重组蛋白的分离方法，其为从以不溶体的形式在细胞内表达重组蛋白的重组细胞中分离该重组蛋白的不溶体的方法，其中，包括：将重组细胞破碎后，使重组蛋白的不溶体凝集，并分离所得到的凝集体。[22]如[21]所述的重组蛋白的分离方法，其中，包括：以10000×g以下的离心力分离上述重组蛋白凝集体。[23]如[21]或[22]所述的重组蛋白的分离方法，其中，包括：利用选自由分离板型离心分离机、篮型离心分离机和倾析器型离心分离机组成的组中的离心分离机分离上述重组蛋白凝集体。[24]如[21]所述的重组蛋白的分离方法，其中，包括：通过自然沉降或过滤来分离上述重组蛋白凝集体。[25]如[21]～[24]中任一项所述的重组蛋白的分离方法，其中，上述重组蛋白的不溶体的凝集通过添加选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上来进行。[26]一种重组蛋白的分离方法，其包括下述(a)～(c)的步骤。(a)将以不溶体的形式在细胞内表达目的重组蛋白的重组细胞破碎，得到包含重组蛋白的不溶体的破碎悬浮液的步骤(b)在(a)步骤中得到的破碎悬浮液中添加选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上，使重组蛋白的不溶体凝集，得到重组蛋白凝集体的步骤(c)将(b)步骤中得到的凝集体从悬浮液中分离的步骤[27]如[26]所述的重组蛋白的分离方法，其中，在(b)步骤中，进一步包括进行加热。[28]如[27]所述的重组蛋白的分离方法，其中，在(b)步骤中，进一步包括进行搅拌。[29]如[25]～[28]中任一项所述的重组蛋白的分离方法，其中，上述金属盐为选自由碱土金属盐和土金属盐组成的组中的金属盐。[30]如[29]所述的重组蛋白的分离方法，其中，上述金属盐为选自由碱土金属卤化物、碱土金属硝酸盐、碱土金属硫酸盐、土金属卤化物、土金属硝酸盐和土金属硫酸盐组成的组中的金属盐。[31]如[25]～[30]中任一项所述的重组蛋白的分离方法，其中，上述酸为含氧酸。[32]如[31]所述的重组蛋白的分离方法，其中，上述含氧酸为选自由乙酸、硫酸和柠檬酸组成的组中的含氧酸。[33]如[25]～[32]中任一项所述的重组蛋白的分离方法，其中，上述阴离子型凝集剂为选自由聚丙烯酸盐、阴离子型聚丙烯酰胺和丙烯酰胺-丙烯酸盐共聚物组成的组中的阴离子型凝集剂。[34]如[21]～[33]中任一项所述的重组蛋白的分离方法，其中，上述重组细胞的破碎为机械破碎。[35]如[21]和[26]～[34]中任一项所述的重组蛋白的分离方法，其中，上述重组蛋白凝集体的分离通过过滤进行。[36]如[21]～[35]中任一项所述的重组蛋白的分离方法，其中，上述重组细胞为转化了选自由细菌、酵母、丝状真菌、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞组成的组中的宿主的重组细胞。[37]如[21]～[36]中任一项所述的重组蛋白的分离方法，其中，上述重组蛋白为结构蛋白。[38]如[37]所述的重组蛋白的分离方法，其中，上述结构蛋白为选自由角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、蚕丝和蛛丝组成的组中的蛋白质来源的蛋白质。[39]一种重组蛋白凝集体的制造方法，其为使用[1～38]中任一项所述的分离方法来制造重组蛋白凝集体的方法，其中，利用电感应区法测定的利用该分离方法得到的重组蛋白凝集体的粒径为4μm以上且50μm以下。发明效果根据本发明的重组蛋白凝集体的制造方法，能够使不溶体凝集而变得巨大，因此能够通过利用例如自然沉降、离心分离或过滤从以不溶体的形式在细胞内表达目的重组蛋白的重组细胞中高效地分离该重组蛋白的不溶体来制造重组蛋白凝集体。此外，能够容易地分离迄今为止无法利用离心分离、过滤等容易地进行分离的重组蛋白的不溶体或不溶性颗粒，不仅如此，还能够提高分离出的重组蛋白的纯度。根据本发明，发挥出这样的预料不到的效果。附图说明图1是示出实施例1的、对金属盐添加所带来的不溶体的凝集效果进行研究的结果的照片。图2是示出实施例2的、对金属盐添加所带来的不溶体的凝集效果进行研究的结果的照片。图3是示出实施例3的、对金属盐添加所带来的亲水指数不同的蛋白质的不溶体的凝集效果进行研究的结果的照片。图4是示出实施例4的、对金属盐添加所带来的亲水指数不同的蛋白质的不溶体的凝集效果进行研究的结果的照片。图5是示出实施例4的、与基于金属盐添加凝集而产生的目的重组蛋白的纯度提高相关的、利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的分析的结果的照片。a是在电泳后利用能够将全部蛋白质染色的oriole(商标)荧光凝胶染色剂(bio-rad公司制)进行染色而得到的照片，b是在电泳后利用与prt410的his标签区域反应的invision(商标)带his标签的凝胶内染色试剂(thermofisherscientific公司制)进行染色而得到的照片。图6是示出实施例5的、对酸添加所带来的不溶体的凝集效果进行研究的结果的照片。图7是示出实施例5的、对清洗后的不溶体中的酸添加所带来的不溶体的凝集效果进行研究的结果的照片。图8是示出实施例6的、对酸添加所带来的亲水指数不同的蛋白质的不溶体的凝集效果进行研究的结果的照片。图9是示出实施例6的、与基于酸添加凝集而产生的目的重组蛋白的纯度提高相关的、利用sds-page的分析的结果的照片。图10是示出实施例8的、对凝集剂添加所带来的不溶体的凝集效果进行研究的结果的照片。图11是示出实施例9的、与基于阴离子型凝集剂添加凝集而产生的目的重组蛋白的纯度提高相关的、利用sds-page的分析的结果的照片。图12是示出实施例10的、用于确认凝集效果的粒径的频率分布和累积分布的图。图13是示出实施例12的、与基于加热而产生的杂蛋白的分解相关的、利用sds-page的分析的结果的照片。图14是示出实施例12的、与基于加热而产生的目的重组蛋白的纯度提高相关的、利用sds-page的分析的结果的照片。图15是示出实施例13的、用于确认连续加热所带来的凝集效果的、样品c、x、1、2和3的粒径的频率分布和累积分布的图。图16是示出实施例13的、用于确认连续加热所带来的凝集效果的、样品4、5、6、7和8的粒径的频率分布和累积分布的图。具体实施方式以下，对本发明的具体实施方式详细进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。一个实施方式的重组蛋白凝集体的制造方法为从以不溶体的形式在细胞内表达重组蛋白的重组细胞中以凝集体的形式分离该重组蛋白的不溶体而制造重组蛋白凝集体的方法，其特征在于，包括：将重组细胞破碎后，使重组蛋白的不溶体凝集并进行分离。该制造方法中，重组蛋白的不溶体的凝集优选通过添加选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上来进行。另一实施方式的重组蛋白凝集体的制造方法的特征在于，包括下述(a)～(c)的步骤：(a)将以不溶体的形式在细胞内表达目的重组蛋白的重组细胞破碎，得到包含重组蛋白的不溶体的破碎悬浮液的步骤；(b)在(a)步骤中得到的破碎悬浮液中添加选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上，使重组蛋白的不溶体凝集，得到重组蛋白凝集体的步骤；(c)将(b)步骤中得到的凝集体从悬浮液中分离的步骤。(重组蛋白)利用本实施方式的重组蛋白凝集体的制造方法分离的不溶性重组蛋白(本说明书中有时称为“目的蛋白”)以不溶体的形式在下述重组细胞内表达。作为重组蛋白，可以列举适合以工业规模制造的任意的不溶性蛋白质，可以列举例如能够用于工业用途的蛋白质、能够用于医疗用途的蛋白质、结构蛋白等。作为能够用于工业用途或医疗用途的蛋白质的具体例，可以列举酶、调控蛋白、受体、肽激素、细胞因子、膜和转运蛋白、预防接种中使用的抗原、疫苗、抗原结合蛋白、免疫刺激蛋白、过敏原、全长抗体和抗体片段以及它们的衍生物。作为结构蛋白的具体例，可以列举角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、蚕丝和蛛丝、以及来源于它们的蛋白质等。作为丝心蛋白样蛋白质的蛛丝或蚕丝来源的蛋白质可以列举例如包含式1：[(a)n基序-rep]m所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式1中，(a)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(a)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为80％以上。rep表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示8～300的整数。两个以上存在的(a)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的rep彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。)。具体而言，可以列举包含序列号1(prt410)、序列号2(prt853)、序列号3(prt647)、序列号4(prt699)和序列号5(prt698)所表示的氨基酸序列的蛋白质等。这些蛋白质的亲水指数分别为-0.81、-0.68、0.04、0.17和0.43。亲水指数的值为依照国际公开第2014/103846号中记载的方法算出的值。作为胶原蛋白来源的蛋白质，可以列举例如包含式2：[rep2]o所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式2中，o表示5～300的整数。rep2表示由gly-x-y构成的氨基酸序列，x和y表示gly以外的任意的氨基酸残基。两个以上存在的rep2彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。)