用于在悬浮下培养多能性干细胞的培养基的制作方法

在本发明的一些实施例中，涉及多种特定的培养基，更具体地但不限定于涉及多种使用所述多种特定的培养基在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中培养多能性干细胞的方法。多个人类多能性干细胞(hpscs)、诱导性多能性干细胞(ipscs)或胚胎干细胞(胚胎干细胞)两者，过去是常规地使用所述多个用于多个小鼠胚胎干细胞(即补充有胎牛血清(fbs))的一培养基及由多个灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)组成的多个饲养层来培养及衍生的多个常规方法[thomson等人，1998]。近年来，对于改善用于hescs所述多个培养系统的广泛研究取得了五项主要的进展：(1)在多个无血清条件下培养多细胞的能力[amit等人，2000]；(2)以100％的mef条件培养基在matrigeltm基质上将多个细胞维持在一未分化状态[xu等人，2001]；(3)在不添加mef条件培养基的情况下，在使用多个选定的生长因子的同时，在多个无饲养层的条件下延长hescs的培养[amit等人，2004；xu等人，2005；xu等人，2005b]；(4)使用多个人类胚胎成纤维细胞、成体输卵管上皮[richards等人，2002]或包皮成纤维细胞[amit等人，2003；hovatta等人，2004]作为多个饲养层；(5)在多个悬浮培养物中培养所述多个细胞(amit等人，2010，2011)。多个先前研究提供了不含所述饲养层的多个培养系统，不包括使用条件培养基，第一种是基于matrigeltm基质及补充有血清替代物及40纳克/毫升(ng/ml)的碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)的培养基[xu等人，2005b]。作者报道了当使用所述培养方法时具有28％的背景分化及当在所述培养基中加入75ng/ml的flt-3配体时具有20％的分化。第二种是基于matrigeltm基质及补充有40ng/ml的bfgf及0.5微克/毫升(μg/ml)的noggin的培养基[xu等人，2005]。在所述培养系统中，所述10％的背景分化等同于通过以matrigel及mef条件培养基培养所述多个细胞所达到的差异。amit及其同事提出的第三种系统是基于纤连蛋白作为基质、补充有20％血清替代物的培养基、0.12ng/ml的转化生长因子β1(tgβ1)及4ng/ml的bfgf[amit等人，2004]。发现所有三种方法都支持hescs的连续培养，同时维持hesc特征超过32次继代。在一些培养方法中，多个psc可以在没有饲养层的情况下连续培养，条件是对所述培养基补充各种因子的混合物，例如：flt3(xu等人，2005)及各种抑制剂(gafnio.等人，2013，《自然》，504：282至6，电子书(epub)2013年10月30日)。最近的几项研究讨论几种细胞内转导途径可能参与hpsc的更新及维持“干细胞特性(stemness)”身份，但强调hesc的自我维持的机制尚未揭示。佐藤及同事提供的第一条建议途径为wnt途径(saton.等人，2004)。“通过一药理性gsk-3特异性抑制剂激活wnt信号传导维持人及小鼠胚胎干细胞的多能性”；《自然医学》10：55至63)。在他们的研究中，将hesc与matrigel基质及补充有6-溴靛玉红-3'-肟(bio)的培养基一起培养7天。在所述多个条件下培养的多个hesc不仅维持多个hesc特性，而且还证明了wnt信号传导途径的调升，表明所述途径参与hesc的自我更新。同一组的一后续出版物表明tgfβ途径在细胞命运测定中起一关键的作用，并且在维持hesc的多个特征上与所述wnt信号传导途径维持多个互相连接[daylon等人，2005]。所述多个结果与amit及其同事提出的所述无饲养层的培养方法一致，所述方法是基于在所述培养基中添加tgfβ[amit等人，2004]。然而，虽然所述多个二维(2-d)培养系统可用于多个psc的小规模生产，但它们在形成多个psc的大规模生产上的能力有限。此外，虽然所有已知的培养条件都需要bfgf以将psc维持在一多能性状态中，但所述因子对于大规模生产psc是一种昂贵添加剂。其他
背景技术：
：包括wo2015/009146；wo2015051122a2；kakugawas.等人，2015年(“notum去乙酸化wnts来抑制信号传导活动”，《自然》，519：187至192)。技术实现要素：根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种特定的培养基，所述培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂，其中所述培养基能够使多个人类多能性干细胞当被培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中时维持在一多能性状态。根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种特定的培养基，所述特定的培养基包括：一gsk3β抑制剂；以及至少一个试剂，选自于由一蛋白酶抑制剂及一wnt3a多肽所组成的群组，其中所述培养基能够使多个人类多能性干细胞当被培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中时维持在一多能性状态。根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种特定的培养基，所述特定的培养基包括一wnt3a多肽及所述wnt3a多肽的稳定剂，前提条件为所述稳定剂不是一脂质囊泡，其中所述培养基能够使多个人类多能性干细胞当被培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中时维持在一多能性状态。根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种特定的培养基，所述特定的培养基包括一gsk3β抑制剂，前提条件为所述培养基不含有一erk1/2抑制剂，其中所述培养基能够使多个人类多能性干细胞当被培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中时维持在一多能性状态。根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种细胞培养物，包括多个细胞及如权利要求1至30任一项所述的特定的培养基。根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种将多个人类多能性干细胞培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中的方法，所述方法包括在权利要求1至30任一项所述的特定的培养基中培养所述多个多能性干细胞，从而使所述多个多能性干细胞培养在所述悬浮培养物中。根据本发明的一些实施例，所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟(pmsf)。根据本发明的一些实施例，所述蛋白酶抑制剂为甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)。根据本发明的一些实施例，所述培养基中的所述tlck的一浓度介于20至80微摩尔浓度/毫升。根据本发明的一些实施例，所述培养基中的所述tlck以一浓度介于40至60微摩尔浓度/毫升。根据本发明的一些实施例，所述培养基中的所述tlck以一浓度为约50微摩尔浓度。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基还包括一gsk3β抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基还包括一wnt3a多肽。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基还包括一wnt3a的稳定剂，前提条件为所述稳定剂不是一脂质囊泡。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基，前提条件为所述培养基不包含超过0.009微摩尔浓度(μm)的erk1/2抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基不含有一erk1/2抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述gsk3β抑制剂为chir99021。根据本发明的一些实施例，所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟(pmsf)。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基还包括所述wnt3a的一稳定剂，前提条件为所述稳定剂不是一脂质囊泡。根据本发明的一些实施例，所述chir99021以至少1微摩尔浓度的一浓度提供。根据本发明的一些实施例，所述chir99021以2至5微摩尔浓度/毫升的一浓度范围提供。根据本发明的一些实施例，所述稳定剂是选自于由一gsk3β抑制剂及苯甲基磺酰氟(pmsf)所组成的群组。根据本发明的一些实施例，所述wnt3a多肽以至少1纳克/毫升的一浓度提供。根据本发明的一些实施例，所述wnt3a多肽以在约5至15纳克/毫升的范围内的一浓度提供。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的特定的培养基，前提条件为所述培养基不包含超过0.009微摩尔浓度(μm)的erk1/2抑制剂。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的特定的培养基不含有一erk1/2抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述稳定剂为gsk3β抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述稳定剂为苯甲基磺酰氟(pmsf)。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基还包括白血病抑制因子(lif)。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基还包括所述il6ril6嵌合蛋白。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基不含有jnk抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基不含有p38抑制剂。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基是无血清的。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基不包含超过1纳克/毫升的成纤维细胞生长因子(bfgf)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的特定的培养基不含有成纤维细胞生长因子(bfgf)。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基能够使多个多能性干细胞当被培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中时维持在一多能性状态至少5次继代。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基能够使多个多能性干细胞当被培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中时维持在一多能性状态。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基能够使多个多能性干细胞当被培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中间维持在一未分化且多能性的状态至少5次继代。根据本发明的一些实施例，所述多个多能性干细胞为多个诱导性多能性干细胞。根据本发明的一些实施例，所述多个多能性干细胞为多个胚胎干细胞。根据本发明的一些实施例，所述多个多能性干细胞为多个人类多能性干细胞。根据本发明的一些实施例，所述培养基能够使多个多能性干细胞当被培养在不具有基质粘浮性的一悬浮培养物中时维持在一未分化且一多能性状态至少5次继代。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的方法，所述方法是用于当将所述多个多能性干细胞维持在一增殖性、多能性及未分化状态时扩增所述多个多能性干细胞。除非另加说明，否则本说明书所使用的所有技术术语和/或科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。虽然本发明的实施方式可以通过类似或等同于本发明的实施方式所述的任何方法和材料实施或测试，本发明的实施方式、列举的方法和/或材料已在下面描述。在冲突的情况下，将以本专利说明书并且包括定义为准。此外，材料、方法和实施方式仅是举例性质，并且不必然用以限制。附图说明本发明的一些实施例在此仅通过举例的方式并参考多个附图来描述，通过详细说明附图具体的参考资料，应当强调所示的细节仅为举例，用以说明本发明实施例的目的。基于这点，结合所述附图及描述使得本领域技术人员能清楚的实施本发明的实施例。在附图中：图1a至1c描绘了培养在所述yfl3(对照组；图1a)、chir(chir99021；图1b)及wnt(wnt3a；图1c)培养基中至少继代15次后的多能性干细胞的ssea4标记的流式细胞仪(facs)分析。流式细胞术分析是针对悬浮培养的多个hpsc表达的特异性多能性标志物ssea4，同时使用所述测试的培养基进行15至25继代；图2a至2l是在yfl3(对照组；图2a至2c)、chir(chir99021；图2d至f)、wnt(wnt3a；图2g至2i)及mwnt(小鼠wnt)(图2j至l)培养基中至少继代15次后进行针对ssea4的免疫染色分析的多个图像。以所述测试的培养基培养至少15代的多个hpsc所表达的所述多能性标记ssea4(以cy5标记)的免疫荧光分析。显示出由dapi染色的所述多个细胞核(图2a、2d、2g及2j)，由cy5标记的ssea4(图2b、2e、2h及2k)及多个合并的图像(图2c、2f、2i及2l)。图3a至3l是在所述yfl3(对照组；图3a至3c)、chir(chir99021；图3d至3f)、wnt(wnt3a；图3g至3i)及mwnt(wnt3β，图3j至3l)培养基中至少继代15次后进行的针对oct4的免疫染色的多个图像。用测试培养基培养至少15代的多个hpsc表达的所述多能性标记物oct4(以cy5标记)的免疫荧光分析。显示出由dapi染色的所述多个细胞核(图3a、3d、3g及3j)、由cy5标记的所述oct4(图3b、3e、3h及3k)及多个合并的图像(图3c、3f、3i及3l)。图4a至4l是在所述yfl3(对照组；图4a至4c)、chir(chir99021；图4d至4f)、wnt(wnt3a；图4g至4i)及mwnt(图4j至4l)培养基中至少继代15次后进行针对nanog的免疫染色的多个图像。免疫荧光分析是针对使用了所述测试的培养基培养至少15代的多个hpsc所表达的所述多能性标志物nanog(以cy5标记)。显示出dapi染色的所述多个细胞核(图4a、4d、4g及4j)、由cy5标记的nanog(图4b、4e、4h及4k)及合并的图像(图4c、4f、4i及4l)。图5a至5l是在所述yfl3(对照组；图5a至5c)、chir(chir99021；图5d至5f)、wnt(图5g至5i)及mwnt(图5j至5l)培养基中至少15次继代后进行针对tra-1-60的免疫染色的多个图像。免疫荧光分析是针对使用了所述测试的培养基培养至少15代的多个hpsc所表达的所述多能性标记tra-1-60(以cy5标记)。显示出由dapi染色的所述多个细胞核(图5a、5d、5g及5j)、cy5标记的tra-1-60(图5b、5e、5h及5k)及多个合并的图像(图5c、5f、5i及5l)。图6a至6l是在所述yfl3(对照组；图6a至6c)、chir(chir99021；图6d至6f)、wnt(wnt3a；图6g至6i)及mwnt(图6j至6l)培养基中至少继代15次后进行的针对tra-1-81的免疫染色的多个图像。免疫荧光分析是针对使用了所述测试的培养基培养至少15代的多个hpsc所述表达的多能性标记tra-1-81(用cy5标记)的免疫荧光分析。显示出由dapi染色的所述多个细胞核(图6a、6d、6g及6j)、cy5的tra-1-81标记(图6b、6e、6h及6k)及多个合并的图像(图6c、6f、6i及6l)。图7a至7d描绘了使用新的培养基(图7a至7c)及对照培养基(图7d)的一悬浮培养物中培养的多个psc的聚集体。应当注意，所述多个细胞维持与在所述对照培养基中悬浮培养的所述多个psc相似的聚集体形态。图7a：没有lif的培养基pmsf；图7b：pmsf及chir(chir99021)培养基；图7c：pmsf及wnt3a培养基。尺寸尺：所有平面中皆为50微米(μm)。图8a至8i是在yfl3(对照组；图8a至8c)、chir(chir99021；图8d至8f)及wnt(wnt3a；图8g至8i)培养基中至少继代40次后进行针对ssea4的免疫染色的多个图像。