磁性玻璃珠粒方便地用于核酸纯化。最近，已经聚焦于从以微创或非侵入性方式(例如从血液、唾液、尿液等)获得的样品中获得核酸。这些样品中的无细胞核酸(cfnas)可以包括相对短的多核苷酸，例如，小于100或1000bp，所述多核苷酸不能使用标准结合和洗脱条件用磁性玻璃珠粒有效地回收。此外，使用标准条件获得的双链cfna（其对于一些分析技术是必需的）不足。发明概述本文提供了用于从磁性玻璃珠粒(mgp)自动回收双链核酸的方法和组合物。所述方法包括使用两次或更多次低温洗脱来从mgp洗脱与mgp非共价结合的双链核酸。在一些实施方案中，所述方法包括a)将磁场施加至盛放溶液(例如，包含洗涤缓冲液或具有结合缓冲液的样品)中的与mgp非共价结合的双链核酸的容器，并去除未与mgp结合的液体；b)在低于70℃(例如，25-60℃、25-50℃、30-45℃、32℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、60℃、65℃)的温度下在容器中使与mgp非共价结合的双链核酸与洗脱缓冲液接触；c)将磁场施加至容器；d)收集未与mgp结合的液体，由此收集洗脱物；e)在低于50℃的温度下在容器中使与mgp非共价结合的双链核酸与洗脱缓冲液接触；f)将磁场施加至容器；和g)收集未与mgp结合的液体，由此收集洗脱物；其中步骤d)和g)中收集的洗脱物包含从mgp回收的双链核酸。步骤b)和e)中的温度低于50℃，特别是25℃至45℃，例如25℃、37℃、42℃或45℃。在一些实施方案中，所述双链核酸长度为30-1500或50-500个碱基对。在一些实施方案中，所述双链核酸来自无细胞样品，例如选自血液、血浆、血清、羊水、脑脊液和尿液。在一些实施方案中，所述双链核酸来自无细胞核酸。在一些实施方案中，所述双链核酸来自细胞来源，例如来自细菌、其他病原体或组织的基因组dna。在一些实施方案中，所述双链核酸长度为1000或更多个碱基对，例如5000或更多个碱基对。在一些实施方案中，步骤a)中的溶液具有低于7(例如，3-6.5或3.5-6)的ph。在一些实施方案中，所述洗脱缓冲液具有大于7(例如，7-10或7.5-9)的ph。在一些实施方案中，自动化方法在步骤a)之前进一步包括：在容器中使含有双链核酸的液体样品与mgp接触，由此在容器中允许双链核酸非共价结合溶液(例如，有或没有结合缓冲液)中的mgp；将磁场施加至容器并去除未与mgp结合的液体，由此留下与mgp非共价结合的双链核酸；和将液体(例如，洗涤缓冲液)添加至与mgp非共价结合的双链核酸。在一些实施方案中，将与mgp非共价结合的双链核酸悬浮于洗涤缓冲液中、施加磁场和去除未结合的液体的步骤在洗脱之前实施多于一次(例如，2、3、4或5次)。在一些实施方案中，在步骤b)和e)中使洗脱缓冲液和与mgp非共价结合的双链核酸接触至少5分钟(例如，5-10、10-30、5-25或7-25分钟)。在一些实施方案中，洗脱(与洗脱缓冲液接触)较短，但实施更多次洗脱，例如3-5次洗脱，且持续时间少于5分钟。在一些实施方案中，实施多于两次洗脱，例如3、4、5或6次洗脱。在一些实施方案中，两次或更多次洗脱具有不同的持续时间，而在其他实施方案中，所述洗脱具有相同的持续时间。在一些实施方案中，使用自动化移液器将洗脱缓冲液和与mgp非共价结合的双链核酸混合。在一些实施方案中，所述容器是多孔板中的孔。在一些实施方案中，所述容器是管，例如容量为1-5或1.5-3ml。在一些实施方案中，所述容器是芯片中的微孔/微室。在一些实施方案中，在来自步骤d)和g)的洗脱物中回收的核酸包含至少30%双链核酸(例如，非变性的，天然配对的)。也就是说，在洗脱物中回收的双链核酸占洗脱物中总核酸的至少30%。在一些实施方案中，在来自步骤d)和g)的洗脱物中回收的核酸包含至少40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或更多双链核酸。发明详述i.