。具体而言，可以列举包含序列号6所表示的氨基酸序列的蛋白质(iv型胶原蛋白-kai)。序列号6所表示的氨基酸序列是在从ncbi数据库获得的人iv型胶原蛋白的部分序列(ncbi的genbank的登记号：caa56335.1、gi：3702452)的相当于重复部分和基序的第301位残基至第540位残基的氨基酸序列的n末端附加序列号10所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。iv型胶原蛋白-kai的亲水指数为-0.75。作为节肢弹性蛋白来源的蛋白质，可以列举例如包含式3：[rep3]p所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式3中，p表示4～300的整数。rep3表示由ser-j-j-tyr-gly-u-pro构成的氨基酸序列。j表示任意的氨基酸残基，特别优选为选自由asp、ser和thr组成的组中的氨基酸残基。u表示任意的氨基酸残基，特别优选为选自由pro、ala、thr和ser组成的组中的氨基酸残基。两个以上存在的rep3彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。)。具体而言，可以列举包含序列号7所表示的氨基酸序列的蛋白质。序列号7所表示的氨基酸序列是在节肢弹性蛋白(ncbi的genbank的登记号np_611157.1、gl：24654243)的氨基酸序列中将第87位残基的thr置换成ser并且将第95位残基的asn置换成asp的置换后的序列的第19位残基至第321位残基的氨基酸序列的n末端附加序列号10所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。节肢弹性蛋白-kai(序列号7)的亲水指数为-1.22。作为弹性蛋白来源的蛋白质，可以列举例如具有ncbi的genbank的登记号aac98395(人)、i47076(绵羊)、np786966(牛)等的氨基酸序列的蛋白质。具体而言，可以列举包含序列号8所表示的氨基酸序列的蛋白质。序列号8所表示的氨基酸序列是在ncbi的genbank的登记号aac98395的氨基酸序列的第121位残基至第390位残基的氨基酸序列的n末端附加序列号10所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。elastinshort(弹性蛋白短)(序列号8)的亲水指数为0.42。作为角蛋白来源的蛋白质，可以列举例如山羊(caprahircus)的i型角蛋白等。具体而言，可以列举包含序列号9所表示的氨基酸序列(ncbi的genbank的登记号acy30466的氨基酸序列)的蛋白质。i型角蛋白26(序列号9)的亲水指数为-0.53。(重组细胞)本实施方式中的重组细胞是以不溶体的形式在细胞内表达重组蛋白的重组细胞，可以使用利用基因工程方法的一般的方法来获得。重组细胞例如可以通过利用具有编码目的蛋白的核酸序列和以能够工作的方式与该核酸序列连接的一个或两个以上调节序列的表达载体对宿主(宿主细胞)进行转化而得到。调节序列是对宿主中的重组蛋白的表达进行调控的序列(例如启动子、增强子、核糖体结合序列、转录终止序列等)，可以根据宿主的种类适当选择。表达载体的种类可以根据宿主的种类适当选择质粒载体、病毒载体、柯斯质粒(cosmid)载体、福斯质粒(fosmid)载体、人工染色体载体等。作为宿主，原核生物、以及酵母、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞等真核生物均可以优选使用。更优选为细菌、酵母、丝状真菌、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞。例如，作为原核生物的优选例，可以列举大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、棒杆菌、乳球菌等，更优选可以列举大肠杆菌细胞。作为表达载体，优选使用在宿主细胞中能够自主复制、或者能够整合到宿主的染色体中、且在能够对编码目的蛋白的核酸进行转录的位置含有启动子的表达载体。可以包含核糖体结合序列、转录终止序列或对启动子进行调控的基因序列。作为启动子，只要是在宿主细胞中发挥功能、能够诱导目的蛋白表达的诱导型启动子即可。诱导型启动子是能够根据存在诱导物质(表达诱导剂)、不存在阻遏物分子、或者温度、渗透压或ph值的上升或降低等物理因素对转录进行调控的启动子。作为原核生物的宿主，可以列举属于埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属等的微生物。作为属于埃希氏菌属的微生物，可以列举例如大肠杆菌bl21(novagen公司)、大肠杆菌bl21(de3)(lifetechnology公司)、大肠杆菌blr(de3)(默克密理博公司)、大肠杆菌dh1、大肠杆菌gi698、大肠杆菌hb101、大肠杆菌jm109、大肠杆菌k5(atcc23506)、大肠杆菌ky3276、大肠杆菌mc1000、大肠杆菌mg1655(atcc47076)、大肠杆菌no.49、大肠杆菌rosetta(de3)(novagen公司)、大肠杆菌tb1、大肠杆菌tuner(novagen公司)、大肠杆菌tuner(de3)(novagen公司)、大肠杆菌w1485、大肠杆菌w3110(atcc27325)、大肠杆菌(escherichiacoli)xl1-blue、大肠杆菌xl2-blue等。作为属于短芽孢杆菌属的微生物，可以列举例如土壤短芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌、中孢短芽孢杆菌、美丽短芽孢杆菌、铫子短芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、沼泽短芽孢杆菌、副短短芽孢杆菌、罗伊氏短芽孢杆菌、热红短芽孢杆菌、短短芽孢杆菌47(fermbp-1223)、短短芽孢杆菌47k(fermbp-2308)、短短芽孢杆菌47-5(fermbp-1664)、短短芽孢杆菌47-5q(jcm8975)、桥石短芽孢杆菌hpd31(fermbp-1087)、桥石短芽孢杆菌hpd31-s(fermbp-6623)、桥石短芽孢杆菌hpd31-ok(fermbp-4573)、桥石短芽孢杆菌sp3株(takara公司制)等。作为属于沙雷氏菌属的微生物，可以列举例如液化沙雷氏菌(serratialiquefacience)atcc14460、嗜虫沙雷氏菌(serratiaentomophila)、无花果沙雷氏菌(serratiaficaria)、居泉沙雷氏菌(serratiafonticola)、格氏沙雷氏菌(serratiagrimesii)、变形斑沙雷氏菌(serratiaproteamaculans)、气味沙雷氏菌(serratiaodorifera)、普城沙雷氏菌(serratiaplymuthica)、深红沙雷氏菌(serratiarubidaea)等。作为属于芽孢杆菌属的微生物，可以列举例如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)等。作为属于微杆菌属的微生物，可以列举例如嗜氨微杆菌atcc15354等。作为属于短杆菌属的微生物，可以列举例如叉开短杆菌(谷氨酸棒杆菌)atcc14020、黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌atcc14067)atcc13826、atcc14067、乳发酵短杆菌(brevibacteriumimmariophilum)atcc14068、乳酸发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌atcc13869)atcc13665、atcc13869、玫瑰色短杆菌atcc13825、解糖短杆菌(brevibacteriumsaccharolyticum)atcc14066、生硫短杆菌atcc19240、白色短杆菌atcc15111、蜡状短杆菌atcc15112等。作为属于棒杆菌属的微生物，可以列举例如产氨棒杆菌(corynebacteriumammoniagenes)atcc6871、atcc6872、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13032、谷氨酸棒杆菌atcc14067、嗜乙酰乙酸棒杆菌(corynebacteriumacetoacidophilum)atcc13870、醋谷棒杆菌atcc15806、解烷棒杆菌atcc21511、帚石南棒杆菌atcc15991、谷氨酸棒杆菌atcc13020、atcc13032、atcc13060、百合棒杆菌atcc15990、栖糖蜜棒杆菌atcc17965、嗜热产氨棒杆菌aj12340(fermbp-1539)、力士棒杆菌atcc13868等。作为属于假单胞菌(pseudomonas)属的微生物，可以列举例如恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、油菜假单胞菌(pseudomonasbrassicacearum)、黄褐假单胞菌(pseudomonasfulva)和假单胞菌属菌(pseudomonassp.)d-0110等。作为向上述原核生物的宿主细胞中导入表达载体的方法，只要是向上述宿主细胞中导入dna的方法则均可以使用。可以列举例如使用钙离子的方法[proc.natl.acad.sci.usa,69,2110(1972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394)、或gene,17,107(1982)、molecular&generalgenetics,168,111(1979)中记载的方法等。