免疫荧光分析是针对使用了所述测试培养基培养至少40代的多个hpsc所表达的所述多能性标记ssea4(以cy5标记)。显示出由dapi染色的所述多个细胞核(图8a、8d及8g)、由cy5标记的ssea4(图8b、8e及8h)及多个合并的图像(图8c、8f及8i)。图9a至9i是在yfl3(对照组；图9a至9c)、chir(chir99021；图9d至9f)及wnt(wnt3a；图9g至9i)培养基中至少继代40次后进行针对nanog的免疫染色的多个图像。免疫荧光分析是针对使用了所述测试培养基培养至少40代的多个hpsc表达的所述多能性标志物nanog(以cy5标记)。显示出由dapi染色的所述多个细胞核(图9a、9d及9g)、由cy5标记的nanog(图9b、9e及9h)及多个合并的图像(图9c、9f及9i)。图10a至10i是在yfl3(对照组；图10a至10c)、chir(chir99021；图10d至10f)及wnt(wnt3a；图10g至10i)培养基中至少继代40次后进行针对tra-1-60的免疫染色的多个图像。免疫荧光分析是针对使用了所述测试培养基培养至少40代的多个hpsc表达的所述多能性标志物tra-1-60(以cy5标记)。显示出由dapi染色的所述多个细胞核(图10a、10d及10g)、由cy5标记的tra-1-60(图10b、10e及10h)及多个合并的图像(图10c、10f及10i)。图11a至11i是在yfl3(对照组；图11a至11c)、chir(chir99021；图11d至11f)及wnt(wnt3a；图11g至11i)培养基中至少继代40次后进行针对tra-1-81的免疫染色的多个图像。免疫荧光分析是针对使用了所述测试培养基培养至少40代的多个hpsc表达的所述多能性标志物tra-1-81(以cy5标记)。显示出由dapi染色的所述多个细胞核(图11a、11d及11g)、由cy5标记的tra-1-81(图11b、11e及11h)及多个合并的图像(图11c、11f及11i)。图12a至12i是在yfl3(对照组；图12a至12c)、chir(chir99021；图12d至12f)及wnt(wnt3a；图12g至12i)培养基中至少继代40次后进行针对oct4的免疫染色的多个图像。免疫荧光分析是针对使用了所述测试培养基培养至少40代的多个hpsc表达的所述多能性标志物oct4(以cy5标记)。显示出由dapi染色的所述多个细胞核(图12a、12d及12g)、由cy5标记的oct4(图12b、12e及12h)及多个合并的图像(图12c、12f及12i)。图13a至13c描绘了在所述培养基中培养了至少15次继代(图13b)或至少40次继代(图13a)及44至48代(图13c)的多个多能性干细胞的多个生长曲线。将多个psc铺板并培养14天，接种浓度为每毫升1.5×105个细胞，每两天计算一次多个活细胞的数量。图14描绘了nanog、oct4(pou5f1)及sox2的实时聚合酶连锁反应(rt-pcr)分析的多个结果。使用实时的聚合酶连锁反应(pcr)分析来来确定在使用测试培养基的同时培养至少40代的细胞中的所述多个基因oct4(pou5f1)、nanog及sox2的所述多个表达水平，在所述测试的培养基及对照组(yfl3)之间未发现显著的差异。图15a至15g描绘了使用所述指定的培养基在悬浮液中培养38至42次继代后，在多个psc中的所述特异性多能性标志物ssea4的facs分析的多个结果。图15a：yfl3；图15b：pmsf；图15c：没有lif的pmsf；图15d：pmsf+wnt(wnt3a)；图15e：没有lif的pmsf+wnt(wnt3a)；图15f：pmsf+chir(chir99021)；及图15g：没有lif的pmsf+chir(chir99021)。图16a至16l描绘了使用所述测试的培养基在悬浮液中培养的多个hpsc所表达的多个多能性标志物tral-81及oct4的免疫荧光分析。图16a至16d：在所述yfl3培养基中悬浮培养165次继代的多个细胞；图16e至16h：pmsf培养基中悬浮培养53次继代的多个细胞；图16i至16l：不含有lif的pmsf中悬浮培养50次继代的多个细胞。显示出由dapi染色的多个细胞核(图16a、16e及16i)、tra-1-81染色(“tra81”；图16b、16f及16j)、oct4染色(图16c、16g及16k)，以及oct4(绿色)与tra-1-81(“tra81”；红色)的多个合并图像(图16d、16h及16l)。图17a至17l描绘了使用所述测试的培养基在悬浮液中培养的多个hpsc所表达的多个多能性标志物tral-81及oct4的免疫荧光分析。图17a至17d：在所述rmsf+wnt(wnt3a)培养基中悬浮培养53次继代的多个细胞；图17e至17h：pmsf培养基中悬浮培养53次继代的多个细胞；图17i至17l：不含有lif的pmsf中悬浮培养50次继代的多个细胞。显示出由dapi染色的多个细胞核(图17a、17e及17i)、tra-1-81染色(“tra81”；图17b、17f及17j)、oct4染色(图17c、17g及17k)，以及oct4(绿色)与tra-1-81(“tra81”；红色)的多个合并图像(图17d、17h及17l)。图18a至18g描绘了来自多个psc类胚胎体(eb)形成的多个图像，在以下多个培养基中生长至少40代。在每一图示中，顶部图像(标记为“1”)与多个第2天的eb相关，而底部图像(标记为“2”)与多个第6天eb相关。图18a：yfl3培养基；图18b：pmsf培养基。图18c：没有lif培养基的pmsf；图18d：pmsf+wnt(wnt3a)培养基；图18e：没有lif培养基的pmsf+wnt(wnt3a)；图18f：pmsf+chir(chir99021)培养基；及图18g：pmsf+chir(chir99021)，不含lif培养基。图19a至19d是描绘在人类包皮成纤维细胞(hff)及补充有所述wnt3a及所述il6ril6嵌合蛋白的一培养基上在一个二维培养系统上培养19个继代的人类多能性干细胞的多个图像。对于所述多个多能性标记物oct4(图19a)及ssea4(图19c)对所述多个细胞进行免疫染色，并进一步与dapi染色的多个细胞核进行复染(图19b及19d)。图20a至20d是描绘在人类包皮成纤维细胞(hff)及补充有wnt3a及il6ril6嵌合蛋白的培养基上在二维培养系统上培养19个继代的人类多能性干细胞的图像。对多能标记tra-1-60(图20a)及tra-1-81(图20c)对细胞进行免疫染色，并进一步用dapi的细胞核染色进行复染(图20b及20d)。图21a至21c是描绘在多个人类包皮成纤维细胞(hff)及补充有所述wnt3a及所述il6ril6嵌合蛋白的一培养基上在一个二维培养系统上培养19个继代的人类多能性干细胞的细胞形态的多个图像。图22是所述苯甲基磺酰氟(pmsf)化学结构的一示意图。图23a至23b描绘了在一静态三维(3d)悬浮培养中在tlck培养基(不含bfgf)中培养的多个未分化的hesc。多个未分化的hesc(sus160、te03)在补充有tlck(无bfgf)的培养基的静态3d培养板中培养6次继代。图23a-6次继代后的所述多个细胞的形态。图23b-代表性facs分析显示>92％的细胞共表达oct4及ssea4，>95％的所述多个细胞对ssea4呈阳性。图24a至24b描绘了在一静态3d悬浮培养物中将多个未分化的hesc培养在tlck培养基(不含bfgf)中。在多个静态3d培养板中将多个未分化的hesc(sus175、te03)培养在具有多个补充有tlck(无bfgf)的多个培养基中6个继代。图24a-6次继代后的所述多个细胞的形态学，图24b-代表性的facs分析显示>83％的所述多个细胞中共同表达oct4及ssea4，>92％的所述多个细胞对ssea4呈阳性。图25描绘了在一动态3d培养系统中将多个未分化的hesc培养在补充有小分子(pmsf)的本发明的一些实施例的多个培养基中，显示出在补充有pmsf的多个培养基中在旋转瓶中作为聚集体(maxellstm)培养5周(5次继代)的多个未分化hesc(sus160，株i3；te03)的多个代表性facs分析。应当注意，>95％的所述多个细胞共同表达oct4及ssea4，>98％的所述多个细胞表达ssea4。图26描绘了在一动态3d培养系统中培养的多个hesc的facs表征。显示出在补充有wnt3a及lif的多个培养基中在旋转瓶中作为聚集体(maxellstm)培养4周(4次继代)的多个未分化hesc(sus175，株i3；te03)的多个代表性facs分析。应当注意，>86％的所述多个细胞共同表达oct4及ssea4，>97％的所述多个细胞表达ssea4。图27a至27c-描绘了在多个板体上的多个3d静态培养条件下在补充有pmsf的培养基中培养的多个psc的分化潜能。将多个te03细胞作为聚集体(maxellstm)培养在补充有pmsf或pmsf+wnt(wnt3a)+chir(chir99021)的培养基中，并且在所述悬浮3d培养物中继代35至37次后，使所述多个细胞自发地分化成多个胚状体(图27a至27b)或直接诱导分化为脂肪细胞谱系(图27c)。显示出在所述多个分化条件下的16天后，以油红色(oil-o)(红色)染色显示的多个脂肪细胞，图27a-所述多个细胞在补充有pmsf的培养基中培养，然后自发地分化成多个eb。图27b-所述多个细胞被培养在补充有pmsf+wnt(wnt3a)+chir(chir99021)的培养基中，然后自发地分化成多个eb。图27c-所述多个细胞在补充有pmsf+wnt+chir(chir99021)的培养基中培养，然后直接诱导至脂肪形成谱系。多个箭头指向包含多个脂滴的多个细胞，因此，指示出前脂肪细胞的分化。具体实施方式在本发明的一些实施例中，涉及多个特定的培养基，更具体地但不限于，涉及使用其在不含有基质粘附性的一悬浮培养物中培养多个多能性干细胞的多个方法。在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解本发明不一定限定于本发明的构造的细节，以及在以下描述和/或附图图示/或实施方式所阐述的组件和/或方法的排列。本发明能够以其他实施方式或以各种方法来实施或应用。本研究中提出的所述悬浮培养方法基于补充有wnt3a、gsk3βi(gsk3β抑制剂)、苯甲基磺酰氟(pmsf)及/或甲苯磺酰基-l-赖氨酰-氯甲基酮盐酸盐(tlck)的培养基，但没有向所述培养基中加入bfgf，所述特定的培养基显示出能够支持多个人类psc在无饲养层及无血清环境(例如：一悬浮培养)中的延长的未分化培养。除了它们对早期人类发育研究的贡献之外，人类多能性干细胞(hpsc)也可用于多个基于细胞的疗法及多个工业应用。未来可能在人类治疗中使用多个hpsc需要用于这些细胞的无动物、可重复、可负担且可扩展的培养系统。在所述研究中，多位本发明人基于补充有血清替代物(例如：15％血清替代物或其含量)及wnt3a的多个培养基，发现了一种用于在悬浮液中悬浮的多个hpsc的新培养系统，而无需以bfgf补充所述培养基。在使用所述新制剂时，多个hpsc在延长培养后维持所有psc特征，包括分化成所述三个胚胎胚层的多个代表性组织的所述发育潜力、无限及未分化的增殖能力及正常核型的维持。此处报道的所述培养系统证明wnt3a、gsk3βi(gsk3β抑制剂)、苯甲基磺酰氟(pmsf)及/或甲苯磺酰基-l-赖氨酰-氯甲烷盐酸盐(tlck)足以支持在悬浮液中的多个hpsc的未分化培养。所述简单的培养基制剂将促进多个研究实践，并为所述多个细胞的未来工业应用及临床应用所需的多个hpsc的大规模生产提供一额外的工具。根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种特定的培养基，包括一有效用量的蛋白酶抑制剂，其中所述培养基能够使多个人类多能性干细胞当被培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中时维持在一多能性状态。根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种特定的培养基，所述特定的培养基包括：一gsk3β抑制剂；以及至少一个试剂，选自于由一蛋白酶抑制剂及一wnt3a多肽所组成的群组，其中所述培养基能够使多个人类多能性干细胞当被培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中时维持在一多能性状态。根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种特定的培养基，所述特定的培养基包括一wnt3a多肽及所述wnt3a多肽的稳定剂，前提条件为所述稳定剂不是一脂质囊泡，其中所述培养基能够使多个人类多能性干细胞当被培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中时维持在一多能性状态。根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种特定的培养基，所述特定的培养基包括一gsk3β抑制剂，前提条件为所述培养基不含有一erk1/2抑制剂，其中所述培养基能够使多个人类多能性干细胞当被培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中时维持在一多能性状态。如本说明书所使用，术语“特定的培养基”是指一种人造的并且其所有组分都是已知的培养基。所述多个培养基可以是一种水基培养基，其包括多个物质的一组合，例如：盐、营养素、矿物质、维生素、抗生素、氨基酸、核酸、蛋白质(例如：细胞因子、生长因子及激素)，所有的物质都是细胞增殖并且能够将多能性干细胞维持在未分化状态所需要的。例如：所述特定的培养基可以是一合成的组织培养基，例如：补充有必要的添加剂ko-dmem(gibco-invitrogen股份有限公司的多个产品，格兰德岛，纽约(ny)，美国(usa))、dmem/f12(生物工业，贝特哈埃梅卡，以色列)、mabadcb培养基(hyclone，犹他州，美国)或dmem(生物工业，贝特哈埃梅卡，以色列)，如下文进一步描述的。优选地，包含在本发明的所述培养基中的所有成分基本上是纯的，并且为一组织培养等级。一非特定的培养基的多个示例是一种条件培养基或一种已补充有一条件培养基的培养基。因此，本发明的一些实施例的所述特定的培养基不是一条件培养基。一条件培养基是在一定培养期间后存在的一单层细胞培养物(即多个饲养细胞)的所述生长培养基，所述条件培养基包括在所述培养物中的所述多个单层细胞所分泌的多个生长因子及多个细胞因子。条件培养基可以从在培养物内形成多个单层的各种细胞中收集，多个示例包括：多个小鼠胚胎成纤维细胞(mef)条件培养基、包皮条件培养基、多个人类胚胎成纤维细胞条件培养基、多个人类输卵上皮细胞条件培养基等。如上所述，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂。如本说明书所使用，短语“有效用量的蛋白酶抑制剂”是指所述蛋白酶抑制剂的用量足以维持多个多能性干细胞处于一多能性状态。优选地，所述蛋白酶抑制剂的所述有效用量足以使所述多个多能性干细胞维持一未分化状态。根据本发明的一些实施例，所述蛋白酶抑制剂为一可逆的蛋白酶抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述蛋白酶抑制剂抑制(多个)丝氨酸蛋白酶。可用于本发明的一些实施例的所述培养基中的多个可逆的蛋白酶抑制剂的多个非限制性示例包括但不限于：苯甲基磺酰氟(pmsf)、gsk3β抑制剂、醛-cho、芳基酮-co-芳基、三氟甲基酮-cocf3及酮羧酸-cocooh。根据本发明的一些实施例，所述蛋白酶抑制剂的所述有效用量能够抑制所述wnt3a多肽的降解。可用于确定所述蛋白酶抑制剂是否能够抑制及/或预防wnt3a降解的多个测定包括但不限于蛋白质印迹(westernblot)分析、酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫组织化学、放射免疫测定等，其使用一个抗wnt3a抗体来测定所述多个细胞内的所述wnt3a的水平。一合适的抗wnt3a抗体的一非限制性示例是所述抗wnt3a抗体(ab28472)，可从abcam，剑桥，麻萨诸塞州(ma)，美国中获得。例如：可以在存在或不存在一特定浓度的所述蛋白酶抑制剂的情况下，在所述特定的培养基中温育所述多个细胞，并在培养几天后(例如：5天后)的地方。所述wnt3a的降解水平可以在两个时间段之间比较及/或量化。根据本发明的一些实施例，所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟(pmsf)。pmsf为一丝氨酸蛋白酶抑制剂，通常地用于制备多个细胞裂解物。pmsf的所述化学结构示意性地显示在图22中。pmsf在水中快速地降解，多个储备溶液通常地由无水乙醇、异丙醇、玉米油或dmso制成。当使用一浓度为0.1至1毫摩尔浓度(mm)的pmsf之间时发生蛋白质水解抑制。根据本发明的一些实施例，在本发明的一些实施例的所述特定的培养基中使用的所述pmsf以至少约0.01mm提供，例如：至少约0.02mm，例如：至少约0.03mm的浓度提供，例如：至少约0.04mm，例如：至少约0.05mm、例如：至少约0.06mm、例如：至少约0.07mm、例如：至少约0.08mm、例如：至少约0.09mm、例如：至少约0.1mm的pmsf。