属于短芽孢杆菌属的微生物的转化可以利用例如takahashi等的方法(j.bacteriol.,1983,156:1130-1134)、takagi等的方法(agric.biol.chem.,1989,53:3099-3100)、或okamoto等的方法(biosci.biotechnol.biochem.,1997,61:202-203)来实施。作为导入编码目的蛋白的核酸的载体(以下简称为“载体”)，可以列举例如pbtrp2、pbtac1、pbtac2(均由boehringermannheim公司销售)、pkk233-2(pharmacia公司制)、pse280(invitrogen公司制)、pgemex-1(promega公司制)、pqe-8(qiagen公司制)、pkyp10(日本特开昭58-110600)、pkyp200[agric.biol.chem.,48,669(1984)]、plsa1[agric.biol.chem.,53,277(1989)]、pgel1[proc.natl.acad.sci.usa,82,4306(1985)]、pbluescriptiisk(-)(stratagene公司制)、ptrs30[由大肠杆菌jm109/ptrs30(fermbp-5407)制备]、ptrs32[由大肠杆菌jm109/ptrs32(fermbp-5408)制备]、pgha2[由大肠杆菌igha2(fermb-400)制备、日本特开昭60-221091]、pgka2[由大肠杆菌igka2(fermbp-6798)制备、日本特开昭60-221091]、pterm2(us4686191、us4939094、us5160735)、psupex、pub110、ptp5、pc194、peg400[j.bacteriol.,172,2392(1990)]、pgex(pharmacia公司制)、pet系统(novagen公司制)等。在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，可以列举puc18、pbluescriptii、psupex、pet22b、pcold等作为优选的载体。作为属于短芽孢杆菌属的微生物的优选载体的具体例，可以列举作为枯草杆菌载体公知的pub110、或phy500(日本特开平2-31682号公报)、pny700(日本特开平4-278091号公报)、phy4831(j.bacteriol.,1987,1239-1245)、pnu200(鹈高重三、日本农艺化学会志1987,61:669-676)、pnu100(appl.microbiol.biotechnol.,1989,30:75-80)、pnu211(j.biochem.,1992,112:488-491)、pnu211r2l5(日本特开平7-170984号公报)、pnh301(appl.environ.microbiol.,1992,58:525-531)、pnh326、pnh400(j.bacteriol.,1995,177:745-749)、pht210(日本特开平6-133782号公报)、pht110r2l5(appl.microbiol.biotechnol.,1994,42:358-363)、或大肠杆菌与属于短芽孢杆菌属的微生物的穿梭载体pnco2(日本特开2002-238569号公报)等。作为以原核生物为宿主的情况下的启动子，只要在宿主细胞中发挥功能则没有限制。可以列举例如trp启动子(ptrp)、lac启动子、pl启动子、pr启动子、t7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，也可以使用将两个ptrp串联而成的启动子(ptrp×2)、tac启动子、lact7启动子、leti启动子这样人为地进行了设计改造的启动子等。优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(shine-dalgarno)序列与起始密码子之间调节为适当距离(例如6～18个碱基)的质粒。在上述表达载体中，上述核酸的表达不一定需要转录终止序列，但优选紧挨在编码目的蛋白的核酸的下游配置转录终止序列。作为真核生物的宿主，可以列举例如酵母、丝状真菌(霉菌等)和昆虫细胞。作为酵母，可以列举例如属于酵母(saccharomyces)属、裂殖酵母(schizosaccharomyces)属、克鲁维酵母(kluyveromyces)属、丝孢酵母(trichosporon)属、许旺酵母(schwanniomyces)属、毕赤酵母(pichia)属、假丝酵母(candida)属、耶氏酵母属和汉逊酵母属等的酵母。更具体而言，可以列举酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)、丛生丝孢酵母(trichosporonpullulans)、河岸许旺酵母(schwanniomycesalluvius)、西方许旺酵母(schwanniomycesoccidentalis)、产朊假丝酵母(candidautilis)、巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、安格斯毕赤酵母(pichiaangusta)、甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica)、多形毕赤酵母(pichiapolymorpha)、树干毕赤酵母(pichiastipitis)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)等。使用酵母作为宿主细胞的情况下的表达载体通常优选包含复制起点(需要在宿主中扩增的情况)和用于大肠杆菌中的载体的增殖的筛选标志物、用于酵母中的重组蛋白表达的启动子和终止子、以及用于酵母的筛选标志物。在表达载体为非整合载体的情况下，优选进一步包含自主复制序列(ars)。由此，能够提高表达载体在细胞内的稳定性(myers、a.m.、etal.(1986)gene45:299-310)。作为使用酵母作为宿主的情况下的载体，可以列举例如yep13(atcc37115)、yep24(atcc37051)、ycp50(atcc37419)、yip、phs19、phs15、pa0804、phil3ol、phil-s1、ppic9k、ppiczα、pgapzα、ppiczb等。作为以酵母为宿主的情况下的启动子的具体例，只要能够在酵母中表达则没有限制。可以列举例如己糖激酶等糖酵解系统的基因的启动子、pho5启动子、pgk启动子、gap启动子、adh启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克多肽启动子、mfα1启动子、cup1启动子、pgap启动子、pgcw14启动子、aox1启动子、mox启动子等。作为向酵母中导入表达载体的方法，只要是将dna导入酵母中的方法则均可以使用，可以列举例如电穿孔法(methodsenzymol.,194,182(1990))、原生质球法(proc.natl.acad.sci.,usa,81,4889(1984))、乙酸锂法(j.bacteriol.,153,163(1983))、proc.natl.acad.sci.usa,75,1929(1978)记载的方法等。作为丝状真菌，可以列举例如属于顶孢霉(acremonium)属、曲霉(aspergillus)属、黑粉菌(ustilago)属、木霉(trichoderma)属、链孢霉(neurospora)属、镰孢霉(fusarium)属、腐质霉(humicola)属、青霉(penicillium)属、毁丝霉(myceliophtora)属、灰霉(botryts)属、稻瘟霉(magnaporthe)属、毛霉(mucor)属、绿僵菌(metarhizium)属、红曲霉(monascus)属、根霉(rhizopus)属和根毛霉属的菌等。作为丝状真菌的具体例，可以列举阿拉巴马顶孢霉(acremoniumalabamense)、解纤维枝顶孢霉(acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(aspergillusawamori)、米曲霉(aspergillusoryzae)、清酒曲霉(aspergillussake)、酱油曲霉(aspergillussojae)、塔宾曲霉(aspergillustubigensis)、黑曲霉(aspergillusniger)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、寄生曲霉(aspergillusparasiticus)、无花果曲霉(aspergillusficuum)、海枣曲霉(aspergillusphoeicus)、臭曲霉(aspergillusfoetidus)、黄曲霉(aspergillusflavus)、烟曲霉(aspergillusfumigatus)、日本曲霉(aspergillusjaponicus)、绿色木霉(trichodermaviride)、哈茨木霉(trichodermaharzianum)、里氏木霉(trichodermareseei)、拉克淖金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)、嗜热子囊菌(thermoascus)、孢子丝菌(sporotrichum)、嗜纤维素侧孢霉(sporotrichumcellulophilum)、篮状菌(talaromyces)、太瑞斯梭孢壳霉(thielaviaterrestris)、梭孢壳霉(thielavia)、粗糙链孢霉(neurosporacrassa)、尖孢镰孢霉(fusariumoxysporus)、禾谷镰孢霉(fusariumgraminearum)、镶片镰孢霉(fusariumvenenatum)、特异腐质霉(humicolainsolens)、产黄青霉(penicilliumchrysogenum)、卡门培尔青霉(penicilliumcamemberti)、灰白青霉(penicilliumcanescens)、埃默森青霉(penicilliumemersonii)、绳状青霉(penicilliumfuniculosum)、灰玫瑰青霉(penicilliumgriseoroseum)、产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)、娄地青霉(penicilliumroqueforti)、嗜热毁丝霉(myceliophtaorathermophilum)、不明毛霉(mucorambiguus)、卷枝毛霉(mucorcircinelloides)、易脆毛霉(mucorfragilis)、冻土毛霉(mucorhiemalis)、不等孢毛霉(mucorinaequisporus)、mucoroblongiellipticus、总状毛霉(mucorracemosus)、反屈毛霉(mucorrecurvus)、土星状毛霉(mocorsaturninus)、mocorsubtilissmus、多形欧加铁菌(ogataeapolymorpha)、黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)、微小根毛霉(rhizomucorpusillus)、少根根霉(rhizopusarrhizus)等。作为以丝状真菌为宿主的情况下的启动子的具体例，可以为参与糖酵解系统的基因、参与构成性表达的基因、参与水解的酶基因等中的任意一种，具体而言，可以列举amyb、glaa、agda、glab、tef1、xynf1tannasegene、no.8an、gpda、pgka、enoa、melo、sodm、cata、catb等。表达载体向丝状真菌中的导入可以使用现有公知的方法进行。可以列举例如cohen等的方法(氯化钙法)[proc.natl.acad.sci.usa,69:2110(1972)]、原生质体法[mol.gen.genet.,168:111(1979)]、感受态细胞法[j.mol.biol.,56:209(1971)]、电穿孔法等。作为昆虫细胞，可以列举例如鳞翅类的昆虫细胞，更具体而言，可以列举sf9和sf21等草地夜蛾(spodopterafrugiperda)来源的昆虫细胞、以及high5等粉纹夜蛾(trichoplusiani)来源的昆虫细胞等。作为使用昆虫细胞作为宿主的情况下的载体，可以列举例如作为感染夜蛾科昆虫的病毒的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus)等杆状病毒(baculovirusexpressionvectors,alaboratorymanual(杆状病毒表达载体实验室手册),w.h.freemanandcompany,纽约(1992))。在使用昆虫细胞作为宿主的情况下，可以利用例如currentprotocolsinmolecularbiology(分子生物学现行规范)；baculovirusexpressionvectors,alaboratorymanual(杆状病毒表达载体实验室手册),w.h.freemanandcompany,纽约(1992)；bio/technology,6,47(1988)等中记载的方法对多肽进行表达。即，可以将重组基因导入载体和杆状病毒共导入到昆虫细胞中，在昆虫细胞培养上清中得到重组病毒(表达载体)后，进一步使重组病毒感染昆虫细胞，使多肽进行表达。作为该方法中使用的基因导入载体，可以列举例如pvl1392、pvl1393、pbluebaciii(均为invitorogen公司制)等。作为用于制备重组病毒的、重组基因导入载体和杆状病毒向昆虫细胞中的共导入方法，可以列举例如磷酸钙法(日本特开平2-227075)、脂质体转染法(proc.natl.acad.sci.usa,84,7413(1987))等。上述重组载体优选进一步含有用于转化体选择的选择标志物基因。例如，在大肠杆菌中，作为选择标志物基因，可以使用针对四环素、氨苄青霉素、卡那霉素等各种药剂的抗性基因。也可以使用能够与营养需求性相关的基因变异互补的劣性的选择标志物。在酵母中，作为选择标志物基因，可以使用针对遗传霉素的抗性基因，也可以使用与营养需求性相关的基因变异互补的基因、leu2、ura3、trp1、his3等选择标志物。在丝状真菌中，作为选择标志物基因，可以列举选自由niad(biosci.biotechnol.biochem.,59,1795-1797(1995))、argb(enzymemicrobioltechnol,6,386-389,(1984))、sc(gene,84,329-334,(1989))、ptra(bioscibiotechnolbiochem,64,1416-1421,(2000))、pyrg(biochembiophysrescommun,112,284-289,(1983))，amds(gene,26,205-221,(1983))、金担子素抗性基因(molgengenet,261,290-296,(1999))、苯菌灵抗性基因(procnatlacadsciusa,83,4869-4873,(1986))和潮霉素抗性基因(gene,57,21-26,(1987))组成的组中的标志物基因、亮氨酸需求性互补基因等。另外，在宿主为营养需求性变异株的情况下，也可以使用与该营养需求性互补的野生型基因作为选择标志物基因。利用上述表达载体进行了转化的宿主的选择可以通过使用选择地与上述核酸结合的探针的噬菌斑杂交和菌落杂交等来进行。作为该探针，可以使用将基于上述核酸的序列信息利用pcr法扩增出的部分dna片段用放射性同位素或地高辛进行修饰而得到的探针。(重组蛋白的表达)在利用用于表达目的蛋白的上述表达载体进行了转化的重组细胞中，重组蛋白以不溶体的形式在细胞内表达。重组蛋白可以通过将重组细胞在培养用培养基中培养来进行表达。将重组细胞在培养用培养基中培养的方法可以依照宿主的培养中通常使用的方法来进行。在上述宿主为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的情况下，作为培养用培养基，只要是含有该宿主可同化的碳源、氮源和无机盐类等、能够高效地进行该宿主的培养的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基中的任意一种。作为碳源，只要是该宿主可同化的碳源即可，可以使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有这些糖的糖蜜、淀粉和淀粉水解物等碳水化合物、乙酸和丙酸等有机酸、以及乙醇和丙醇等醇类。作为氮源，可以使用例如氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其他含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕和豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化产物。作为无机盐，可以使用例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的培养例如可以在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度例如为15～40℃。培养时间通常为16小时～7天。培养中的培养用培养基的ph优选保持于3.0～9.0。培养用培养基的ph的调节可以使用无机酸、有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙和氨等进行。另外，培养中，可以根据需要在培养用培养基中添加氨苄青霉素和四环素等抗生素。在对利用使用诱导型启动子作为启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如，在对利用使用lac启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷等；在对利用使用trp启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。作为昆虫细胞的培养用培养基，可以使用通常使用的tnm-fh培养基(pharmingen公司制)、sf-900iisfm培养基(lifetechnologies公司制)、excell400、excell405(均为jrhbiosciences公司制)、grace昆虫培养基(nature,195,788(1962))等。昆虫细胞的培养例如可以在培养用培养基的ph为6～7、培养温度为25～30℃等条件下使培养时间为1～5天来进行。另外，培养中，可以根据需要在培养用培养基中添加庆大霉素等抗生素。在宿主为植物细胞的情况下，转化后的植物细胞可以直接进行培养，另外也可以分化为植物的器官来进行培养。作为培养该植物细胞的培养基，可以使用通常使用的murashige&skoog(ms)培养基、怀特(white)培养基、或者在这些培养基中添加生长素、细胞分裂素等植物激素而得到的培养基等。动物细胞的培养例如可以在培养用培养基的ph为5～9、培养温度为20～40℃等条件下使培养时间为3～60天来进行。另外，培养中，可以根据需要在培养基中添加卡那霉素、潮霉素等抗生素。利用上述方法，能够以不溶体的形式在重组细胞内表达目的蛋白。(a)重组细胞的破碎步骤步骤(a)是将以不溶体的形式在细胞内表达目的重组蛋白的重组细胞破碎，得到包含重组蛋白的不溶体的破碎悬浮液的步骤。重组细胞的破碎可以依照公知的方法进行。即，通过利用溶菌酶、变溶菌素、溶壁酶、酵母裂解酶等的酶处理进行的细胞的破碎、利用与有机溶剂等的接触进行的细胞破碎、利用渗透压进行的细胞破碎、球磨机、弗氏压碎器、高压匀浆器、超声波处理等物理性/机械性细胞破碎和它们的组合来进行。