例如：包含在本发明的一些实施例的所述特定的培养基中的pmsf可以在0.05mm至1mm的范围内、例如：在0.05mm至0.8mm的范围内、例如：在0.05mm至0.7mm的范围内、例如：在0.05mm至0.6mm的范围内、例如：在0.05mm至0.5mm的范围内、例如：在0.06mm至0.4mm的范围内、例如：在0.07mm至0.3mm的范围内。例如：在0.08mm至0.2mm的范围内、例如：在0.09mm至0.15mm的范围内、例如：在0.09mm至0.12mm的范围内、例如：在0.09mm至0.1mm的范围内、例如：约0.1mm的pmsf。根据本发明的一些实施例，所述蛋白酶抑制剂为一不可逆的蛋白酶抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述不可逆蛋白酶抑制剂抑制(多个)丝氨酸蛋白酶。根据本发明的一些实施例，所述不可逆蛋白酶抑制剂为甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸(tlck)。tlck(cas4238-41-9)为胰蛋白酶及类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的一个不可逆的抑制剂。tlck可以从各种供应商获得，例如：abcam(例如：目录号abl44542)、enzo(目录号：bml-pi121-0200)、genaxxonbioscience目录号m3375.0100)等。根据本发明的一些实施例，所述tlck在本发明的一些实施例的所述培养基中以约0.05μm至约1000μm的一浓度范围提供。例如：0.5μm至约500μm、0.5μm至约400μm、0.5μm至约300μm、0.5μm至约200μm、0.5μm至约100μm、1μm至约100μm。在5μm至约100μm之间、10μm至约100μm之间、10μm至约90μm之间、10μm至约80μm之间、10μm至约70μm之间、20μm至约70μm之间、30μm至约70μm之间、40μm至约70μm、40μm至约60μm、例如：约50μm、约55μm或约60μm。根据本发明的一些实施例，所述tlck以20至80μm的一浓度提供。根据本发明的一些实施例，所述tlck在所述培养基中以约50μm的一浓度提供。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基还包含一gsk3β抑制剂。如本说明书所使用，术语“gsk3β”是指genbank登录号np_002084.2(seqidno：1)及/或np_001139628.1(seqidno：2)中所述的糖原合成酶激酶3β蛋白，通过其激酶活性而具有所述wnt信号传导调节活性。如本说明书所使用，术语“gsk3β抑制剂”(也称为“gsk3βi”)任何能够抑制gsk3βi活性的分子，如经过特异性抑制磷酸化gsk3β的多个水平(在一细胞中存在的总gsk3β中的一个)来确定。多个gsk3β抑制剂的多个非限制性示例包括：chir99021(axonmedchem-axon1386)、bio(axonmedchem-axon1693)及kenpaullone(tocris-目录号：1398).根据本发明的一些实施例，所述gsk3β抑制剂为chir99021。根据本发明的一些实施例，chir99021的浓度以至少0.1μm提供，例如：至少0.5μm，例如：至少1μm。根据本发明的一些实施例，chir99021的一浓度范围为约0.1至50μm、例如：从约0.2μm至约50μm、例如：约0.2至45μm之间、例如：约0.2至50μm之间、例如：约0.2至45μm之间、例如：约0.2至40μm之间、例如：约0.2至35μm之间、例如：约0.2至30μm之间、例如：约0.2至25μm之间、例如：约0.2至20μm之间、例如：约0.2至15μm之间之间、例如：约0.2至10μm之间、例如：约0.2至10μm之间、例如：约0.3至10μm之间、例如：约0.3至6μm之间、例如：约0.4至10μm之间、例如：约0.5至10μm之间、例如：约0.6至10μm之间、例如：约0.7至10μm之间、例如：约0.8至10μm之间、例如：在0.9至10μm之间。10μm、例如：0.9至9μm之间、例如：1至8μm之间、例如：1至7μm之间、例如：1至6μm之间、例如：1至5μm之间、例如：2至5μm之间、例如：2至4μm之间、例如：约3μm。根据本发明的一些实施例，所述chir99021以2至5微摩尔浓度/毫升(μm/ml)的一浓度范围提供。根据本发明的一些实施例，bio以约0.1至70μm之间的一浓度范围提供，例如：从约0.2μm至约70μm、例如：约0.2至60μm、例如：约0.2至55μm、例如：约0.2至50μm之间、例如：约0.2至45μm之间、例如：约0.2至40μm之间、例如：约0.2至35μm之间、例如：约0.2至30μm之间、例如：约0.2至30μm之间、例如：约0.2至25μm、例如：约0.2至20μm之间、例如：约0.2至15μm之间、例如：约0.2至10μm之间、例如：约0.3至10μm之间、例如：约0.4至10μm之间、例如：约0.5至10μm之间、例如：约0.6至10μm之间、例如：约0.7至10μm之间、例如：0.8至10μm之间、例如：0.9至10μm之间、例如：0.9至9μm之间、例如：1至8μm之间、例如：1至7μm之间、例如：1至6μm之间、例如：1至5μm之间、例如：约5μm、例如：2至4μm之间。根据本发明的一些实施例，坎帕罗酮(kenpaullone)以约0.1至70μm之间的一浓度范围提供，例如：从约0.2μm至约70μm、例如：约0.2至60μm、例如：约0.2至55μm、例如：约0.2至50μm之间、例如：约0.2至45μm之间、例如：约0.2至40μm之间、例如：约0.2至35μm之间、例如：约0.2至30μm之间、例如：约0.2至30μm之间、例如：约0.2至25μm、例如：约0.2至20μm之间、例如：约0.2至15μm之间、例如：约0.2至10μm之间、例如：约0.3至10μm之间、例如：约0.4至10μm之间、例如：约0.5至10μm之间、例如：约0.6至10μm之间、例如：约0.7至10μm之间、例如：0.8至10μm之间、例如：0.9至10μm之间、例如：0.9至9μm之间、例如：1至8μm之间、例如：1至7μm之间、例如：1至6μm之间、例如：1至5μm之间、例如：2至4μm之间、例如：约5μm。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基还包含一wnt3a多肽。如本说明书所使用，术语“wnt3a”是指所述wnt基因家族的一成员，所述wnt基因家族由编码分泌的多个信号蛋白的多个结构相关基因组成，所述多个蛋白质涉及肿瘤形成及几个发育过程，包括调节细胞命运及在胚胎形成的过程中的模式发育。所述wnt3a的信使核糖核酸(mrna)(genbank登录号：nm_033131.3；seqidno：3)编码所述wnt3a多肽(genbank登录号：np_149122.1；seqidno：4)。所述wnt3a多肽可以从各种制造商获得，例如：r&dsystems(例如：目录号：5036-wn-010)。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基还包含所述wnt3a的一稳定剂，前提条件为所述稳定剂不是一脂质囊泡。如本说明书所使用，短语“wnt3a”的“稳定剂”是指抑制多个蛋白酶并稳定所述多肽wnt3a的一试剂，前提条件为所述稳定剂不是脂质囊泡。作为多个脂质囊泡的多稳定剂的多个示例包括：脂质体、微胞等，例如：二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dmpc)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(l’-rac)-甘油))(dmpg)及胆固醇，优选地在一dmpc：dmpg：胆固醇比例为10：1：10。根据本发明的一些实施例，所述wnt3a多肽以至少约0.1ng/ml的一浓度提供，例如：至少约1ng/ml、例如：至少约2ng/ml、例如：至少约3ng/ml、例如：至少约4ng/ml、例如：至少约5ng/ml、例如：至少约6ng/ml、例如：至少约7ng/ml、例如：至少约8ng/ml、例如：至少约9ng/ml、例如：至少约10ng/ml、例如：至少约11ng/ml、例如：至少约12ng/ml、例如：至少约13ng/ml、例如：至少约14ng/ml、例如：至少约15ng/ml或更多。根据本发明的一些实施例，所述wnt3a多肽以约0.1至150ng/ml的一浓度范围提供，例如：约1至150ng/ml、例如：约1至130ng/ml、例如：约1至100ng/ml、例如：约2至100ng/ml、例如：约2至90ng/ml、例如：约2至80ng/ml、例如：约2至70ng/ml、例如：约2至60ng/ml、例如：约2至50ng/ml、例如：约2至40ng/ml、例如：约2至30ng/ml、例如：约2至20ng/ml、例如：约2至15ng/ml、例如：约2至12ng/ml、例如：约8至12ng/ml、例如：约10ng/ml的wnt3a多肽。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基不含有一erk1/2抑制剂。如本说明书所使用，术语“erk1”是指具有所述mapk信号传导活性的由genbank登录号：np_002737.2(seqidno：5)阐述的促分裂原活化蛋白激酶3(mapk3)同源异形1，由genbank登录号阐述的mapk3同源异形2：np_001035145.1(seqidno：6)、由genbank登录号np001103361.1(seqidno：7)阐述的mapk3同源异形3及/或genbank登录号m84490(seqidno：8)阐述的erk1。如本说明书所使用，术语“erk2”是指具有mapk信号传导活性的促分裂原活化蛋白激酶1(mapk1)，由genbank登录号：np_002736.3(seqidno：9)及/或genbank登录号：np_620407.1(seqidno：10)阐述。如本说明书所使用，术语“erk1/2抑制剂”是指任何能够抑制erk1/2的所述活性的分子，如通过蛋白质印迹蛋白检测多个磷酸化erk1/2蛋白来测定。多个erk1/2抑制剂的多个非限制性示例包括：pd0325901(axonmedchem-axon1408)、pd98059(axonmedchem-axon1223)及pd184352(axonmedchem-axon1368)；或甚至raf的多个抑制剂(其在erk的上游)，例如：索拉非尼(sorafenib)或sb(axonmedchem-axon1397)。如本说明书所使用，短语“不含erk1/2抑制剂”是指一种完全不包含erk1/2抑制剂或可仅包含对抑制活性无效的一痕量的erk1/2抑制剂的培养基，如经过蛋白质印迹蛋白检测磷酸化的erk1/2蛋白测定erk1/2来确定。根据本发明的一些实施例，所述痕量的erk1/2抑制剂为小于约0.009μm的一erk1/2抑制剂，例如：小于约0.005μm、小于约0.001μm、小于约0.0009μm、小于约0.0005μm、小于约0.0001μm的erk1/2抑制剂，更少地通过质谱法来测定。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基不包含超过0.009μm的erk1/2抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包含一有效用量的一蛋白酶抑制剂，例如：一浓度为0.05mm至1mm的pmsf。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂，例如：pmsf及一gsk3β抑制剂，例如：chir99021(在本说明书中也称为“chir”或“chir99021”)。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的蛋白酶抑制剂，例如：一浓度范围为0.05mm至1mm的pmsf及一浓度范围为约0.1至50μm的一gsk3β抑制剂，例如：chir99021。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂，例如：一浓度范围为0.05至0.5mm的pmsf及一浓度范围为约0.3至10μm的一gsk3β抑制剂，例如：chir99021。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂，例如：一浓度范围为0.08至0.2mm的pmsf及一浓度范围为约0.3至6μm的一gsk3β抑制剂，例如：chir99021。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂，例如：一浓度范围为0.09至0.12mm的pmsf及一浓度范围为约2至5μm的一gsk3β抑制剂，例如：chir99021。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂，例如：pmsf、一gsk3β抑制剂，例如：chir99021及一wnt3a多肽。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的蛋白酶抑制剂(例如：一浓度范围为0.05mm至1mm的pmsf)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围为约0.1至50μm的chir99021)及一wnt3a多肽(一浓度范围为0.1至150ng/ml)。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的蛋白酶抑制剂(例如：一浓度范围为0.05mm至0.5mm的pmsf)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围为约0.3至10μm的chir99021)及一wnt3a多肽(一浓度范围为60至150ng/ml)。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的蛋白酶抑制剂(例如：一浓度范围为0.05mm至0.5mm的pmsf)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围为约0.3至10μm的chir99021)及一wnt3a多肽(一浓度范围为2至50ng/ml)。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的蛋白酶抑制剂(例如：一浓度范围为0.08mm至0.2mm的pmsf)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围为约0.3至6μm的chir99021)及一wnt3a多肽(一浓度范围为80至120ng/ml)。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的蛋白酶抑制剂(例如：一浓度范围为0.08mm至0.2mm的pmsf)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围为约0.3至6μm的chir99021)及一wnt3a多肽(一浓度范围为2至50ng/ml)。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的蛋白酶抑制剂(例如：一浓度范围为0.09mm至0.12mm的pmsf)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围为约2至5μm的chir99021)及一wnt3a多肽(一浓度范围为90至110ng/ml)。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的蛋白酶抑制剂(例如：一浓度范围为0.09mm至0.12mm的pmsf)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围为约2至5μm的chir99021)及一wnt3a多肽(一浓度范围为2至50ng/ml)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)及一gsk3β抑制剂(例如：chir99021)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)及一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围在约0.1至50μm之间的chir99021)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)及一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围在约0.3至10μm之间的chir99021)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)及一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围在约0.3至6μm之间的chir99021)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)及一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围在约2至5μm之间的chir99021)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)及一wnt3a抑制剂(例如：一浓度范围在约0.1至150μm之间)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)及一wnt3a抑制剂(例如：一浓度范围在约2至50μm之间)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)及一wnt3a抑制剂(例如：一浓度范围在约60至150μm之间)。