重组细胞的破碎中可以直接使用通过上述培养得到的培养液，但为了提高之后得到的重组蛋白的纯度，优选使用经过清洗的重组细胞的悬浮液。经过清洗的重组细胞的悬浮液可以利用下述方法制备。即，通过离心分离、过滤等从培养液中分离重组细胞。若考虑后续的步骤，则优选用水清洗，也优选用缓冲水溶液等清洗后进一步用水清洗。可以通过将所得到的重组细胞以适当的浓度悬浮在适合于上述破碎方法的溶液中来制备。另外，也可以使用利用有机溶剂等对从培养液中得到的重组细胞进行处理，将除去重组细胞的宿主来源的蛋白质等可溶性级分后的不溶性级分以适当的浓度悬浮在适合于上述破碎方法的溶液中而得到的悬浮液。这种情况下，在通过有机溶剂等处理将菌体破碎的情况下，可以将该有机溶剂等处理(与有机溶剂等的接触等)视为上述破碎处理。即，可以在有机溶剂等处理后进行下述(b)重组蛋白不溶体的凝集步骤。作为适当的溶液，可以列举工业用水、去离子水、ro(反渗透，reverseosmosis)水等水、缓冲水溶液等。作为缓冲水溶液，可以列举例如tris/hcl缓冲液等。所得到的破碎悬浮液包含重组蛋白的不溶体。本说明书中，“不溶体”是指对溶液(悬浮液)呈不溶性的蛋白质，也有时会形成不溶性颗粒。另外，破碎悬浮液中包含能够容易地进行离心分离的细胞碎片，可以使用除去这些细胞碎片后的悬浮液进行下述凝集步骤。此外，有时破碎悬浮液中的不溶性颗粒混入有杂质，可通过离心分离进行分离。这种情况下，可以进行离心分离，使所获得的包含不溶性颗粒的沉淀级分再悬浮于上述缓冲水溶液中，进入下述凝集步骤。(b)重组蛋白不溶体的凝集步骤步骤(b)是在上述(a)步骤中得到的破碎悬浮液中添加选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上，使重组蛋白的不溶体凝集，得到重组蛋白凝集体的步骤。步骤(b)中，可以根据需要进行加热和/或搅拌。作为金属盐，可以列举例如碱土金属盐、土金属盐(土類金属塩)。具体而言，可以列举碱土金属卤化物、碱土金属硝酸盐、碱土金属硫酸盐、土金属卤化物、土金属硝酸盐、土金属硫酸盐等。作为金属盐，优选二价以上的多价金属盐。作为碱土金属卤化物，可以列举例如氯化钙、氯化镁、溴化镁、溴化钙、碘化镁、碘化钙等。作为碱土金属硝酸盐，可以列举例如硝酸钙、硝酸镁、硝酸锶、硝酸钡等。作为碱土金属硫酸盐，可以列举例如硫酸钙、硫酸镁、硫酸锶、硫酸钡等。作为土金属卤化物，可以列举例如三氯化铝、三氯化镓等。作为土金属硝酸盐，可以列举例如硝酸铝、硝酸镓等。作为土金属硫酸盐，可以列举例如硫酸铝、硫酸镓等。这些金属盐可以分别单独使用，也可以组合使用两种以上。作为优选的金属盐，可以列举碱金属卤化物、碱土金属卤化物，作为具体的优选例，可以列举氯化锂、氯化钙等。作为金属盐的添加量，在重组蛋白在破碎悬浮液中形成密集的不溶性颗粒的情况下，即使少量添加也可确认到效果，以达到例如0.01～20mm、优选1～10mm的方式添加金属盐即可。在未形成不溶性颗粒的不溶体或为了通过离心分离使其沉降要花费时间的不溶性颗粒的情况下，以达到2～50mm、优选5～10mm的方式添加金属盐即可。作为酸，可以使用无机酸和有机酸中的任意一种。作为优选的酸，可以列举含氧酸等。作为无机酸的含氧酸，可以列举硫酸、硝酸、磷酸等。作为有机酸的含氧酸，可以列举甲酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸等。作为含氧酸，优选乙酸、硫酸、柠檬酸，更优选柠檬酸。作为酸的添加量，在重组蛋白在破碎悬浮液中形成密集的不溶性颗粒的情况下，即使少量添加也可确认到效果，以达到例如0.01～20mm、优选1～20mm、进一步优选5～20mm的方式添加酸即可。在未形成不溶性颗粒的不溶体或为了通过离心分离使其沉降要花费时间的不溶性颗粒的情况下，以达到2～50mm、优选10～30mm的方式添加酸即可。这些酸可以分别单独使用，也可以组合使用两种以上。本说明书中，“阴离子型凝集剂”是指具有有机类阴离子基团的高分子凝集剂(聚合物)。作为阴离子型凝集剂，可以列举例如聚丙烯酸盐类、阴离子型聚丙烯酰胺类、丙烯酰胺-丙烯酸盐共聚物类等。具体而言，可以列举栗田工业公司制的クリファームpa系列(pa-923、pa-896、pa-895、pa-893、pa-865、pa-823、pa-813、pa-804、pa-465、pa-404、pa-402、pa-265等)、三井化学アクアポリマー公司制的アコフロック(a-95～a-100、a-110～a-150、a-190、a-235h～a-250等)、スミフロック(fa-40～fa-70)、三菱丽阳公司制的ダイヤフロックap系列(ap335b、ap741b、ap825c等)、多木化学株式会社制的タキフロックa系列(a-102～a-106、a-108、a-142、a-162)、户上电机制作所的トガミフロック(ta-089、ta-104、ta-109、ta-124、ta-144、tae-2325、tae-2335、tae-2644等)等。这些凝集剂中，也具有使宿主细胞自身凝集的作用，因此，在使用凝集剂的情况下，优选使用预先去除了细胞碎片的破碎悬浮液。作为阴离子型凝集剂的添加量，以重组蛋白在破碎悬浮液中达到0.001～0.1％、优选0.01～0.05％的方式添加阴离子型凝集剂即可。关于金属盐、酸或阴离子型凝集剂的添加，与分别单独添加相比，通过组合添加在低浓度的添加时即可得到效果。(b)的凝集步骤中，在添加选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上后，为了促进凝集而使凝集体成为大型，也可以进行加热。加热的手段没有特别限定。加热温度(峰值温度)没有特别限定，从高效地得到不溶体或不溶性颗粒的观点和菌体灭活的观点出发，根据目的重组蛋白的种类，加热温度例如为60℃以上、优选为70℃以上、进一步优选为80℃以上。另外，从抑制目的蛋白的分解、提高目的蛋白的纯度的观点出发，根据目的蛋白的种类，例如为130℃以下、优选为110℃以下、进一步优选为90℃以下。加热时间(维持加热温度的时间)没有特别限定，从高效地得到不溶体或不溶性颗粒的观点和菌体灭活的观点出发，根据目的重组蛋白的种类，例如为0.5小时以上、优选为1小时以上、进一步优选为2小时以上。另外，从抑制目的蛋白的分解、提高作业效率的观点出发，根据目的蛋白的种类，例如为15小时以下、优选为10小时以下、进一步优选为5小时以下。可以利用将破碎悬浮液连续加热的方法来大幅缩短用于得到不溶体或不溶性颗粒的加热时间。将破碎悬浮液连续加热的情况下的温度没有特别限定，从高效地得到不溶体或不溶性颗粒的观点和菌体灭活的观点出发，根据目的重组蛋白的种类，加热温度例如为70℃以上、优选为80℃以上、进一步优选为90℃以上。另外，从抑制目的蛋白的分解、提高目的蛋白的纯度的观点出发，根据目的蛋白的种类，例如为140℃以下、优选为120℃以下、进一步优选为100℃以下。将破碎悬浮液连续加热的情况下的用于得到不溶体或不溶性颗粒的加热时间没有特别限定，从高效地得到不溶体或不溶性颗粒的观点和菌体灭活的观点出发，根据目的重组蛋白的种类，例如为1秒以上、优选为10秒以上、进一步优选为30秒以上。另外，从抑制目的蛋白的分解、提高作业效率的观点出发，根据目的蛋白的种类，例如为120秒以下、优选为90秒以下、进一步优选为60秒以下。将破碎悬浮液连续加热的方法没有特别限定，只要能够将不溶体或不溶性颗粒加热至70℃以上且140℃以下、并能够在120秒钟以内保持加热后的温度即可，可以列举使用液体连续杀菌装置等的方法，特别是可以列举液体连续杀菌装置miniuhtt-20(powerpointinternational公司制)。(b)的凝集步骤中，为了使凝集体成为大型，可以在加热的基础上进一步进行搅拌。搅拌的手段没有特别限定。搅拌速度没有特别限定，从高效地得到不溶性颗粒的观点出发，优选为溶液中的不溶体的凝集体不发生沉淀的速度，例如为70rpm以上、优选为150rpm以上、进一步优选为300rpm以上。另外，从抑制所形成的不溶体的破碎的观点出发，为1500rpm以下、优选为1000rpm以下、进一步优选为500rpm以下。关于搅拌时间，在(b)的凝集步骤之间的任意时间进行即可，在进行加热的情况下，优选与加热一起进行。(c)重组蛋白凝集体的分离步骤(c)步骤是将(b)步骤中得到的凝集体从悬浮液中分离的步骤。在选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上向破碎悬浮液中添加的同时开始重组蛋白不溶体的凝集，然后可以使用适当的分离手段、例如自然沉降、离心分离或过滤来分离凝集体。添加选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上后，进行加热，并根据需要进一步进行搅拌，由此，可促进凝集而使凝集体成为大型，更容易进行分离。在一例中，通过2500×g、5～30分钟的离心分离，能够回收凝集体。在重组蛋白在破碎悬浮液中形成原本就能够离心分离的不溶性颗粒的情况下，也可以添加选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上，进行加热并根据需要进行搅拌，由此使不溶体颗粒进一步变得巨大，从而使其自然沉降。对于难以通过离心分离进行分离的重组蛋白不溶体，也可以添加选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上，进行加热，根据需要通过搅拌使不溶体颗粒进一步变得巨大，并通过离心分离、过滤等进行分离。到目前为止，没有能够在不溶性颗粒的离心分离中以2500×g这样的低离心力使其沉降的报道，通常利用12000×g以上的高离心力的圆筒型离心分离机。但是，根据本发明，能够以更低的离心力使不溶性重组蛋白以凝集体的形式沉降，因此意味着能够将迄今为止只能用于菌体分离的韦斯伐里亚(westfalia)离心机、澄清器、阿法拉伐(alfalaval)离心机等分离板型(盘型)离心分离机和倾析器型离心分离机、以及例如篮型离心分离机用于不溶性重组蛋白的分离。