本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)及一wnt3a抑制剂(例如：一浓度范围在约80至120μm之间)。本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)及一wnt3a抑制剂(例如：一浓度范围在约5至20μm之间)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂，例如：甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)、一gsk3β抑制剂，例如：chir99021及一wnt3a多肽。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围在约2至5μm之间的chir99021)及一wnt3a多肽(在一浓度范围约0.1至150ng/ml之间)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围在约0.3至10μm之间的chir99021)及一wnt3a多肽(在一浓度范围约60至150ng/ml之间)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围在约0.3至10μm之间的chir99021)及一wnt3a多肽(在一浓度范围约2至50ng/ml之间)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围在约0.3至6μm之间的chir99021)及一wnt3a多肽(在一浓度范围约80至120ng/ml之间)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围在约0.3至6μm之间的chir99021)及一wnt3a多肽(在一浓度范围约2至50ng/ml之间)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围在约2至5μm之间的chir99021)及一wnt3a多肽(在一浓度范围约90至110ng/ml之间)。根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一有效用量的一蛋白酶抑制剂(例如：一浓度为20至80μm的甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)、一gsk3β抑制剂(例如：一浓度范围在约2至5μm之间的chir99021)及一wnt3a多肽(在一浓度范围约2至50ng/ml之间)。如上所述，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一gsk3β抑制剂及至少一种选自于一蛋白酶抑制剂及一wnt3a多肽的群组的试剂。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包括一gsk3β抑制剂(例如：chir99021)及一蛋白酶抑制剂(例如：苯甲基磺酰氟(pmsf))。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包括一gsk3β抑制剂(例如chir99021)及一蛋白酶抑制剂(例如：甲苯磺酰-l-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(tlck)]。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包括一gsk3β抑制剂(例如：chir99021)及一wnt3a多肽。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一浓度范围为0.1至50μm的gsk3β抑制剂chir99021及一浓度范围为约0.1至150ng/ml的一wnt3a多肽。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括：一浓度范围为0.3至10μm的所述gsk3β抑制剂chir99021及一浓度范围为约60至150ng/ml的一wnt3a多肽。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括：一浓度范围为0.3至10μm的所述gsk3β抑制剂chir99021及一浓度范围为约2至50ng/ml的一wnt3a多肽。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括：一浓度范围为0.3至6μm的所述gsk3β抑制剂chir99021及一浓度范围为约80至120ng/ml的一wnt3a多肽。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括：一浓度范围为0.3至6μm的所述gsk3β抑制剂chir99021及一浓度范围为约2至50ng/ml的一wnt3a多肽。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括：一浓度范围为2至5μm的所述gsk3β抑制剂chir99021及一浓度范围为约90至110ng/ml的一wnt3a多肽。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括：一浓度范围为2至5μm的所述gsk3β抑制剂chir99021及一浓度范围为约2至50ng/ml的一wnt3a多肽。如上所述，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一wnt3a多肽及所述wnt3a多肽的稳定剂，前提条件为所述稳定剂不是脂质囊泡。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包含一浓度范围为约0.1至150ng/ml的一wnt3a多肽及所述wnt3a多肽的稳定剂，前提条件为所述稳定剂不是脂质囊泡。根据本发明的一些实施例，所述稳定剂选自于由一gsk3β抑制剂及苯甲基磺酰氟(pmsf)所组成的群组中的一个。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包括一wnt3a多肽及选自于一gsk3β抑制剂及苯甲基磺酰氟(pmsf)的稳定剂。根据本发明的一些实施例，所述稳定剂为一gsk3β抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包括一wnt3a多肽及稳定剂gsk3β抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述稳定剂为苯甲基磺酰氟(pmsf)。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包括一wnt3a多肽及稳定剂苯甲基磺酰氟(pmsf)。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一浓度范围为约0.1至150ng/ml的所述wnt3a多肽及一浓度范围为0.05mm至1mm的pmsf。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一浓度范围为约60至150ng/ml的所述wnt3a多肽及一浓度范围为0.05mm至0.5mm的pmsf。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一浓度范围为约2至50ng/ml的所述wnt3a多肽及一浓度范围为0.05mm至0.5mm的pmsf。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一浓度范围为约80至120ng/ml的所述wnt3a多肽及一浓度范围为0.08mm至0.2mm的pmsf。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一浓度范围为约2至50ng/ml的所述wnt3a多肽及一浓度范围为0.08mm至0.2mm的pmsf。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一浓度范围为约90至110ng/ml的所述wnt3a多肽及一浓度范围为0.09mm至0.12mm的pmsf。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一浓度范围为约2至50ng/ml的所述wnt3a多肽及一浓度范围为0.09mm至0.12mm的pmsf。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包括一wnt3a多肽及所述稳定剂苯甲基磺酰氟(pmsf)及gsk3β抑制剂。根据本发明的一些实施例，包含wnt3a多肽及所述wnt3a多肽的一稳定剂的所述培养基不包含超过0.009μm的erk1/2抑制剂。根据本发明的一些实施例，包含wnt3a多肽及所述wnt3a多肽的一稳定剂的所述培养基不包含一erk1/2抑制剂。如上所述，本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一gsk3β抑制剂，前提条件为培养基不包含erk1/2抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包括所述gsk3β抑制剂chir99021，并且不包含一erk1/2抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包括所述gsk3β抑制剂chir99021，并且仅包括如上所述的痕量的erk1/2抑制剂。例如：本发明的一些实施例的所述特定的培养基包括一浓度范围为0.1至50μm的gsk3β抑制剂chir99021，并且不含有一erk1/2抑制剂。例如：本发明的一些实施例的特定的培养基包含浓度范围为2至5μm的gsk3β抑制剂chir99021，并且不含erk1/2抑制剂。本发明的一些实施例的所述培养基还包含白血病抑制因子(lif)。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基包括tlck(一浓度范围为0.05μm至约1000μm，例如：20至80μm)、gsk3β抑制剂chir99021(例如：一浓度范围为0.1至50μm)及lif(例如：一浓度为2000至10,000单位/ml)。如本说明书所使用，术语“白血病抑制因子(lif)”是指多效性细胞因子，所述多效性细胞因子参与诱导造血分化、诱导神经元细胞分化、在肾臓发育期间调节间质到上皮的转化，并且还可以在母胎连接处的免疫耐受性起一作用。用于本发明的一些实施例的所述培养基中的所述lif可以是一纯化的、合成的或重组表达的lif蛋白[例如：人类lif多肽genbank登录号：np_002300.1(seqidno：11)；人类lif多核苷酸genbank登录号nm_002309.4(seqidno：12)。应当注意，为了制备无异源物质的培养基，lif优选地从一人类来源中纯化或重组表达。重组人类lif可以从各种来源中获得，例如：凯米康(chemicon)，美国(目录号：lif10100)及abdserotec(美国morphosys股份有限公司，罗利市，北卡罗来纳州(nc)27604，美国)，小鼠lif(lif)可以从millipore，美国中获得(目录号：esg1107)。根据本发明的一些实施例，所述培养基中lif的所述浓度为约2000单位/ml至约10,000单位/ml、例如：约2000单位/ml至约8,000单位/ml、例如：约2000单位/ml至约6,000单位/ml、例如：约2000单位/ml至约5,000单位/ml、例如：约2,000单位/ml至约4,000单位/ml、例如：约2,500单位/ml至约3,500单位/ml、例如：约2,800单位/ml至约3,200单位/ml、例如：约2,900单位/ml至约3,100单位/ml、例如：约3,000单位/ml。根据本发明的一些实施例，所述培养基中lif的所述浓度为至少约2000单位/ml、例如：至少约2100单位/ml、例如：至少约2200单位/ml、例如：至少约2300单位/ml、例如：至少约2400单位/ml、例如：至少约2500单位/ml、例如：至少约2600单位/ml、例如：至少约2700单位/ml、例如：至少约2800单位/ml、例如：至少约2900单位/ml、例如：至少约2950单位/ml、例如：约3000单位/ml。根据本发明的一些实施例，所述培养基还包含所述il6ril6嵌合蛋白。如本说明书所使用，术语“il6ril6”是指一嵌合多肽，所述嵌合多肽包括白细胞介素-6受体(il-6-r，例如：genbank登录号aah89410，seqidno：13所阐述的人类il-6-r)的可溶部分)。(例如：genbank登录号aah89410，seqidno：14的氨基酸112至355所阐述的所述多个可溶性il6受体的一部分)及所述白细胞介素-6(il6)(例如：如genbank登录号：cag29292，seqidno：15所阐述的人类il-6)或其生物活性部分(例如：一个受体结合结构域)。优选地，根据本发明的所述方面的所述方法所使用的所述il6ril6嵌合蛋白能够支持多个人类多能性干细胞的所述未分化生长，同时维持所述人类多能性干细胞的多能性。应当理解，当构建所述il6ril6嵌合蛋白时，所述两个功能部分(即所述il6及其受体)可以彼此直接融合(例如：附接或转译地融合，即由一单一开放阅读框来编码)或通过一合适的连接肽(例如：多肽连接肽)结合(附接或转译地融合)。优选地，所述il6ril6嵌合多肽表现出与天然存在的il6及il6受体相似的糖基化的一数量及模式。例如：一合适的il6ril6嵌合蛋白，如seqidno：16所阐述及revelm.等人的wo99/02552的图11中所示，其通过引用全部并入本说明书中。根据本发明的一些实施例，包含在所述特定的培养基中的所述il6ril6嵌合蛋白以至少25皮克/毫升(pg/ml)、优选地至少50pg/ml、优选地至少100pg/ml、优选地至少200pg/ml、优选地至少300pg/ml的一浓度存在。根据本发明的一些实施例，包含在所述特定的培养基中的所述il6ril6嵌合蛋白以约25pg/ml至约1ng/ml(纳克/毫升)的一浓度范围存在，例如：25pg/ml至约900pg/ml之间、例如：25pg/ml至约800pg/ml、例如：25pg/ml至约700pg/ml、例如：25pg/ml至约600pg/ml、例如：25pg/ml至约500pg/ml之间、例如：25pg/ml至约400pg/ml之间、例如：25pg/ml至约300pg/ml之间、例如：25pg/ml至约200pg/ml之间。、例如：50pg/ml至约150pg/ml、例如：70pg/ml至约120pg/ml、例如：90pg/ml至约110pg/ml、例如：约100pg/ml、例如：100pg/ml至约600pg/ml、例如：200pg/ml至约500pg/ml、例如：300pg/ml至约500pg/ml。根据本发明的一些实施例，包含在所述特定的培养基中的所述il6ril6嵌合蛋白以一浓度范围为约25ng/ml至约350ng/ml存在，例如：25ng/ml至约250ng/ml、例如：25ng/ml至约200ng/ml之间、例如：30ng/ml至约200ng/ml之间、例如：50ng/ml至约150ng/ml之间、例如：70ng/ml至约120ng/ml之间、例如：80ng/ml至约110ng/ml之间、例如：90ng/ml至约110ng/ml之间、例如：约100ng/ml。应当注意，所述il6ril6嵌合蛋白的所述浓度可以根据所述嵌合多肽的合成或重组表达后的纯度而变化，并且本领域技术人员能够根据所述纯度调节最佳浓度。根据本发明的一些实施例，所述培养基不含有一jnk抑制剂。如本说明书所使用，术语“jnk”是指由genbank登录号：np_620637.1(同源异型(isotype)α2)(seqidno：17)、np_001265476.1(同源异型β2)(seqidno：18)、np_620634.1(同源异型β1)(seqidno：19)、np_001310231.1(同源异型α1)(seqidno：20)所阐述的所述促分裂原活化的蛋白激酶8(mapk8)蛋白质，其参与多个细胞过程，例如：增殖、分化、转录调节及发育。如本说明书所使用，术语“jnk抑制剂”是指任何能够抑制jnk活性的分子，如能够通过蛋白质印迹分析由jnk家族成员蛋白质的磷酸化来确定。多个jnk抑制剂的多个非限制性示例包括sp600125(tocris–目录号：1496)、aeg3482(axonmedchem–axon1291)及birb796(axonmedchem–axon1358)。如本说明书所使用，短语“不含有一jnk抑制剂”是指一种完全不包含一jnk抑制剂或可仅包含一痕量的jnk抑制剂的培养基。根据本发明的一些实施例，所述痕量的jnk抑制剂小于约0.01μm的一jnk抑制剂，例如：小于约0.005μm、小于约0.001μm、小于约0.0009μm、小于约0.0005μm、小于约0.0001μm的一jnk抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述培养基为不含有一p38抑制剂。如本说明书所使用，术语“p38”是指“p38α”促分裂原活化蛋白激酶14(mapk14)，其包括：由genbank登录号np_001306.1(seqidno：21)所阐述的mapk14同源异型1、由genbank登录号np_620581.1(seqidno：22)所阐述的mapk14同源异型2、由genbank登录号np_620582.1(seqidno：23)所阐述的mapk14同源异型3及由genbank登录编号np_620583.1(seqidno：24)所阐述的mapk14同源异型4所阐述；“ρ38β(beta)”(mapk11)，其由genbank登录号np_002742.3(seqidno：25)所阐述；“ρ38γ(γ)”(mapk12)，其由genbank登录号np_002960.2(seqidno：26)所阐述；及/或“ρ38δ(delta)”(mapk13)，其由genbank登录号np_002745.1(seqidno：27)所阐述，如下所述，它们都具有激酶活性并且参与信号转导。如本说明书所使用，术语“p38抑制剂”是指任何能够抑制p38家族成员活性的分子(例如：多个小分子或多个蛋白质)，如通过蛋白质印迹定量被磷酸化的p38的多个水平来确定。多个p38抑制剂的多个非限制性示例包括：sb203580(axonmedchem-axon1363)及sb202190(axonmedchem-axon1364)、ly2228820(axonmedchem-axon1895)、birb796(axonmedchem1358)及pd169316(axonmedchem-axon1365)。如本说明书所使用，短语“不含有一p38抑制剂”是指完全不包含一p38抑制剂或可仅包含一痕量的p38抑制剂的一培养基。根据本发明的一些实施例，所述痕量的p38抑制剂为小于约0.01μm的p38抑制剂，例如：小于约0.005μm、小于约0.001μm、小于约0.0009μm、小于约0.0005μm、小于约0.0001μm的一p38抑制剂。根据本发明的一些实施例，所述培养基是无血清的。如本说明书所使用，短语“无血清”是指不含有一人类或一动物的血清。应当注意，所述血清在多个培养方案中的功能是向所述多个培养的细胞提供与体内存在的一环境相似的一环境(即在衍生出所述多个细胞的所述生物体内，例如：一胚胎的一囊胚)。然而，源自于一动物来源(例如：牛血清)或一人类来源的(人类血清)的血清的使用受到多个个体之间的血清成分的多个显著变化及具有多个异源污染物的风险的限制(在使用一动物血清的情况下)。根据本发明的一些实施例，所述无血清的培养基不包含血清或所述血清的多个部分。根据本发明的一些实施例，本发明的所述无血清培养基不含有血清白蛋白(例如：从人类血清或动物血清中纯化的白蛋白)。根据多个具体实施方案，所述培养基包括重组白蛋白，例如：重组人类白蛋白。根据本发明的一些实施例，所述培养基包括血清替代物。如本说明书所使用，短语“血清替代物”是指一特定的制剂，所述特定的制剂通过向多个多能性干细胞提供生长及生存所需的多个组分来代替血清的功能。各种血清替代制剂是本领域已知的并且是可在商业上取得的。例如：gibcotmknockouttm血清替代物(gibco-invitrogen股份有限公司，格兰德岛，纽约州，美国，目录号：10828028)是一特定的无血清的制剂，其被最佳化以使es细胞在培养物中生长并且维持未分化。应当注意，gibcotmknockouttm血清替代物的所述制剂包括：来自于一动物来源的albumax(富含多个脂质的牛血清白蛋白)(price、p.j.等人的国际专利公开号第wo98/30679号)。然而，crook等人，2007(crookjm.等人，2007，《细胞干细胞》，1：490至494)的一出版物描述了在cgmp制造的knockouttm血清替代物(invitrogen股份有限公司，usa，目录号：04-0095)中使用fda批准的临床级的多个包皮成纤维细胞所产生的六种临床级hesc细胞株。另一种可商购的血清替代物是不具有维生素a的所述b27补充剂，其可从gibco-invitrogen，股份有限公司，格兰德岛，纽约州，美国中获得，目录号：12587-010。所述b27补充剂为一种无血清制剂，所述b27补充剂包括：d-生物素、无脂肪酸部分5牛血清白蛋白(bsa)、过氧化氢酶、左旋肉碱hcl、皮质酮、乙醇胺hcl、d-半乳糖(抗坏血酸)、谷胱甘肽(还原的)、重组人类胰岛素、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺-2-hcl、亚硒酸钠、超氧化物歧化酶、t-3/白蛋白复合物、dlα-生育酚及dlα生育酚乙酸酯。然而，由于所述b27补充剂包括来自于一动物来源的白蛋白，所述b27补充剂的使用受到限制。根据本发明的一些实施例，所述血清替代物不含有(完全不含有)动物污染物，所述多个污染物可以是多个病原体，所述多个病原体可以感染多个人类细胞、多个细胞成分或多个动物的多个α-细胞成分(例如：液体)。应当注意，当使用一无动物污染物的血清替代物培养多个人类细胞时，所述血清替代物被称为“无异源”。术语“xeno”是基于希腊词“xenos”的前缀，即一个陌生人。如本说明书所使用，短语“无异源”是指不含有任何来自于一异源(即不同的，一外来物)物种的组分/污染物。例如：用于多个人类细胞的一无异源血清替代物(即一无动物污染物的血清替代物)可包括胰岛素、转铁蛋白及硒的一组合。额外地或替代地，一无异源血清替代物可包括人类或重组产生的白蛋白、转铁蛋白及胰岛素。商业上可取得的多估无异源的血清替代组合物的多个非限制性示例包括：可以从invitrogen股份有限公司中获得的its(胰岛素、转铁蛋白及硒)的预混物(its，invitrogen，目录号：51500-056)；血清替代物3(sr3；西格马(sigma)，目录号：s2640)，所述血清替代物3包括人类血清白蛋白、人类转铁蛋白及人类重组胰岛素，并且不含有生长因子、类固醇激素、糖皮质激素、细胞粘附因子、可检测的ig及促分裂原；knockouttmsrxenofree[目录号：a10992-01、a10992-02，部件号12618-012或12618-013，invitrogengibco]仅含有人源的或人类重组蛋白。根据本发明的一些实施例，所述its(invitrogen股份有限公司)或sr3(西格马)无异源血清替代制剂以1比100的一比例稀释，以达到1倍(x1)的工作浓度。根据本发明的一些实施例，所述培养基中的所述血清替代物[例如：knockouttmsrxenofree(invitrogen)]的浓度范围为约1％[体积/体积(v/v)]至约1％至50％(v/v)、例如：约5％(v/v)至约40％(v/v)、例如：约5％(v/v)至约30％(v/v)、例如：约10％(v/v)至约30％(v/v)、例如：约10％(v/v)至约25％(v/v)、例如：约10％(v/v)至约20％(v/v)、例如：约10％(v/v)、例如约15％(v/v)、例如：约20％(v/v)、例如：约30％(v/v)。根据本发明的一些实施例，所述培养基还包含一脂质混合物。如本说明书所使用，短语“脂质混合物”是指培养所述多个多能性干细胞所需的一特定的(例如：在化学上成分明确的)脂质组合物。应该注意的是，通常地，将所述脂质混合物加入到没有血清或血清替代物的一培养基中，从而代替通常被加入到血清或血清替代物制剂中的所述多个脂质。可用于本发明的一些实施例的所述培养基中的一市售的脂质混合物的一非限制性的示例包括可从invitrogen中获得的化学上定义的脂质浓缩物(目录号：11905-031)。根据本发明的一些实施例，所述培养基中所述脂质混合物的所述浓度为约0.5％[体积/体积(v/v)]至约2％v/v、例如：约0.5％v/v、例如：约0.5％v/v至约1％v/v、例如：约1％v/v。本领域熟知用于使用一特定的培养基将多个多能性干细胞维持在一多能性状态的多个培养的操作流程需要向所述培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)。如本说明书所使用，术语“碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)”是指所述成纤维细胞生长因子(fgf)家族的一多肽，所述多肽与肝素结合，并具有广泛的促有丝分裂及血管生成活性。所述bfgf基因的所述mrna包含多个多腺苷酸化位点，并且可选地从非aug(cug)及aug起始密码子转译，产生具有不同特性的五种不同的同源异型。所述cug启动的多个同源异型定位于细胞核中，并且负责胞内分泌作用，而所述aug启动的形式主要是细胞质的，并且负责所述fgf的旁分泌作用及自分泌作用。通常地，所述多个培养操作流程使用genbank登录号：np_001997(seqidno：28)中提供的所述bfgf多肽，所述bfgf多肽可以从各种制造商中获得，例如：peprotech、r&dsystems(例如：目录号：233-fb)及millipore。与多个已知的培养方案形成鲜明对比，并且如以下的多个示例部分所示，多位本发明人首次发现了多种不需要向所述培养基中添加bfgf以使多个多能干维持在一多能性状态的培养条件。所述多个培养基包括：例如：所述wnt3a培养基；wnt3a-il6ril6嵌合蛋白培养基；wnt3a-lif培养基；特定的wnt3a培养基；具有il6ril6嵌合蛋白的特定的wnt3a培养基；具有lif的特定的wnt3a培养基；sr3wnt3a培养基；sr3wnt3a培养基及lif；具有il6ril6嵌合蛋白的sr3wnt3a培养基；具有pmsf的上述任何培养基；chir99021培养基；具有lif的chir99021培养基，；pmsf培养基(单独)；pmsf及lif培养基；pmsf及wnt3a培养基；pmsf及chir99021培养基；pmsf、chir99021及lif培养基；特定的pmsf培养基；具有il6ril6嵌合蛋白的特定的pmsf培养基；具有lif的特定的pmsf；sr3pmsf培养基；sr3pmsflif培养基；sr3pmsfil6ril6嵌合蛋白培养基；tlck培养基；具有lif的tlck培养基；具有chir99021的tlck培养基；具有chir99021及lif的tlck培养基；特定的tlck培养基；具有il6ril6嵌合蛋白的特定的tlck培养基；具有lif的特定的tlck培养基；sr3tlck培养基；具有lif的sr3tlck培养基；具有il6ril6嵌合蛋白的sr3tlck培养基含；tlck及wnt3a培养基；tlck及chir99021培养基；具有chir99021及lif培养基的tlck培养基(培养基组合物在以下的多个示例部分中描述)。由于bfgf是以一纯形式使用的一蛋白质试剂，不具有多个动物污染物，例如：一合成或重组bfgf，因此，不需要向一培养基中添加bfgf的一培养基的发现将会推动多能性干细胞领域的发展，这是因为所述发现将显著地降低生成未分化的多能性干细胞的多个可扩展的培养物所涉及的成本。根据本发明的一些实施例，所述培养基不包含超过1ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)，例如：不超过0.9ng/ml的bfgf、例如：不超过0.8ng/ml的bfgf、例如：不超过0.7ng/ml的bfgf、例如：不超过0.6ng/ml的bfgf、例如：不超过0.5ng/ml的bfgf、例如：不超过0.4ng/ml的bfgf、例如：不超过0.3ng/ml的bfgf、例如：不超过0.2ng/ml的bfgf、例如：不超过0.1ng/ml的bfgf。根据本发明的一些实施例，所述培养基不含有碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)。如本说明书所使用，短语“多个多能性干细胞”是指能够分化成所有三个胚胎胚层(即内胚层、外胚层及中胚层)中的多个细胞的多个细胞。短语“多能性干细胞”可以读取多个胚胎干细胞(esc)及/或多个诱导的多能性干细胞(ips细胞)。本说明书所使用的短语“多个胚胎干细胞”是指在植入前从妊娠后形成的所述胚胎组织(例如：囊胚)的胚胎组织(即一植入前囊胚)中获得的多个细胞；扩张的囊胚细胞(ebc)，其是从一植入后/原肠胚前阶段的囊胚(参见wo2006/040763)中获得；及/或胚胎胚芽(eg)细胞，其是在妊娠期间的任何时候从一胎儿的一生殖器组织获得，优选地在妊娠10周之前。根据本发明的一些实施例，本发明的所述多个多能性干细胞为多个胚胎干细胞，例如：来自于一人类或灵长类动物(例如：猴)的多个胚胎干细胞。本发明的胚胎干细胞可以使用多个熟知的细胞培养方法获得。例如：人类胚胎干细胞可以从多个人类囊胚中分离。多个人类囊胚通常地从人类体内的多个植入前胚胎或体外受精(ivf)胚胎获得。替代地，可将一单一细胞的人类胚胎扩增至所述囊胚期。为了分离多个人类es细胞，从所述囊胚中去除透明带，并通过免疫外科手术分离内细胞团(icm)，在所述内细胞团中，通过温和地移液，以裂解所述滋养外胚层细胞并从所述完整的icm中去除。然后将所述icm铺板在含有所述适当的培养基的一组织培养瓶中，所述培养瓶能够使所述icm生长。在9至15天后，通过一机械性分离或通过酶促降解将所述icm衍生的生长物分离成多个团块，然后将所述多个细胞重新铺板在一新鲜的组织培养基上。通过微量移液管单独地选择表现出未分化形态的群落，机械地分离成多个团块，并且重新铺板。然后每4至7天对产生的多个es细胞进行常规地分离，有关于多个制备人类es细胞的方法的更多详细信息，请参阅thomson等人，[美国专利号第5,843,780号；《科学》282：1145，1998；《发育生物学的当前话题》38：133，1998；美国国家科学院院院刊92：7844，1995]；bongso等人，[《人类生殖》4：706，1989]；及gardner等人[《生育及不育》69：84，1998]。应当理解，商业上可取得的多个干细胞也可以用于本发明的所述方面。多个人类es细胞可购自nih人胚胎干细胞登记处(www(点)escr(点)nih(点)gov)。商业上可取得的多个胚胎干细胞株的多个非限制性示例为bg01、bg02、bg03、bg04、cy12、cy30、cy92、cy10、te03、te04及te06。扩张的囊胚细胞(ebc)可以在原肠胚形成之前的一阶段从受精后至少9天的一囊胚中获得。在培养所述囊胚之前，消化所述透明带[例如：通过tyrode的酸性溶液(西格马奥德里奇(sigmaaldrich)，圣路易斯，密苏里州(mo)，美国)]以暴露所述多个内细胞团。然后使用多个标准胚胎干细胞培养方法，将所述多个囊胚作为多个完整的胚胎在受精后(即在所述原肠胚形成事件之前)体外培养至少9天并且不超过14天。制备多个es细胞的另一种方法描述于chung等人，《细胞干细胞》，第2卷，第2期，第113至117页，2008年2月7日。所述方法包括在体外受精过程中从一胚胎中去除一单一细胞，所述胚胎在所述过程中没有被破坏。多个胚胎生殖(eg)细胞是使用本领域技术人员已知的实验室技术使用从多个妊娠约8至11周的胎儿(在一人类胎儿的情况下)获得的原始生殖细胞来制备。将所述多个生殖脊分离并且切成小块，然后通过机械地分离将其解聚成多个细胞。然后将所述多个eg细胞在具有所述适当的培养基的多个组织培养瓶中培养，每天更换培养基以培养所述多个细胞，直至观察到与多个eg细胞一致的细胞形态，通常在7至30天或1至4次继代后。关于制备多个人类eg细胞的方法的其他细节，参见shamblott等人，[美国国家科学院院院刊95：13726，1998]及美国专利第6,090,622号。本说明书所使用的短语“诱导性多能性干(ips)细胞”(或类胚胎干细胞)是指通过一体细胞(例如：一成体体细胞)的去分化获得的一增殖性及多能性干细胞。根据本发明的一些实施例，所述ips细胞的特征在于一增殖能力，其类似于多个esc的一增殖能力，因此，可以在培养物中维持及扩增几乎无限的时间。ips细胞可以通过遗传操作赋予多能性，所述遗传操作重新编程所述细胞以获得多个胚胎干细胞的多个特征。例如：本发明的所述多个ips细胞可以通过诱导一体细胞中的oct-4、sox2、kfl4及c-myc的表达，从例如成纤维细胞、肝细胞、胃上皮细胞等多个体细胞产生，基本上如yamanakas所述。2007年，《细胞干细胞》，l(l)：39至49；aoit等人，来自于成年小鼠的肝及胃细胞的多个多能性干细胞的产生，《科学》，20082月14日。(印刷前的电子书)；ihpark、zhaor、westja等人，将多个人类体细胞重新编程为具有多个指定的因子的多能性，《自然》2008；451：141至146；ktakahashi、tanabek、ohnukim等人，通过多个特定的因子从成体人类成纤维细胞诱导成为多个多能性干细胞。《细胞》2007；131：861至872，其全部通过引用完全并入。额外地或可替代地，本发明的所述多个ips细胞基本上如yujunying等人所述，可以通过诱导oct4、sox2、nanog及lin28的表达从多个体细胞产生。(《科学》318：1917至1920，2007)及nakagawa等人，2008(《自然生物技术》26(1)：101至106).应当注意的是，所述多个体细胞的遗传操作(重新编程)可以使用任何已知的方法进行，例如使用多个质体或多个病毒载体，或通过衍生而没有任何对所述基因组的整合[yuj等人，《科学》2009，324：797至801].