这些分离板型和倾析器型离心分离机具有10000×g以下的离心力，能够连续地对大量的悬浮液进行分离处理，因此在工业生产上可成为极其有用的手段。另外，在未进行上述凝集步骤的情况下，即使是通过通常的离心分离能够容易地沉降的大型的不溶性颗粒，在膜过滤中发生堵塞的可能性也很高，但通过进行该凝集步骤，能够容易地进行膜分离。特别是在添加选自由金属盐、酸和阴离子型凝集剂组成的组中的一种以上后，进行加热，并根据需要进行搅拌，由此，能够更容易地进行膜分离。此外，仅通过分离操作，就能够将可与该重组蛋白不溶体分离的宿主细胞来源的杂质除去，能够提高重组蛋白的纯度。另外，若将分离出的重组蛋白不溶体再悬浮，再次进行凝集和分离步骤，则能够进一步提高纯度。通过(c)重组蛋白凝集体的分离步骤得到的重组蛋白凝集体的粒径可以利用例如电感应区法进行测定。从提高过滤性的观点出发，重组蛋白凝集体的粒径例如为4μm以上、优选为5μm以上、更优选为10μm以上、进一步优选为15μm以上。另外，凝集体的粒径的上限没有特别限定，可以为50μm以下，也可以为40μm以下，也可以为30μm以下，也可以为20μm以下。作为电感应区法，可以列举依据jisz8832的粒径分布测定方法，特别是可以列举使用粒径数分析装置cda-1000(sysmex株式会社)的测定方法。通过分离获得的重组蛋白凝集体例如可以利用日本特表2013-523665号公报中记载的方法等进一步纯化来提高纯度。实施例以下，基于实施例更具体地说明本发明。但是，本发明不限于以下的实施例。(1)目的蛋白表达株(重组细胞)的制作分别合成编码包含具有序列号1(prt410)、序列号2(prt853)、序列号3(prt647)、序列号4(prt699)和序列号5(prt698)所表示的氨基酸序列的蜘蛛丝来源的序列的丝心蛋白的核酸、gen495、gen971、gen740、gen797和gen796。该核酸中，在5’末端附加了ndei位点，在终止密码子下游附加了ecori位点。各蛋白质的亲水指数(hi)和分子量如表1所示。[表1]将这5种核酸分别克隆至克隆载体(puc118)中。然后，利用ndei和ecori对该核酸进行限制酶处理并切出后，重组到蛋白质表达载体pet-22b(+)中，得到表达载体。利用该5种表达载体分别转化大肠杆菌blr(de3)，得到表达目的蛋白的转化大肠杆菌(重组细胞)。(2)目的蛋白的表达将上述转化大肠杆菌在包含氨苄青霉素的2ml的lb培养基中培养15小时。将该培养液添加到包含氨苄青霉素的100ml的种子培养用培养基(表2)中，以使od600达到0.005。将培养液温度保持于30℃，进行烧瓶培养直至od600达到5为止(约15小时)，得到种子培养液。[表2]种子培养用培养基将该种子培养液添加到添加有500ml的生产培养基(表3)的发酵罐中，使od600达到0.05。将培养液温度保持于37℃，在ph6.9下控制恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％。[表3]生产培养基在生产培养基中的葡萄糖被完全消耗后，立即以1ml/分钟的速度添加补料液(葡萄糖455g/1l、酵母提取物120g/1l)。将培养液温度保持于37℃，在ph6.9下控制恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％，进行20小时培养。然后，向培养液中添加1m的异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)以使终浓度达到1mm，诱导表达目的蛋白。在添加iptg后经过20小时的时刻，离心分离培养液，回收菌体。使用由添加iptg前和添加iptg后的培养液制备的菌体进行sds-page，根据依赖于iptg添加的目的蛋白大小的条带的出现，确认到目的蛋白以不溶体的形式进行了表达。[实施例1金属盐的添加效果之一]在以不溶体的形式表达prt853(hi：-0.68)的大肠杆菌blr(de3)的ro水悬浮液中添加脱氧核糖核酸酶(dnase)(sigma-aldrich)1.8μg/g湿菌体和溶菌酶(thermofisherscientific)164μg/g湿菌体，使用高压匀浆器(gea、pandaplus)在室温下以600巴的压力处理4次，将菌体破碎。破碎后，使用离心分离机(tomymx-305)，以11000×g处理5分钟，获得不溶体。该不溶体是为了以该方式获得而需要花费相当长的时间进行离心分离的、比较小的不溶性颗粒。将该不溶性颗粒悬浮于水中后，以达到0.5m的方式添加表4所示的金属盐。图1是添加金属盐后以2680×g进行10秒钟离心分离时的各样品的照片。确认到：通过添加多价金属盐，能够通过以2680×g进行10秒钟离心分离而使不溶体沉降。[表4][实施例2金属盐的添加效果之二]对于在实施例1中凝集效果优良的金属盐(氯化镁、氯化钙、硫酸镁和硝酸镁)，使用prt853的不溶体确认了低浓度下的凝集效果(参考表5)。图2是添加金属盐后以2680×g进行10秒钟离心分离时的各样品的照片。任意一种金属盐在1mm时均确认到凝集效果，但在5mm以上时确认到显著的凝集效果。[表5][实施例3在hi不同的蛋白质中的效果]对疏水性度不同的蛋白质中的金属盐的添加效果进行了确认。利用与实施例1同样的方法对prt410(hi：-0.81)、prt647(hi：0.04)、prt699(hi：0.17)、prt698(hi：0.43)这4种不溶体进行了金属盐(氯化钙和氯化镁)的添加所带来的凝集效果的确认。在表达各不溶体的大肠杆菌blr(de3)的ro水悬浮液中添加脱氧核糖核酸酶1.8μg/g湿菌体和溶菌酶164μg/g湿菌体，使用高压匀浆器在室温下以600巴的压力处理4次，将菌体破碎。破碎后，在该破碎悬浮液中以达到10～150mm的方式添加氯化钙或氯化镁，以2680×g进行10秒钟离心分离，确认凝集的状况。图3是添加金属盐后以2680×g进行10秒钟离心分离时的各样品的照片。确认到：通过该离心分离操作，prt410、prt699的不溶体能够在不添加金属盐(氯化钙和氯化镁)的情况下发生沉淀，而通过添加即使为少量的金属盐，能够更密集地使其沉淀。另一方面，prt647、prt698若不添加金属盐则无法在该离心条件下发生沉淀，但通过添加金属盐，能够使其凝集、沉淀。特别是浓度越高，越能够更密集地凝集、沉淀(参考图3)。在疏水性度不同的蛋白质中确认到金属盐的添加效果，因此认为本金属盐添加方法能够应用于各种蛋白质的不溶体的凝集。[实施例4纯化纯度的提高]prt410、prt647、prt699、prt698这4种不溶体若进行11000×g、20℃的离心分离，则用5分钟能够使其沉降。将通过离心分离得到的该沉淀级分再次悬浮于ro水中，确认金属盐向该悬浮液(离心沉淀再悬浮液)中的添加效果。对于再悬浮于ro水中的不溶体，与实施例3同样地确认金属盐的添加效果。图4是添加金属盐后以2680×g进行10秒钟离心分离时的各样品的照片。如图4所示，与实施例3同样地确认到金属盐添加效果。另外，如下所示，通过该再悬浮，能够提高不溶体的纯度。图5和表6示出金属盐的添加和离心沉淀再悬浮操作所带来的提高不溶体纯度的结果。图5是示出利用sds-page对实施例3和实施例4中得到的prt410的各处理液进行分析的结果(电泳结果)的照片。图5的a和b中，在泳道1中施加利用高压匀浆器将菌体刚破碎后的prt410的悬浮液(破碎悬浮液)；在泳道2中施加向该破碎悬浮液中以达到10mm的方式添加氯化钙进行沉淀化后，以2500×g进行5分钟离心分离而得到的沉淀级分；在泳道3中施加向该破碎悬浮液中以达到10mm的方式添加氯化镁进行沉淀化后，以2500×g进行5分钟离心分离而得到的沉淀级分；在m泳道中施加分子量标志物蛋白质。图5a是在电泳后利用能够将全部蛋白染色的oriole(商标)荧光凝胶染色剂(bio-rad公司制)进行染色而得到的照片，图5b是在电泳后利用与prt410的his标签区域反应的invision(商标)带his标签的凝胶内染色试剂(thermofisherscientific公司制)进行染色而得到的照片。理论分子量为53.6kda的prt410在接近60kda的分子量标志物的位置作为条带被检出。使用geldoc(商标)ez凝胶成像仪(biorad公司制)，对oriole染色后的凝胶的电泳条带进行分析，算出各处理液中的prt410的纯化纯度。将结果示于表6(刚破碎后)。未添加金属盐而得到的沉淀级分的纯度为10.5％，而通过添加金属盐，能够使其密集地凝集、沉淀，因此，通过添加氯化钙能够使纯度提高至30.7％，通过添加氯化镁能够使纯度提高至34.1％(参考图5的泳道1～3、表6(刚破碎后))。另外，图5的a和b中，在泳道4中施加通过11000×g、20℃、5分钟的离心分离使破碎悬浮液(泳道1)沉降，将所得到的该沉淀级分再次悬浮于ro水中而得到的悬浮液(离心沉淀再悬浮液)；在泳道5中施加向该离心沉淀再悬浮液中以达到10mm的方式添加氯化钙，并通过2500×g、5分钟的低速离心进行离心分离而得到的沉淀级分；在泳道6中施加向该离心沉淀再悬浮液中以达到10mm的方式添加氯化镁，并通过2500×g、5分钟的低速离心进行离心分离而得到的沉淀级分。通过11000×g、20℃、5分钟的离心分离使利用高压匀浆器将菌体刚破碎后的悬浮液沉降，并将所得到的该沉淀级分再次悬浮于ro水中(离心沉淀再悬浮液)，由此能够使纯度从10.5％提高至34.8％(参考图5的泳道4、表6(离心沉淀再悬浮))，而通过向该离心沉淀再悬浮液中以达到10mm的方式添加氯化钙或氯化镁使不溶体凝集，能够以2500×g、5分钟的低速离心进行分离，并且所得到的沉淀级分的纯度分别提高至48.6％和50.1％(参考图5的泳道5和6、表6(离心沉淀再悬浮))，这样，通过添加金属盐能够显著提高纯度。可以确认，本金属盐添加方法不仅对不溶体的凝集极有效果，而且对于宿主细胞来源的杂质的除去也是有效的手段。[表6]另外，对于向prt410、prt647、prt699、prt698这4种不溶体的离心沉淀再悬浮液和破碎悬浮液中添加50mm的金属盐、凝集后以2680×g进行10秒钟离心分离而得到的沉淀级分，分别求出蛋白质的回收率。