如果所述多个受体细胞在有丝分裂中停滞，则可通过将细胞核转移至多个卵母细胞、与多个胚胎干细胞融合或将细胞核转移至多个受精卵而产生其他类胚胎干细胞。wo03/046141a2(先进细胞科技公司，2003年6月5日)教导了通过孤雌生殖以及体细胞核移植产生活化的人胚胎。本发明的所述多个ips细胞可以通过诱导多个胚胎成纤维细胞的去分化来获得[takahashi及yamanaka，2006，《细胞》，2006，126(4)：663至676；meissner等人，2007《自然生物技术》2007，25(10)：1177至1181]、由多个hesc形成的多个成纤维细胞[park等人，2008《自然》2008，451(7175)：141至146]，胎儿成纤维细胞[yu等人，2007《科学》2007，324(5928)：797至801；park等人，2008(同上)，包皮成纤维细胞[yu等人，2007(同上)；park等人，2008(同上)，成体皮肤及皮肤组织[hanna等人，2007，《科学》2007，318(5858)：1920至1923；lowry等人，2008《美国国家科学院院院刊》，105(8)：2883至2888]，b-淋巴细胞[hanna等人2007(同上)]及成体肝细胞及胃细胞[aoi等人，2008《科学》2008年8月1日；321(5889)：699至702]。多个ips细胞株也可通过所述wicell库等多个细胞库获得，多个商业上可取得的ips细胞株的多个非限制性示例包括所述多个ips包皮克隆1[wicell目录号：ips(包皮)-l-dl-1]、ipsimr90克隆1[wicell目录号：ips(imr90)-l-dl)-l]及ipsimr90克隆4[wicell目录号：ips(imr90)-4-dl-1]。如本说明书所使用，短语“悬浮培养”是指一种培养物，其中所述多个多能性干细胞悬浮在一培养基中而不是粘附于一表面。因此，本发明的所述培养物是“不具有基质粘附性”，其中所述多个多能性干细胞能够在不粘附于例如细胞外基质、玻璃微载体或珠子的组分等一外部基质的情况下扩增。应当注意，培养例如多个hesc细胞及多个ips细胞等多个多能性干细胞的一些操作流程包括：在一半透性水凝胶膜内微囊化所述多个细胞，以允许营养物、气体及代谢产物与所术胶囊周围的大量培养基交换(关于多个细节参见例如beardsley等人的美国专利申请第20090029462号。根据本发明的一些实施例，在所述悬浮培养物中培养的所述多个多能性干细胞是缺乏细胞包囊的。优选地，为了获得定义明确，无异源的psc培养物，所述psc培养物可以容易地扩展并且适合于基于细胞的治疗及在制药工业中使用的(例如：用于药物筛选、多个药物标靶的鉴定及基于细胞的化合物递送)，本发明的一些实施例的所述培养基应该是特定的(即具有多个已知及恒定的组分)及无异源的(即没有异源污染物)。根据本发明的一些实施例，用于在悬浮液中培养的所述多个多能性干细胞的所述培养基及/或所述多个条件不含有一蛋白质载体。根据本发明的一些实施例，所述悬浮培养物为不含有基质粘附性并且不含有蛋白质载体。如本说明书所使用，短语“蛋白质载体”是指在多个蛋白质或多个营养物(例如：锌等多个矿物质)转移至所述培养物中的所述多个细胞中起作用的一蛋白质。所述多个蛋白质载体可以是例如：白蛋白(例如：牛血清白蛋白)，albumax(富含脂质的白蛋白)或者睾酮(人类血浆分离的蛋白质)。由于所述多个载体来源于人类或动物来源，因此，所述多个载体在多个人类ips细胞培养物的多个hesc中的使用受到多个批次特有的变异及/或暴露于多个病原体的限制。另一方面，基本上纯的并且没有动物污染物的所述重组人白蛋白非常昂贵，因此不常用于多个hesc培养物中。因此，不含有一蛋白质载体(例如：白蛋白)的一培养基是非常有利的，因为所述培养基使得能够由多个重组或合成的材料制造的一个真正的特定的培养基成为可能。优选地，本发明的所述方面的所述方法使用的所述培养基为无血清、无异源物、无饲养细胞(即不含有多个饲养细胞)及无蛋白质载体。根据本发明的一些实施例，当在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中培养时，所述特定的培养基能够使多个多能性干细胞(例如：多个人类多能性干细胞)维持在一多能性状态至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30次继代，或者甚至更多，例如：至少约35次继代、例如：至少约40次继代、例如：至少约45次继代、例如：至少约50次继代。根据本发明的一些实施例，当在不具有基质粘附性且不含一蛋白质载体的一悬浮培养物中培养时，所述特定的培养基能够使多个多能性干细胞(例如：多个人类多能性干细胞)维持在一多能性状态至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30次继代，或者甚至更多，例如：至少约35次继代、例如：至少约40次继代、例如：至少约45次继代、例如：至少约50次继代。根据本发明的一些实施例，当在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中培养时，所述特定的培养基能够使多个多能性干细胞(例如：多个人类多能性干细胞)维持在一多能性状态至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天，例如：当培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中同时维持所述多个多能性干细胞处于一多能性状态时至少约2、约3、约4、约5、约6或约7个月。根据本发明的一些实施例，所述特定的培养基适于扩增所述多个多能性干细胞，同时维持所述多个多能性干细胞处于一增殖、多能及未分化的状态。如本说明书所使用，术语“扩增”是指在所述培养期间增加所述多个多能性干细胞的数目(至少约5％、10％、15％、20％、30％、50％、100％、200％、500％、1000％等)。应当理解，从一单一多能性干细胞中可以获得的多个多能性干细胞的数目取决于所述多能性干细胞的增殖能力。一多能性干细胞的所述增殖能力可以通过所述细胞的倍增时间(即一细胞在所述培养物中进行一有丝分裂所需的时间)及所述多能性干细胞培养物维持在所述未分化的状态的时间来计算(相当于多个继代的数量乘以每次继代之间的天数)。根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种细胞培养物，所述细胞培养物包括多个细胞及本发明的一些实施例的所述特定的培养基。所述多个细胞可以是任何类型及来源。例如：所述多个细胞可以是多个真核细胞，例如：多个哺乳动物细胞。所述多个细胞可以是多个体细胞或多个干细胞，多个干细胞的多个示例包括但不限于：成体干细胞、造血干细胞、“年轻干细胞”(例如：胎盘及脐带血干细胞)、胚胎干细胞、诱导性多能性干细胞、间质干细胞、类间质干细胞等。应当理解，多个未分化的干细胞具有不同的形态，本领域技术人员可清楚地区分胚胎来源或成体来源的多个分化细胞。通常地，多个未分化的干细胞具有高的细胞核/细胞质比率，显著的核仁及紧密的群落形成，具有多个难以辨别的细胞连接。以下进一步描述多个未分化干细胞的其他特征。根据本发明的一些实施例，所述多个细胞包含多个多能性干细胞，并且其中所述培养基能够使所述多个人类多能性干细胞当被培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中时维持在一多能性状态。根据本发明的一些实施例，所述多个多能性干细胞为多个诱导性多能性干细胞。根据本发明的一些实施例，所述多能性干细胞为多个胚胎干细胞。根据本发明的一些实施例，所述多能性干细胞为多个人类多能性干细胞。根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种将多个多能性干细胞(psc)培养在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中的方法，所述方法包括在本发明的一些实施例的所述特定的培养基中培养所述多个多能性干细胞，从而使所述多个多能性干细胞培养在所述悬浮培养物中。根据本发明的所述方面的培养是通过将一培养容器中的所述多个干细胞以一细胞密度铺板来实现，所述细胞密度促进细胞存活及增殖但限制分化。通常地，使用每毫升约5×104至2×105个细胞的一铺板密度。应当理解，尽管通常地接种多个干细胞的多个单一细胞悬浮液，但也可以使用多个小簇，例如：使用10至200个细胞。为了在所述悬浮培养物中为所述多个psc提供多个足够及恒定的营养物及生长因子供应，可以每天更换所述培养基，或者以一预定的时间表(例如：每2至3天)更换。例如：可以通过将所述多个psc悬浮培养物在80重力加速度(g)下离心约3分钟，并将所述形成的psc沉淀物重新悬浮在一新鲜的培养基中来进行所述培养基的置换。额外地或可替代地，可以采用一培养系统，其中所述培养基受到恒定过滤或透析，以向所述多个psc提供一恒定的营养物或生长因子供应。由于多个大的psc簇可能会导致细胞分化，因此采取多个措施以避免大的psc聚集。优选地，所述多个形成的esc团块每5至7天分离，并且所述多个单细胞或多个小团块的细胞被分到多个额外的培养容器中(即继代)或以额外的培养基保持在所述相同的培养容器中。对于大的psc团块的分离，可以对多个psc的一沉淀物(所述沉淀物可以通过如上所述的离心来实现)或对一单独的psc团块进行酶促消化及/或机械性分离。(多个)psc团块的酶促消化可以通过一种酶对所述(多个)团块执行，例如：第4型胶原蛋白酶(沃辛顿生物化学公司，莱克伍德，新泽西州(nj)，美国)及/或中性蛋白酶(invitrogen股份有限公司的多个产品，格兰德岛，纽约州，美国)及/或胰蛋白酶、及/或特里普尔(tyrple)、及/或acutase(各自需要温育5至15分钟)。与所述酶一起温育的时间取决于所述悬浮培养物中存在的多个细胞团块的大小。通常地，当在所述悬浮培养中每5至7天分离hpsc细胞团块时，以1.5mg/ml的第4型胶原酶温育20至60分钟以产生多个小细胞团块，所述多个小细胞团块可以在所述未分化状态下进一步培养。替代地，可以将多个psc团块与1.5mg/ml的第4型胶原酶一起温育约25分钟，然后与1mg/ml的中性蛋白酶温育5分钟，基本上如以下的所述多个示例部分的“多个通用材料及多个实验方法”中所述。应当注意，以胰蛋白酶对多个人类esc进行继代可能会导致染色体不稳定性及多个异常(参见示例：mitalipovamm.等人，《自然生物技术》，23：19至20，2005及cowanca等人，《新英格兰医学杂志》350：1353至1356，2004)，因此应该避免。优选地，在所述大细胞团块的酶促分离或机械性分离之后，使用200微升(μl)吉尔森移液管的吸头(例如：通过上下移液所述多个细胞)，将所述多个分离的esc团块进一步破碎成多个小团块。根据本发明的一些实施例，所述多个psc在一悬浮培养物中作为多个单一细胞培养，基本上如wo2012/032521中所述，所述文献通过引用将其整体并入本说明书。简要地，仅使用机械性分离(没有一酶促分离)将所述多个细胞团分离成多个单一细胞或多个小簇(最多200个细胞)至少2次且不超过10次继代，然后将所述多个细胞作为多个单一细胞继代而不需要进一步分离多个细胞团块。如本说明书所使用，短语“机械性分离”是指通过采用一物理力而不是一酶活性，将所述多个多能性干细胞团块分离成多个单一细胞。如本说明书所使用，短语“多个单一细胞”是指所述多个多能性干细胞在所述悬浮培养物中不形成多个细胞簇的所述状态，每一簇包含超过约200个多能性干细胞。根据本发明的一些实施例，所述多个多能性干细胞在悬浮培养中不形成多个细胞簇，每一簇包含超过约150、约100、约90、约80、约70、约60、约50、约40、约30、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约3、约2或约1个多能性干细胞。根据本发明的一些实施例，所述多个多能性干细胞中的每一个在悬浮培养中时不粘附于另一个多能性干细胞。对于机械性分离，多个多能性干细胞的一沉淀物或一被分离的多能性干细胞团块可以通过在一少量的培养基(例如：0.2至1毫升)中对所述多个细胞上下移液来分离(可通过离心所述多个细胞得到)。例如：可以使用一200μl或1000μl的移液管的一尖端进行数次移液(例如：在3至20次之间)。额外地或可替代地，多个大的多能性干细胞团块的机械性分离可以使用被设计为用于将所述多个团块破碎至一预定尺寸的一装置来执行，所述装置可以从瑞典的细胞阿蒂斯哥德堡(cellartisgoteborg)获得。额外地或替代地，机械性分离可以使用一根针(例如：27g的针(bdmicrolance，德罗赫达，爱尔兰)手动进行，同时在一倒立显微镜下观察所述多团块。根据本发明的所述方面的方法，用于在悬浮液中培养所述多个psc的所述培养容器可以是任何的组织培养容器(例如：具有适于培养多个psc的一纯度等级)，所述组织培养容器的一内表面被设计成使得在所述组织培养容器中培养的多个psc是不能粘附或附接于这样的一表面(例如：多个非组织培养处理的细胞，以防止附着或粘附于所述表面)。优选地，为了获得一可扩展的培养物，使用一受控制的培养系统(优选地一计算机控制的培养系统)实现根据本发明的所述方面的培养，其中使用合适的设备自动地进行多个培养参数，例如：温度、搅拌、ph及po2。一旦所述培养参数被记录，所述系统就会根据psc扩增所需要的多个培养参数自动地调整。应当理解，根据本发明的所述方面的所述方法的培养可以在多个动态条件下(即在所述悬浮培养时所述多个psc受到恒定的运动的条件下)或在多个非动态条件下执行(即一静态培养)。对于多个psc的非动态培养，可以在多个未涂覆的58毫米(mm)的培养皿(格雷纳，弗里肯豪森，德国)中培养所述多个psc。对于多个psc的动态培养，所述多个psc可以在多个旋转瓶中培养[例如：200毫升(ml)至1000ml，例如：250ml，其可从整合生物科学的细胞旋转(cellspin)，费尔瓦尔德，德国获得；100毫升，其可从贝尔克，瓦恩兰，新泽西州获得；或在125毫升的厄伦美厄(康宁公司，科宁，纽约州，美国)]或30毫升的摇瓶(康宁公司，科宁，纽约州，美国)中]，其可以连接到一控制单元，从而提供一受控的培养系统。根据本发明的一些实施例，在不具有基质粘附性的一悬浮培养物中将所述多个psc培养在所述培养基中至少进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多次继代，例如：至少约35次继代、例如：至少约40次继代、例如：对于至少约45次继代、至少约50次继代。根据本发明的一些实施例，所述培养基能够使所述多个多能性干细胞在整个培养期间维持在一多能性状态。根据本发明的一些实施例，所述方法用于培养多个诱导的多能性干细胞。根据本发明的一些实施例，所述方法用于培养多个胚胎干细胞。根据本发明的一些实施例，所述方法用于培养多个人类多能性干细胞。根据本发明的一些实施例，所述方法用于培养多个人类诱导的多能性干细胞。根据本发明的一些实施例，所述方法用于培养多个人类胚胎干细胞。如上所述，本发明的一些实施例的所述培养基中使用的所述多个蛋白质因子中的任一个(例如：所述il6ril6嵌合蛋白、胰岛素、转铁蛋白)可以重组地表达或生化合成。应当注意，为了制备一无动物污染物的培养基，所述蛋白质因子优选地从一人源中纯化或重组地表达。可以使用多个标准固相技术执行本发明的所述多个蛋白质因子(例如：il6ril6嵌合蛋白)的生化合成，所述多个方法包括：排他性固相合成、部分固相合成方法、片段缩合及经典溶液合成。本发明的多个蛋白质因子的重组表达可以使用多个重组技术产生，例如：bitter等人，(1987)《酶学方法》153：516至544、studier等人(1990)《酶学方法》185：60至89、brisson等人(1984)《自然》310：511至514、takamatsu等人(1987)《欧洲分子生物学组织期刊》6：307-311、coruzzi等(1984)《欧洲分子生物学组织期刊》3：1671至1680、brogli等人，(1984)《科学》224：838至843、gurley等人(1986)《分子与细胞生物学》6：559至565及weissbach与weissbach，1988，《植物分子生物学方法》，《学术出版社》，纽约州，第8节，第421至463页。具体地，所述il6ril6嵌合蛋白可以如revelm.等人的pct公开号wo99/02552中所述产生及chebathj等人，1997，其通过引用全部并入本说明书中。术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包含(including)”、“具有(having)”及其词形变化是指“包括但不限于”。所述术语“由…组成(consistingof)”意思是“包括及不限于”。所述术语“主要由…组成(consistingessentiallyof)”意思是所述组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤和/或部件，但只有当额外的成分、步骤及/或部件实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征及新特征。本文所用的单数形式“一(a)”、“一(an)”以及“所述(the)”除非在上下文另有明确指出，否则本发明可包括复数个参考物。例如：术语“一化合物(acompound)”或“至少一化合物(atleastonecompound)”可以包括多个化合物，包括它们的混合物。在整个本申请中，本发明的多个实施例可以结合参考文献以一范围格式来呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对本发明范围的严格的限制。因此，对范围的描述应当被认为是具体公开的所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值，例如：描述一范围像是从1到6(from1to6)应被理解为揭露多个子范围，例如：从1到3(from1to3)、从1到4(from1to4)、从1到5(from1to5)、从2到4(from2to4)、从2到6(from2to6)、从3到6(from3to6)等；亦揭露在此范围内的各个数字,例如：1、2、3、4、5和6，无论范围的宽度如何都适用于此。每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。多个短语：第一指示数字及第二指示数字“之间的范围”及第一指示数字“至”第二指示数字“的范围”在本文中可互换，并指包括第一及第二指示数字，及其之间的所有分数及整数。本文中所使用的术语“方法”是指用于完成一特定任务的方式(manner)、手段(means)、技术(technique)及程序(procedures)，所述给定的任务包括但不限于已知的或是从已知的方式、手段、技术或步骤很容易地由化学、药理、生物、生化及医学领域的从业者开发所述多个方式、手段、技术以及程序。如本文所用，术语“治疗”包括终止、基本上抑制、减慢或逆转病症的进程，基本上改善病症的临床或心理症状或基本上预防病症的临床或心理症状的出现。当参考多个特定的序列表时，所述参考应当被理解为还包括基本上对应于所述多个特定的序列表的互补序列的多个序列，包括：由于例如定序错误、克隆错误或导致碱基置换、碱基缺失或碱基增加的其他改变而导致的多个较小的序列变异，前提条件是所述多个变异的频率为小于五十分之一个核苷酸、小于一百分之一个核苷酸，替代地，小于二百分之一个核苷酸、小于五百分之一个核苷酸，替代地，在小于一千分之一个核苷酸，替代地，小于五千分之一个核苷酸，替代地，小于一万分之一个核苷酸中。应当理解，本申请中公开的任何序列标识号(seqidno)可以指一dna(脱氧核糖核酸)序列或一rna(核糖核酸)序列，此取决于所提及的seqidno的上下文，即使仅以一dna序列形式或一rna序列形式来表达的seqidno。例如：seqidno：3是以一dna序列形式表达(例如：叙述t表示胸腺嘧啶)，但所述seqidno：3可以指对应于一wnt3a核酸序列的一dna序列或一rna分子核酸序列的rna序列。类似地，尽管一些序列是以一rna序列形式表达(例如：叙述u表示尿嘧啶)，但是根据所描述的分子的实际类型，所述可以序列指包括一dsrna(双股核糖核酸)的一rna分子的序列或与所示的所述rna序列对应的一dna分子的序列。无论如何，本说明书已设想了具有任何置换的所述多个公开的序列的dna及rna分子。应当理解，本发明的某些特征，为了清楚阐明，描述在多个独立的实施例的上下文中，也可以是在一单一实施例中以组合提供。相反，本发明的各种特征，为了简明，在一单一实施例的上下文中描述，也可以单独或以任何合适的子组合或以适合于本发明的任何其它描述的实施方式来提供。在各种实施例的上下文中描述的部分特征不应被认为是那些实施例的主要特征，除非所述实施例在没有这些组件的情况下不运作。如上文描绘和下文权利要求部分所要求的本发明的各种实施例及各个方面可在下文的多个实施例中找到实验支持。多个示例：现在参考以下实施例，连同以上的多个描述一起以一非限制性方式说明本发明的一些实施例。通常地，本说明书使用的命名法及本发明中使用的多个实验室步骤包括：分子、生物化学、微生物学及重组脱氧核糖核酸技术，这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如：“分子克隆：实验室手册”，sambrook等人，(1989)；“分子生物学中的当前的操作流程”第1至3卷，ausubel，r.m.，编辑(1994)；ausubel等人，“分子生物学中的当前的操作流程”，johnwiley及其儿子，巴尔的摩，马里兰州(1989)；perbal，“分子克隆的一实践指南”，johnwiley及其儿子，纽约(1988)；watson等人，“重组脱氧核糖核酸”，科学美国图书，纽约；birren等人(编辑)“基因组分析：实验室手册系列”，第1至4卷，冷泉港实验室出版社，纽约(1998)；美国专利第4,522,587号第4,666,828号；4,683,202；4801531；5,192,659及5,272,057中所述的多个方法；“细胞生物学：实验室手册”，第1至3卷，cellis，j.e.，编辑(1994)；由freshney，wiley-liss所著的“动物细胞培养-基础技术手册”，纽约(1994)，第三版；“免疫学中的现有方案”第1至3卷，coliganj.e.，编辑(1994)；stites等人(编辑)，“基础与临床免疫学”(第8版)，appleton&lange，norwalk，ct(1994)；mishell及shiigi(编辑)，“细胞免疫学中的多个选择方法”，w.h.弗里曼公司，纽约(1980)；专利及科学文献中广泛描述了多个可用的免疫测定法，参见，例如：第3,791,932号；第3,839,153号；第3,850,752号；第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,935,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；第4,098,876号；第4,879,219号；第5,011,771及5,281,521号；“寡核苷酸合成”gait，m.j.，编辑(1984)；“核酸杂交”hames，b.d.及higginss.j.，编辑(1985)；“转录与翻译”hames，b.d.及higginss.j.，编辑(1984)；“动物细胞培养”freshney，r.i.，编辑(1986)；“固定化细胞及酶”irl出版社，(1986)；“分子克隆的一实践指南”perbal，b.，(1984)以及“酶学方法”第1至317卷，学术出版社；“聚合酶链式反应(pcr)操作流程：方法及应用指南”，学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州(1990)；marshak等人，“蛋白质纯化及表征策略-实验室课程手册”cshl出版社(1996)；所有的这些文献均通过引用并入本说明书，如同在本说明书中完全阐述一样。本说明书文档中提供了其他一般参考文献，当中的多个步骤被认为是本领域公知的，并且是为了方便读者而提供的，其中包含的所有信息都通过引用并入本说明书。多个一般的材料及实验方法：多能性干细胞(psc)粘附(二维，2d)培养-在本发明人所开发的所述多个新型的培养基上开始培养前，所述多个hesc株i-6及i-3[amit及itskovitz-eldor，2002]是与(i)灭活的人类包皮成纤维细胞(hff)一起培养；(ii)如别处所述的多个小鼠胚胎干细胞(mef)(amit等人，2000；amit等人，2003)；或替代地(iii)如其他地方所述的matrigeltm基质(amit等人，2001；amit等人，2003)。当hff(多个饲养细胞)被用作一共培养物时，所述培养基包括：85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除血清替代物(knockout-sr)、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液及4ng/ml的bfgf(所有皆是gibcoinvitrogen股份有限公司的多个产品，格兰德岛，纽约州，美国)。当所述matrigeltm基质被用于培养所述多个多能性干细胞(psc)时，使用所述mtesr1或tesr-e8(加拿大干细胞技术)培养基。多能性干细胞(psc)悬浮液(三维，3d)培养-当被转移到悬浮培养物中时，使用以下多个培养基组合：多个基于wnt3a的培养基：(1)wnt3a培养基(10ng/ml的wnt3a)-85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr(血清替代物，gibco，目录号：10828-028)、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、10ng/ml的wnt3ar&d系统，目录号：5036-wn。(2)wnt3a-嵌合蛋白(wnt3a及il6ril6嵌合蛋白)培养基-85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、10ng/ml的wnt3a(r&d系统)及100μg/ml的所述il6ril6嵌合蛋白。(3)wnt3a-lif(wnt3a及lif)培养基-85％的dmem/f12，并补充中15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、10ng/ml的wnt3a及3000单位/毫升(u/ml)人类重组lif(派普泰克(peprotech)，目录号：300-05)。(4)特定的wnt(wnt3a)培养基包括以下多个试剂的组合：表1：特定的wnt培养基(具有10ng/ml的wnt3a)表1：*its＝胰岛素、转铁蛋白及硒。(5)具有il6ril6嵌合蛋白的特定的wnt3a培养基-特定的wnt3a(表1)并补充有100ng/ml的所述il6ril6嵌合蛋白。(6)具有il6ril6嵌合蛋白的特定的wnt3a培养基-特定的wnt3a培养基(表1)并补充有100皮克/毫升(pg/ml)的所述il6ril6嵌合蛋白。(7)具有lif的特定的wnt3a培养基-特定的wnt3a培养基(表1)并补充有3000u/ml的hrlif(人类重组lif；派普泰克)。(8)sr3wnt3a培养基-dmem/f12(94％)(生物工业，以色列，以色列西格马)、l-谷氨酰胺2mm(invitrogen股份有限公司，西格马，以色列)、抗坏血酸500μg/ml(西格马，以色列)、sr3-1％(西格马，以色列)，特定的脂质混合物1％(invitrogen股份有限公司，西格马，以色列)及10ng/ml的wnt3a(r&d系统)。(9)具有lif的sr3wnt3a培养基-sr3wnt3a培养基并补充有3000u/ml的hrlif(人类重组lif；派普泰克)。(10)具有il6ril6嵌合蛋白的sr3wnt3a培养基-sr3wnt3a培养基并补充有100pg/ml的所述il6ril6嵌合蛋白。(11)具有il6ril6嵌合蛋白的sr3wnt3a培养基-补充有100ng/ml的所述il6ril6嵌合蛋白。(12)加入pmsf(黄金生物技术)，使所有上述培养基制剂的一最终浓度为0.1mm。基于chir99021的培养基：(13)仅有chir99021培养基(无lif)-85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液及3μm的chir99021。(14)具有lif的chir99021培养基-85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、3000u/ml的lif(人类重组lif)及3μm的chir99021。多个基于pmsf的培养基：(15)pmsf培养基(单独)-85％dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液及0.1mm的pmsf。(16)pmsf及lif培养基-85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、0.1mm的pmsf及hrlif3000u/ml。(17)pmsf及wnt3a培养基-85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、0.1mm的pmsf及10ng/ml的wnt3a。(18)pmsf及chir培养基-85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、0.1mm的pmsf及3μm的chir99021。(19)pmsf、chir及lif培养基-85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、0.1mm的pmsf、3μm的chir99021及hrlif3000u/ml。(20)特定的pmsf介质–以下的表2描述了根据本发明的一些实施例的所述特定的pmsf培养基：表2：特定的pmsf培养基：材料生产商最终浓度dmem/f12生物工业无(na)脂质混合物西格马1％*its康宁1％抗坏血酸西格马500μgr/mll-谷氨酰胺生物工业4mmhr白蛋白西格马0.5％pmsfr&d系统0.1mm表2：*its＝胰岛素，转铁蛋白及硒。(21)具有il6ril6嵌合蛋白的特定的pmsf培养基-特定的pmsf培养基(表2)，并补充有100ng/ml的所述il6ril6嵌合蛋白。(22)具有il6ril6嵌合蛋白的特定的pmsf培养基-特定的pmsf培养基(表2)，并补充有100pg/ml的所述il6ril6嵌合蛋白。(23)具有lif的特定的pmsf培养基-特定的pmsf培养基(表2)，并补充有3000u/ml的hrlif(派普泰克)。(24)sr3pmsf培养基-dmem/f12(94％)(生物工业，以色列，以色列西格马)、l-谷氨酰胺2mm(invitrogen股份有限公司，西格马，以色列)，抗坏血酸500μg/ml(西格马，以色列)、sr3-1％(西格马，以色列)，特定的脂质混合物1％(invitrogen股份有限公司，西格马，以色列)及0.1mm的pmsf(r&d系统)。(25)具有lif的sr3pmsf培养基-sr3pmsf培养基，并补充有3000u/ml的hrlif(人类重组lif)。(26)具有il6ril6嵌合蛋白的sr3pmsf培养基-补充有100ng/ml的所述il6ril6嵌合蛋白的sr3pmsf培养基。(27)具有il6ril6嵌合蛋白的sr3pmsf培养基-补充有100pg/ml的所述il6ril6嵌合蛋白的sr3pmsf培养基。基于tlck的培养基：(28)tlck培养基-85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、50μm的tlck。(29)tlck-lif培养基-85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、50μm的tlck及3000u/ml人类重组lif(派普泰克)。(30)tlck-chir培养基-85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、50μm的tlck及3μm的chir99021(派普泰克)。(31)tlck-chir-lif培养基-85％的dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、50μm的tlck、3000u/mlhrlif及3μm的chir99021(派普泰克)。(32)特定的tlck培养基-表3描述了根据本发明的一些实施例的所述特定的tlck培养基。表3：特定的tlck培养基：材料生产厂家最终浓度dmem/f12生物工业无脂质混合物西格马1％*its康宁1％抗坏血酸西格马500μgr/mll-谷氨酰胺生物工业4mmhr白蛋白西格马0.5％tlck西格马50μm表3：*its＝胰岛素、转铁蛋白及硒。(33)具有il6ril6嵌合蛋白的特定的tlck培养基-特定的tlck培养基(表3)，并补充有100ng/ml的il6ril6嵌合蛋白。(34)具有il6ril6嵌合蛋白的特定的tlck培养基-特定的tlck培养基(表3)，并补充有100pg/ml的il6ril6嵌合蛋白。(35)具有lif的特定的tlck培养基-特定的tlck培养基(表3)，，并补充有3000u/ml的hrlif(派普泰克)。(36)sr3tlck培养基-dmem/f12(94％)(生物工业，以色列，以色列西格马)、l-谷氨酰胺2mm(invitrogen股份有限公司，西格马，以色列)、抗坏血酸500μg/ml(西格马，以色列)、sr3-1％(西格马，以色列)、特定的脂质混合物1％(invitrogen股份有限公司，西格马，以色列)及50μm的tlck(r&d系统)。(37)具有lif的sr3tlck培养基-sr3tlck培养基，并补充有3000u/ml的hrlif。(38)具有il6ril6嵌合蛋白的sr3tlck培养基-sr3tlck培养基，并补充有100pg/ml的il6ril6嵌合蛋白。(39)tlck及wnt3a培养基-85％dmem/f12，并补充有有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、50μm的tlck及10ng/ml的wnt3a。(40)tlck及chir99021培养基-85％dmem/f12，并补充有有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、50μm的tlck及3mm的chir99021。(41)tlck、chir99021及lif培养基-85％dmem/f12，并补充有15％的剔除-sr、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、50μm的tlck、3mm的chir99021及hrlif3000u/ml。