将结果示于表7。回收率如下算出：利用酶标仪(tecan、infinitef200)测定595nm的吸光度，将离心分离前的吸光度的数值设为0％、将11000×g处理10分钟后得到的上清的吸光度的数值设为100％而算出。[表7]由表7表明，通过添加金属盐，能够以极高的收率回收不溶体。可以确认，本金属盐添加方法为如下的优良方法：只要是不溶性的蛋白质则其种类没有限定，另外，无论不溶体的存在形态是否为密集的不溶体颗粒，对于不溶体的凝集以及宿主细胞来源的杂质的除去都是极其有效的手段，并且能够以极高的收率回收不溶体。[实施例5酸的添加效果之一]在以不溶体的形式表达prt853(hi：-0.68)的大肠杆菌blr(de3)的ro水悬浮液中添加脱氧核糖核酸酶(sigma-aldrich)1.8μg/g湿菌体和溶菌酶(thermofisherscientific)164μg/g湿菌体，使用高压匀浆器(gea、pandaplus)在室温下以600巴的压力处理4次，获得菌体的破碎悬浮液。在该破碎悬浮液中以达到10～100mm的方式添加(样品编号与酸的浓度的关系参考表8)乙酸、柠檬酸或硫酸，以2500×g进行30秒钟离心分离，确认不溶体的凝集的状况。图6是离心分离后的各样品的照片。在无酸添加的情况下(样品1)，无法以该低速离心分离条件沉降而获得不溶体，但通过添加酸，使用表8所示的任一浓度的酸均能够以该低速离心分离条件获得不溶体的凝集体(样品2～10)。对于再悬浮于ro水中后(离心沉淀再悬浮液)的不溶体中的酸的添加效果也进行了研究。即，将菌体的破碎悬浮液使用离心分离机(tomymx-305)以11000×g处理5分钟，获得不溶体。该不溶体是为了像这样若不添加酸则为了获得而需要花费相当的离心力和时间进行离心分离的、比较小的不溶性颗粒。将该不溶体悬浮于ro水中后(离心沉淀再悬浮液)，与上述同样地添加表8所示浓度的酸，以2500×g进行30秒钟离心分离，确认不溶体的凝集的状况。图7是离心分离后的各样品的照片。可以确认，在再悬浮于ro水中而得到的离心沉淀再悬浮液中，利用酸也能够有效地使其凝集。另外，通过再悬浮于ro水中，颗粒得到清洗，培养基和菌体来源成分等被除去，因此与未进行向ro水中的再悬浮的不溶体相比，能够获得外观上也很干净的不溶体。[表8][实施例6在hi不同的蛋白质中的酸的添加效果]对于疏水性度不同的prt410(hi：-0.81)、prt647(hi：0.04)、prt699(hi：0.17)、prt698(hi：0.43)这4种不溶体，利用与实施例5同样的方法添加5～30mm的柠檬酸，如下确认不溶体的凝集效果。在表达各不溶体的大肠杆菌blr(de3)的ro水悬浮液中添加脱氧核糖核酸酶1.8μg/g湿菌体和溶菌酶164μg/g湿菌体，使用高压匀浆器在室温下以600巴的压力处理4次，将菌体破碎。破碎后，在该破碎悬浮液中以达到5～30mm的方式添加柠檬酸，以2500×g进行30秒钟离心分离，确认凝集的状况。图8是离心分离后的各样品的照片。图8中，0、5、10、20和30分别表示添加柠檬酸的浓度(mm)(0mm为无柠檬酸添加)。h是对无柠檬酸添加悬浮液进行11000×g、5分钟离心分离而得到的样品。若不添加酸，则任意一种蛋白质的不溶体都必须在11000×g、5分钟的离心分离条件下才能获得，但通过添加10mm以上的柠檬酸，对于任意一种蛋白质，通过低速离心分离都能够获得不溶体。添加5mm的柠檬酸时也观察到凝集，但在30秒钟这样短的时间内沉降不完全(参考图8)。在疏水性度不同的蛋白质中确认到酸的添加效果，因此可以认为，本酸添加方法能够应用于各种蛋白质的不溶体的凝集。另外，对于添加10mm的柠檬酸并通过低速离心分离回收的prt410、prt647、prt699、prt698这4种沉淀级分，与实施例4同样分别求出蛋白质的回收率。将结果示于表9。[表9]由表9表明，对于任意一种蛋白质，通过酸添加，均能够无损失地回收不溶体。接着，利用sds-page对回收的prt410不溶体的纯度进行分析。图9是示出利用sds-page对prt410的各处理液进行分析的结果(电泳结果)的照片。图9中，在m泳道中施加分子量标志物蛋白质；在泳道1中施加无酸添加的破碎悬浮液；在泳道2中施加向破碎悬浮液中添加10mm的柠檬酸并回收的不溶体，使蛋白质浓度分别为1.5μg。电泳后的染色使用能够将全部蛋白质染色的orioletm荧光凝胶染色剂(bio-rad公司制)和与prt410的his标签区域反应的invisiontm带his标签的凝胶内染色试剂(thermofisherscientific公司制)这两种。理论分子量为53.6kda的prt410在接近60kda的分子量标志物的位置作为条带被检出。使用geldoc(商标)ez凝胶成像仪(biorad公司制)，对oriole染色后的凝胶的电泳条带进行分析，算出各处理液中的prt410的纯化纯度。将结果示于表10。[表10]无添加(％)10mm柠檬酸(％)11.623.7未添加酸而得到的沉淀级分的纯度为11.6％，而通过添加酸，能够使其密集地凝集、沉淀，因此能够使纯度提高至23.7％(参考图9)。可以确认，本酸添加方法不仅对不溶体的凝集极有效果，而且对于宿主细胞来源的杂质的除去也是有效的手段。可以确认，本酸添加方法为如下的优良方法：只要是不溶性的蛋白质则其种类没有限定，另外，无论不溶体的存在形态是否为密集的不溶体颗粒，对于不溶体的凝集以及宿主细胞来源的杂质的除去都是极其有效的手段，并且能够以极高的收率回收不溶体。[实施例7脂多糖(lps)除去效果]在作为宿主细胞使用的大肠杆菌中，存在革兰氏阴性菌特有的来源于细胞壁的被称为内毒素的lps。已知该内毒素过量存在时，具有发热、多器官衰竭、心动过速等作用，优选使其降低。对通过本发明的金属盐或酸添加而凝集的不溶体中的lps含量进行测定，确认lps的降低效果。未进行金属盐和酸添加的不溶体(1)利用下述方法获得。即，在表达prt853的大肠杆菌blr(de3)的ro水悬浮液中添加脱氧核糖核酸酶(sigma-aldrich)1.8μg/g湿菌体和溶菌酶(thermofisherscientific)164μg/g湿菌体，使用高压匀浆器(gea、pandaplus)在室温下以600巴的压力处理4次，将菌体破碎。破碎后，使用离心分离机(tomymx-305)，进行11000×g、20分钟的处理。将沉淀级分再次悬浮于ro水中，进行11000×g、30分钟的处理。进行2次该清洗操作。将所得到的沉淀级分再次悬浮于ro水中，进行11000×g、60分钟的处理，以沉淀级分的形式获得不溶体(1)。该不溶体(1)的获得在20℃下进行。通过金属盐添加而进行了凝集的不溶体(2)利用下述方法获得。即，至利用高压匀浆器处理4次、将菌体破碎为止，利用与上述同样的方法进行。破碎后，添加10mm的氯化钙，使不溶体凝集，以2500×g处理10分钟。将所得到的沉淀级分再次悬浮于ro水中，以2500×g处理10分钟。进行2次该清洗操作，以沉淀级分的形式获得通过金属盐添加而产生的不溶体(2)。通过酸添加而进行了凝集的不溶体(3)利用下述方法获得。即，代替金属盐的添加，添加10mm的柠檬酸，除此以外，利用与获得上述金属盐添加的不溶体(2)时相同的方法，获得通过酸添加而产生的不溶体(3)。利用下述方法测定这3种不溶体中的lps含量。(i)测定样品的制备称量上述3种不溶体样品约75mg(不溶体(1)75.5mg、不溶体(2)75.1mg、不溶体(3)75.0mg)，添加注射用蒸馏水(大塚制药工厂株式会社)以使其为50mg/ml，制备悬浮液。利用涡旋混合器进行搅拌后，确认ph，添加5n氢氧化钠水溶液(和光纯药工业株式会社)而调节为中性。该不溶体样品使用加热器，在90下进行20分钟加热处理。散热后，进行10000rpm、10分钟的离心分离，回收上清，作为测定原液。(ii)lps含量的测定使用limuluses-ilsingletestwako(和光纯药工业株式会社)，按照附带的说明资料，使用内毒素检测仪toxinometer(et-6000/j、和光纯药工业株式会社)进行比浊时间分析。测定中使用试剂盒所附带的cse(e.coliukt-b)作为内毒素标准品。对于各样本，首先将测定原液稀释1000后进行测定。不溶体(1)和不溶体(2)经1000倍稀释得到了测定值，但不溶体(3)为检测限以下(＜0.01eu/ml)，因此改变稀释倍率，以10倍稀释能够得到测定值。将结果示于表11。[表11]样品lps含量(μg/g)不溶体(1)3.10不溶体(2)1.19不溶体(3)0.008在添加金属盐或酸而使其进行了凝集的不溶体(2)和(3)中，与未添加这些物质而获得的不溶体(1)相比，确认到lps含量得到了降低。特别是在利用酸进行凝集而获得的不溶体(3)中，lps含量为极低浓度。添加金属盐或酸使不溶体凝集而获得不溶体的方法是也能够降低lps含量的优良方法。[实施例8基于阴离子型凝集剂的凝集效果]在以不溶性颗粒形式表达prt853(hi：-0.68)的大肠杆菌blr(de3)的ro水悬浮液中添加脱氧核糖核酸酶1.8μg/g湿菌体和溶菌酶164μg/g湿菌体，使用高压匀浆器在室温下以600巴的压力处理4次，将菌体破碎，得到破碎悬浮液。破碎后，在该破碎悬浮液中以达到0.05％的方式添加表12所示的凝集剂，通过静置或离心分离(2680×g、10秒钟)确认该不溶性颗粒的沉降状况。将结果示于图10。只有阴离子型聚丙烯酸盐类凝集剂(クリファー厶pa-896)能够在静置和离心分离的任意一种情况下均使不溶性颗粒有效地沉降。[表12]no.凝集剂1クリファー厶pa-896(阴离子型凝集剂)2クリファー厶pn-901(非离子型凝集剂)3クリファームpc-601(阳离子型凝集剂)4クリファー厶pg-668(阳离子型凝集剂)5クリファー厶pc-696(阳离子型凝集剂)6クリファー厶pc-702(阳离子型凝集剂)7クリファー厶pc-797(阳离子型凝集剂)8クリフユーチヤーpf-512(两性凝集剂)9クリフユーチヤーpfー833(两性凝集剂)10プレスエィド111(阳离子型凝集剂)[实施例9基于阴离子型凝集剂的纯度提高效果]对于在实施例8中确认到凝集效果的阴离子型凝集剂クリファー厶pa-896，确认其向菌体的破碎悬浮液和离心沉淀再悬浮液中的添加效果。