为了对照，使用以下“yfl3”培养基：85％的dmem/f12(生物工业，比特海克，以色列)，含有15％的剔除-血清替代物(sr)、2mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸原液、10ng/ml的bfgf(所有但未提及的是invitroge股份有限公司的多个产品，格林德岛，纽约州，美国)及3000u/ml的人类重组白血病抑制因子(hrlif)(r&d系统明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国)。应当注意，在所述yfl3培养基中的所述bfgf的浓度增加至10ng/ml，以更好地支持所述多个ipsc的培养。表4列出了多个可能的来源及目录号。表4：*kosr可以以sigmasr3(s2640目录号)或脂质混合物与its的组合来代替，如表1所示。为了启动悬浮培养，采取了以下多个步骤：(1)为了使在多个饲养细胞上培养的多个psc适应悬浮培养，使用以下任何的酶的一酶促分裂执行第一次继代：tryplex(gibco-invitrogen股份有限公司，格兰德岛，纽约州，美国)、胰蛋白酶edta(bi)、accutase、温和分离剂(sct)、释放剂(sct)或胶原酶第iv型(沃辛顿)，然后将所述多个细胞转移到多个培养皿中。当所述多个细胞在悬浮培养中培养(缺乏多个饲养细胞并且不具有基质粘附性)时，通过酶促继代(如上所述)或通过使用200至1000μl的吉尔森吸头上下移液所述多个细胞簇进行机械性分离来进行继代。当所述多个psc在2-d(二维)无饲养层的多个培养条件下培养时，使用如上所述的酶促分离或通过如上所述的机械性分离进行第一次继代。在任一情况下，在第一次继代后，通过酶促分离或机械性分离来继代所述多个细胞。(2)培养多个细胞3至5次继代，每4至6天进行划分，并在2d或3d培养系统上进行培养。应当注意，“第1次继代”被认为是将所述多个细胞从2-d悬浮培养物转移到培养皿、旋转瓶、摇瓶或一生物反应器中。(3)在多个悬浮培养物中，在至少第一次继代将所述多个细胞转移到多个旋转瓶(75rpm)或多个摇瓶中后，不需要再进行划分。(4)在多个悬浮培养物中，至少第一次继代后所述多个细胞转移到多个生物反应器中之后，不需要分裂。多个悬浮培养物基于amit等人，2010年及2011年在wo2011/058558及wo/2008/015682中描述的所述多个方案，除了使用本说明书中的所述特定的培养基外，每一个皆通过引用整体并入本说明书。免疫组织化学–将生长在悬浮液中或使用2d培养物的多个未分化的hesc用4％多聚甲醛固定，并在4℃下暴露于所述多个一抗(1：50)过夜。阶段特异性胚胎抗原(ssea)1、3及4(杂交瘤库，爱荷华州，美国)及肿瘤识别抗原(tra)1-60及tra1-81(国际chemicon公司，蒂梅丘拉，加利福尼亚州，美国)用作初级抗体，多个cys3融合的抗体(国际chemicon公司，蒂梅丘拉，加利福尼亚州，美国)用作多个二抗(1：100)。核型分析-对每个样本的至少15至20个细胞进行核型分析(g-条带)，如先前所述[amit等人，2003]每次测试两个样本。根据“国际人类细胞遗传学命名系统”(iscn)分析及记录多个核型。eb形成-为了形成多个eb，使用多个1000μl的吉尔森移液管吸头将多个esc分成多个小的团块，并在适于形成多个eb(下文中的“ebs-med”)的一培养基的存在下在多个58毫米的培养皿(格雷纳，弗里肯豪森，德国)中悬浮培养，其中维持所述多个多能性干细胞处于未分化状态的多个因子被去除。所述ebs-med由80％的ko-dmem组成，并补充有20％的fbsd(hyclone，犹他州，美国)、1mm的l-谷氨酰胺、0.1mm的β-巯基乙醇及1％的非必需氨基酸原液(除fbsd外，皆来自gibcoinvitrogen股份有限公司，格兰德岛，纽约州，美国)。将多个10日龄的eb接种在多个覆盖有明胶的培养板中，并且进一步培养至少7天。采集多个细胞以用于rna分离，采集10至21天龄的多个eb以用于rna分离及组织学检查。实时pcr-根据制造商的说明书，使用三试剂(tri-reagent)(西格马，圣路易,密苏里州，美国)从悬浮培养10至15次继代的多个hpsc中分离总rna。使用去除了核糖核酸酶h(rnaseh)的mmlv逆转录酶(普罗米加，麦迪逊wi，美国)从1μg的总rna合成cdna。pcr反应包括在94℃中变性5分钟，然后重复在94℃中30秒、在粘合温度(如表1所示)中30秒并且在72℃中延伸30秒的多个循环，所使用的多个pcr引子及多个反应条件描述于下表5中。表5，多个pcr引子表5。生长曲线-将1×105个细胞悬浮于所述多个测试的培养基中。每5至7天对多个细胞进行计数。facs分析-使用tryple(invitrogen股份有限公司的多个产品，格兰德岛，纽约州，美国)将悬浮培养的多个hpsc球体分离成多个单一细胞。以融合有藻红蛋白的抗h/mssea4抗体染色所述多个细胞，将融合有藻红蛋白的大鼠igg2b用作同源异型对照组(两者皆是r&d系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国)。然后根据制造商的说明书，使用cellquest软体，以facscalibur流式细胞仪(贝克顿·狄金森，圣荷西，加州，美国)分析所述多个染色的细胞。流式细胞术-使用酶促分裂(胰蛋白酶edta，生物工业，trplex，生命技术)将多个聚集体分成多个单一细胞。以pbs洗涤所述多个细胞两次，并与特异性抗体或匹配的同源异型对照组在室温下温育30分钟。以磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤多个细胞3次，并使用流式细胞术(lsrii流式细胞仪)来分析。表6列出了多个用于本说明书中所述的一些实验中抗体。表6：多个抗体：表6：“α-人类”＝抗人类；“α-小鼠”-抗小鼠。示例1：多个实验结果：测试了几种基于wnt3a的培养基制剂在不添加bfgf的情况下支持多个hpsc在无饲养层下悬浮培养的能力，发现所述多个测试的培养基制剂适于支持未分化的无饲养层的hesc增殖。在所述多个测试培养基制剂中培养至少30个继代的多个细胞维持它们的多个esc特征，包括：未分化性增殖、核型稳定性及多能性。图1a至1c中显示了表达表面标记ssea4的示例。有趣的是，当使用纤连蛋白作为基质在补充有所述il6ril6嵌合蛋白及bfgf的所述培养基中培养时，所述多个细胞分化在所述多个群落的周围，并且形成多个类饲养细胞的细胞的一生长物(数据未显示)。此外，如通过多个免疫染色分析所证明的，培养在所述测试的培养基中的多个psc强烈地表达多个特定的多能性标志物，例如：nanog、oct4、tra-1-60及tra-1-81(图2a至20d)。当使用对照培养基与悬浮的多个hpsc培养物比较时，在所述测试的培养基中生长的多个聚集体与使用对照培养基生长的多个psc之间未观察到形态差异(图7a至7d)。由在一悬浮培养物中在所述多个新型的培养基中培养的多个psc所表达的多个多能标志物-在悬浮液中超过15或40次继代的延长培养后，测试所述多个细胞的多个多能性标志物。以所述多个测试的新型培养基制剂培养的多个psc的多个免疫染色分析揭示了多个典型的多能性标志物的表达，例如：ssea4(图2a至2l及图8a至8i)、oct4(图3a至3l、图12a至12i及图16a至16l)、nanog(图4a至4l及图9a至9i)、tra1-60(图5a至5l及图10a至10i)及tra1-81(图6a至6l、图11a至11i、图16a至16l及图17a至17l)被发现呈阳性并且是强烈的，类似于在对照培养基中培养的多个细胞。facs分析证明，以所述多个测试培养基培养时，大量的细胞对ssea4呈阳性(超过90％)(图1a至1c及图15a至15g)。此外，多个rt-pcr分析证明所述多个基因nanog、sox2及oct4保持高度表达(图14)。在悬浮培养物中在所述多个新型培养基中培养的多个psc保持稳定并且具有正常的核型-通过g-条带的核型分析证明了以所述多个新型培养基继代15次后显示出稳定的核型(数据未显示)。在所述多个新型培养基中在悬浮培养中培养的多个psc在延长培养后显示出多个正常的生长曲线-使用所述测试的新型培养基制剂培养的所述多个psc的多个生长速率在15次及超过40次继代后与对照培养基相似(图13a至13b及以下的表7)。表7描述了在所述多个测试培养基中的每一种中继代20次后的多个细胞计数及生存能力。表7：表7：“w.o.”＝不含；在所述新型培养基中悬浮培养的多个psc能够分化成所有三个胚胎胚层：内胚层、外胚层及中胚层-通过类胚胎体(eb)的形成在试管内检验使用所述多个测试的新型制剂长时间培养后的所述psc的发育潜力。当在悬浮液中培养时，多个hpsc在所述测试培养基中继代20次后形成类似于在多个mef上生长的多个es细胞所产生的eb(图18a至18g)。在所述多个eb中，多个干细胞分化成代表所述三个胚胎胚层的多个细胞类型。因此，所述多个新型的测试培养基制剂被发现适合于延长多个hpsc培养，同时维持psc的多个特征。示例2：所述多个新型的培养基也可以支持pscs在多个二维培养系统上的连续培养：多个实验结果：使用覆盖有基质胶基质、纤连蛋白、层粘连蛋白或人类包皮成纤维细胞无细胞基质的培养皿，以所述多个测试培养基将多个psc培养为多个贴壁细胞。使用第4型胶原蛋白酶每4至7天继代所述多个细胞，每天更换培养基，在所述多个细胞连续生长20次继代后，对所述多个细胞进行多个多能性标记物的表征，所述多个多能性标记物包括oct4，tral60及ta181。多个结果显示在图21a至21c中。如图所示，所述多个新型的培养基还可以支持未分化及多能性干细胞在多个二维培养系统上生长。示例3：含有多种蛋白酶抑制剂的无血清的特定的培养基支持人类多能性干细胞的未分化生长：多个实验结果：测试几种新的培养基制剂支持多个psc在悬浮液中的未分化培养的能力(在“多个一般的材料及实验方法”下描述的培养基)。当使用补充有pmsf、tlck或wnt3a而不补充bfgf的培养基时，多个hesc可以在未分化的情况下培养超过18代，同时表达多个psc特征。细胞形态类似于所述被报道的多个悬浮培养的psc的形态(图23a至23b)，具有清晰边界及圆盘状形状的多个细胞的一聚集体(amit等人，2010)。使用facs分析，证明在悬浮6次继代后，92％的培养的psc(13)共表达oct4及ssea4。>95％的所述多个测试的细胞对ssea4呈阳性(图23b)。类似地，图24b中显示的从多个额外生物学重复的结果显示，83％的所述多个细胞共表达所述多个标记。以动态系统(旋转器)培养所述多个细胞导致超过每毫升6百万个细胞的多个细胞浓度的多个细胞(数据未显示)。以多个旋转瓶连续培养超过一个月(4至5次继代)的多个细胞维持多个多能性标记物oct4及ssea4的表达，从两次生物学重复中共表达95％或86％(图25及26)。此外，使用所述测试的培养基形式在悬浮液中培养的多个细胞能够形成多个eb，并且分化成不同的细胞谱系，如图27a至27c所示。虽然本发明已经结合其特定实施例进行了描述，但是显而易见的是，许多备选方案，修饰以及变化对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本发明旨在涵盖所有落入所述权利要求的精神和范围内的所有这样的备选方案、修饰以及变化。在本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请以其整体作为参考文献并入本说明书中，其程度如同各独立的出版物、专利或专利申请案被明确地且个别地标示为以引用的方式并入本说明书中。此外，本申请中任何参考文献的引用或证明不应被解释为承认所述参考文献可作为本发明的现有技术。本申请中标题部分在本说明书中用于使本说明书容易理解，而不应被解释为必要的限制。多个参考文献：(在本文中引用额外的参考文献)1.amitm、carpentermk、inokumams、chiuc-p、harriscp、waknitzma、itskovitz-eldorj、thomsonja.，由克隆衍生的人类胚胎干细胞株在长时间培养中保持多能性及增殖潜力，《发育生物学》2000；227：271至278。2.amitm、marguletsv、segevh、sharikik、laevskyi、colemanr及itskovitz-eldorj.，用于多个人类胚胎干细胞的多个人类饲养层，《生殖生物学》68：2150至2156，2003。3.michalamit、lianalaevsky、yaelmiropolsky、kohavashariki、meitalperi、josephitskovitz-eldor，用于未分化的多个人类多能性干细胞的可扩展的扩增的动态悬浮培养，《自然操作流程》，6(5)：572至579，2011。4.amitm、chebathj、marguletzv、laevskyi、miropolskyy、sharikik、perim、revelm、itskovitz-eldorj.，多个未分化的人类胚胎及诱导性多能性干细胞的悬浮培养，《干细胞评论及报告》，6(2)：248至259，2010。5.daheronl、opitzsl、zaehresh、lenschwm、andrewspw、itskovitz-eldorj、daleygq，lif/stat3信号传导不能维持多个人类胚胎干细胞的自我更新，《干细胞》，2004；22(5)：770至8。6.saton、meijerl、skaltsounisl、greengardp、brivanlouah.，通过一药理学gsk-3特异性抑制剂激活wnt信号传导来维持人类及小鼠胚胎干细胞的多能性，《自然医学》，20041月10日(1)：55至63。7.xuc、inokumams、denhamj、goldsk、kundup、goldjd、carpentermk.，多个未分化的人类胚胎干细胞的无饲养细胞的生长，《自然生物技术》2001；19：971至974。8.richardsm、fongcy、chanwk、wongpc、bongsoa.，多个人类饲养者支持多个人类内细胞团及多个胚胎干细胞的延长的未分化生长，《自然生物技术》2002；20：933至936。9.amitm、marguletsv、segevh、sharikic、laevskyi、colemanr及itskovitz-eldorj.，用于多个人类胚胎干细胞的多个人类饲养层，《生殖生物学》2003；68：2150至2156。10.amitm、sharikik、marguletsv及itskovitz-eldorj.，“用于人类胚胎干细胞的饲料及无血清培养系统”，《生殖生物学》70：837至845，2004。11.hovattao、mikkolam、gertowk、strombergam、inzunzaj、hreinssonj、rozellb、blennowe、andangm、ahrlund-richterl.，使用多个人类包皮成纤维细胞作为多个饲养细胞的一培养系统允许多个人类胚胎干细胞的生产，《人类生殖》，2003年7月；18(7)：1404至9。12.thomsonja、itskovitz-eldor、j、shapiross、waknitzma、swiergieljj、marshallvs、jonesjm.，来源自多个人类囊胚的多个胚胎干细胞株，《科学》1998；282：1145至1147[科学中的错误1998；282：1827]。13.reubinoffbe、peramf、fongc、trounsona.、bongsoa.，来自于多个人类囊胚的多个胚胎干细胞株：在试管内的体细胞分化，《自然生物技术》2000；18：399至404。14.amitm.及itskovitz-eldorj.，人胚胎干细胞的来源及自发地分化，解剖学杂志，2002；200：225至232。15.itskovitz-eldorj、schuldinerm、karsentid、edena、yanukao、amitm、soreqh、benvenistyn.，将多个人类胚胎干细胞分化成包括所述三个胚胎胚芽层的类胚胎体，《分子医学》2000；6：88至95。16.xurh、peckrm、lids、fengx、ludwigt、thomsonja.，基础fgf及抑制bmp信号传导维持多个人类es细胞的未分化增殖，《自然方法》，2005；2(3)：185至190。17.xuc、rosiere、jiangj、lebkowskijs、goldjd、o'sullivanc、delavan-boorsmak、mokm、bronsteina、carpentermk.，碱性成纤维细胞生长因子支持未分化的人类胚胎干细胞在没有条件培养基的情况下生长，《干细胞》，2005b23：315至23。序列表<110>阿塞尔塔有限公司阿米特,迈克尔安格尔,伊茨查克<120>用于在悬浮下培养多能性干细胞的培养基<130>70336<150>us62/363,879<151>2016-07-19<160>28<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>433<212>prt<213>homosapiens<400>1metserglyargproargthrthrserphealaglusercyslyspro151015valglnglnproseralapheglysermetlysvalserargasplys202530aspglyserlysvalthrthrvalvalalathrproglyglnglypro354045aspargproglngluvalsertyrthraspthrlysvalileg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