该离心沉淀再悬浮液是将破碎悬浮液在20℃下以11000×g离心分离5分钟，将所得到的沉淀级分再次悬浮于ro水中而得到的悬浮液。菌体的破碎悬浮液除了使用以不溶性颗粒形式表达prt410(hi：-0.81)的大肠杆菌blr(de3)以外利用与实施例8同样的方法得到。添加凝集剂后，以2500×g离心分离5分钟，利用sds-page对所得到的沉淀级分中的不溶体的纯度进行分析。将结果示于图11。图11中，在泳道1中施加利用高压匀浆器将菌体刚破碎后的prt410的悬浮液(破碎悬浮液)；在泳道2中施加向该破碎悬浮液中以达到0.01％的方式添加クリファー厶pa-896进行沉淀化后，以2500×g离心分离5分钟而得到的沉淀级分；在泳道3中施加通过11000×g、20℃、5分钟的离心分离使破碎悬浮液(泳道1)沉降，将所得到的沉淀级分再次悬浮于ro水中而成的悬浮液(离心沉淀再悬浮液)；在泳道4中施加向该离心沉淀再悬浮液中以达到0.01％的方式添加クリファー厶pa-896，并以2500×g、5分钟的低速离心进行离心分离而得到的沉淀级分。电泳后的染色使用能够将全部蛋白质染色的orioletm荧光凝胶染色剂(bio-rad公司制)和与prt410的his标签区域反应的invisiontm带his标签的凝胶内染色试剂(thermofisherscientific公司制)这两种。理论分子量为53.6kda的prt410在接近60kda的分子量标志物的位置作为条带被检出。在破碎悬浮液中以达到0.01％的方式添加クリファームpa-896，使不溶体凝集，由此能够通过2500×g、5分钟的低速离心进行分离，所得到的沉淀级分的纯度从12.2％提高至53.5％(参考图11的泳道1和2、表13(刚破碎后))。通过11000×g、20℃、5分钟的离心分离使利用高压匀浆器将菌体刚破碎后的悬浮液沉降，将所得到的该沉淀级分再次悬浮于ro水中(离心沉淀再悬浮液)，由此沉淀级分的纯度能够从12.2％提高至36.3％(参考图11的泳道1和3、表13(离心沉淀再悬浮))，进一步，在该离心沉淀再悬浮液中以达到0.01％的方式添加クリファームpa-896，使不溶体凝集，由此能够通过2500×g、5分钟的低速离心进行分离，所得到的沉淀级分的纯度从36.3％进一步提高至51.8％(参考图11的泳道3和4、表13(离心沉淀再悬浮))。这样，通过阴离子型凝集剂添加能够显著提高纯度。[表13][实施例10通过酸添加、加热和搅拌产生的效果]使用prt410的不溶体来确认通过加热产生的凝集效果。在表达prt410的大肠杆菌blr(de3)的ro水悬浮液中添加脱氧核糖核酸酶1.8μg/g湿菌体和溶菌酶164μg/g湿菌体，使用高压匀浆器在室温下以600巴的压力处理4次，将菌体破碎。破碎后，以2500×g离心分离10分钟，弃去上清液，调节至2.5倍浓缩，然后将浓缩液用ro水稀释2.5倍。在该破碎悬浮液以达到20mm的方式添加柠檬酸，然后根据需要进行加热和搅拌，得到凝集体。利用表14中记载的条件对各样品进行处理。加热使用温浴槽，加热时间为从温浴槽达到80℃的时刻起的维持时间。搅拌以200rpm进行。对于所得到的凝集体，使用粒径数分析装置cda-1000(sysmex株式会社)，测定粒子浓度和中值粒径。结果示于表14。另外，图12示出中值粒径的频率分布和累积分布。既未添加酸也未进行搅拌的样品x、未添加酸而仅进行了加热的样品1、以及未添加酸而进行了加热、搅拌的样品2几乎未确认到凝集效果。另一方面，未进行加热/搅拌而仅添加了酸的样品3与样品x、1和2相比，确认到粒径的增大。此外，在80℃下加热2小时的样品7与样品3相比，确认到粒径的进一步增大。对于加热时间不同、并进一步进行了搅拌的样品4～6，通过进行搅拌，进一步确认到粒径的增大效果。凝集虽然依赖于处理时间，但至少从0.5小时起可确认到效果。该倾向由图12得到证明。粒度分布的峰越尖锐，则过滤性越提高，因此，由图12确认到，通过添加酸并进行加热、搅拌，过滤性提高。[表14][实施例11基于酸的种类的过滤性提高效果]使用prt410的不溶体来确认通过酸的添加而产生的过滤性的提高效果。确认了通过添加酸能够进行过滤，因此，对于柠檬酸、盐酸、硫酸这3种酸进行了基于酸的种类的过滤性提高效果的比较。关于实验方法，除了酸不同以外，与实施例10相同。在80℃下进行2小时酸处理，并进行加热、搅拌，将最大过滤量、以及过滤时间与渗透通量的关系的相关结果的一例示于表15和表16。比较的结果是，柠檬酸的最大过滤量最大，渗透通量稳定，因此确认在工业上柠檬酸是优良的。[表15]过滤面积(cm2)最大过滤量(m3/m2)无添加45.3无法过滤柠檬酸45.30.276盐酸45.30.100硫酸45.30.092[表16][实施例12通过加热产生的蛋白质纯度提高效果]利用sds-page对加热后的prt799(序列号11、200kda)和prt587(序列号12、100kda)的不溶体的纯度进行分析。图13和图14是示出利用sds-page对prt799和prt587的各处理液进行分析的结果(电泳结果)的照片。对于各处理液，添加柠檬酸，将ph调节至3.75。图13中，在泳道1中施加进行了80℃、3小时加热的破碎悬浮液；在泳道2中施加未进行加热的破碎悬浮液。关于泳道1的破碎悬浮液，确认到通过加热使杂蛋白被分解。在图14的泳道1中施加未进行加热的破碎悬浮液，在泳道2中施加进行了80℃、2小时加热的破碎悬浮液。确认到40kda的分子量标志物附近的条带被分解，与未进行加热的泳道1的条带相比，在泳道2的100kda的分子量标志物附近检出的条带(目的蛋白)的检测强度以1.2倍被检出，因此确认到，通过加热，目的蛋白的纯度提高。[实施例13通过连续加热产生的效果]使用prt799的不溶体来确认通过连续加热产生的凝集效果。在表达prt799的大肠杆菌blr(de3)的ro水悬浮液中添加脱氧核糖核酸酶1.8μg/g湿菌体、溶菌酶164μg/g湿菌体，使用高压匀浆器在室温下以600巴的压力处理4次，将菌体破碎。破碎后，使用离心分离机(tomymx-305)，以2500×g离心分离10分钟，弃去上清液，调节至2.5倍浓缩后，将浓缩液用ro水稀释2.5倍。在该破碎悬浮液中以达到20mm的方式添加柠檬酸，然后进行加热，得到凝集体。各样品利用表17中记载的条件进行处理。加热使用液体连续杀菌装置miniuhtt-20(powerpointinternational公司制)，加热温度为80℃、85℃、90℃或95℃，该破碎悬浮液的加热时间以30秒或60秒进行。对于所得到的凝集体，使用粒径数分析装置cda-1000(sysmex株式会社)，测定粒子浓度和中值粒径。结果示于表17。另外，图14和图15示出中值粒径的频率分布和累积分布。[表17]根据表17的结果，将通过使用温浴槽以加热温度80℃、加热时间2小时的条件进行加热而得到的样品x的凝集体与使用液体连续杀菌装置miniuhtt-20(powerpointinternational公司制)以加热温度为80℃、85℃、90℃或95℃、加热时间为30秒或60秒的条件得到的样品1、2、3、4、5、6、7或8的凝集体进行比较时，使用液体连续杀菌装置miniuhtt-20(powerpointinternational公司制)得到的凝集体的粒径与利用温浴槽进行加热而得到的凝集体的粒径相比为同等以上。由图15和图16也可以确认，通过以高温、短时间对该破碎悬浮液进行加热，能够高效地使凝集体变得巨大。[实施例14通过连续加热产生的过滤性提高效果]样品x、5、6、7和8的过滤面积和最大过滤量的结果示于表18。根据表18，使用液体连续杀菌装置以高温、短时间进行加热的情况下的过滤性与使用温浴槽加热2小时的情况为同等程度或同等程度以上，确认到通过将该破碎悬浮液的加热设定为高温、短时间，过滤性提高。[表18]no.ph处理温度(℃)处理时间过滤面积(cm2)最大过滤量(m3/m2)x3.75802小时45.30.07853.759030秒45.30.09963.759060秒45.30.10173.759530秒45.30.10383.759560秒4530.099序列表<110>丝芭博株式会社（spiberinc.）小岛冲压工业株式会社（kojimaindustriescorporation）<120>不溶性重组蛋白凝集体的制造方法（amethodformanufacturinganaggregateofaninsolublerecombinantprotein）<130>16ps008wo1<150>jp2016-157912<151>2016-08-10<150>jp2016-229227<151>2016-11-25<150>jp2017-048702<151>2017-03-14<150>jp2017-094144<151>2017-05-10<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>601<212>prt<213>人工序列<220><223>prt410<400>1methishishishishishisserserglyserserglyproglygln151015glnglyprotyrglyproglyalaseralaalaalaalaalaglygln202530asnglyproglyserglyglnglnglyproglyglnserglyglntyr354045glyproglyglnglnglyproglyglnglnglyproglyserserala505560alaalaalaalaglyproglyglntyrglyproglyglnglnglypro65707580seralaseralaalaalaalaalaglyprogly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