引言本公开提供了增强使用磁性玻璃颗粒(mgp)从生物来源(例如，血浆、血清、尿液和其他体液，以及从细胞样品或裂解物)纯化小尺寸(例如，<1kb、50-2000bp、50-500bp、100-1000bp)的核酸(na)的试剂。本发明公开的技术和组合物允许以足以用于下游分析技术诸如扩增和测序的量回收双链cfna。此类试剂和技术的开发是必要的，因为用标准核酸分离试剂，不能从mgp回收小核酸，且因此不能以可观的量进行纯化。当与核酸制备(nap)产品中的其他现有试剂组合使用时，本发明公开的试剂和方法克服了循环na的低回收问题。这些方法不仅用rochenap产品(例如，magnapure试剂)可用，而且用其他类似系统也可用。磁性玻璃颗粒可用于手动核酸纯化(nap)或用于适当的专用系统(例如，magnapure96或magnapure24)或通用液体处理器(例如，biomeknx)上的自动化nap。使用的生物样品的体积可以范围从非常小(例如，50μl)至大(例如，4ml或更多)。本发明描述的方法和试剂的用途的非限制性实例包括从作为癌症的“液体活检样品”的血浆或尿液纯化无细胞核酸，非侵入性产前检测(nipt)和实体器官移植排斥的早期检测。本发明公开的方法允许使用磁珠纯化小的双链核酸，其具有比其他自动化系统和甚至用于nap的一些手动技术(例如，离心柱)更高的回收率。ii.定义术语“自动化”是指在没有直接人操作的情况下以程序化方式实施的动作。自动化动作可以由技术人员远程控制、编程或观察，但不需要技术人员手动干涉，例如使用手动移液器，通过手移动容器等。术语“磁性玻璃颗粒”或“mgp”是指这样的颗粒，其包含非共价结合核酸的玻璃和至少一个响应于磁场的磁性芯(例如，磁性芯的分散体)。所述玻璃不一定是纯的二氧化硅，尽管二氧化硅可以是一种组分。mgp足够的小以被吸入标准移液器尖端中并形成悬液(通常为0.5-15µm)。mgp通常是大致球形的，且可以是多孔的或无孔的。所述磁性芯可以是铁磁性的或顺磁性的(仅在磁场存在的情况下被磁化)。合适的mgp更详细地描述在例如美国专利号6,255,477和6,545,143中。术语“固体(或半固体)基质”、“固体(或半固体)支持物”在本文中用于表示试剂诸如核酸可以固定的惰性表面或主体。非限制性实例包括玻璃、二氧化硅、塑料、硝化纤维素、膜、芯片和颗粒。如本文所用的术语“固定化”表示基于分子的偶联，其在本文所述的测定步骤期间施加的条件下不显著解偶联。这种固定化可以通过共价键、离子键、亲和型键或任何其他化学键来实现。例如提及溶液中的固体支持物的术语“在溶液中”，可以指示固体支持物暴露于溶液(例如，与溶液中的测定组分接触)或固体支持物本身在溶液中(例如，悬浮于液体中的珠粒或颗粒)。该术语用于区分亲水性液相和具有分开的亲水性和疏水性组分的乳状液。术语“贮藏器(receptacle)”、“容器”、“管”、“孔”、“室”、“微室”等是指可以盛放试剂或容纳测定的容器。如果贮藏器是在试剂盒中且盛放试剂、或用于扩增反应，则可以将其封闭或密封以避免污染或蒸发。如果贮藏器用于测定，则其可以是开放的或可进入的，至少在建立所述测定期间是这样的。在mgp结合核酸的上下文中的术语“捕获(capture)”、“捕获(capturing)”、“结合(bind)”或“结合(binding)”是指非共价结合，例如，通过离液序列高的或离子的相互作用。通过洗脱，例如，使用干扰非共价相互作用的洗脱缓冲液，可以破坏mgp-核酸相互作用。术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指核苷酸(例如，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物，且包括天然存在的(腺苷、鸟嘌呤(guanidine)、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷)、非天然存在的和修饰的核酸。该术语不受聚合物的长度(例如，单体的数目)限制。核酸可以是单链的或双链的，且通常含有5'-3'磷酸二酯键，尽管在一些情况下，核苷酸类似物可能具有其他键。单体通常被称作核苷酸。术语“修饰的核苷酸”是指这样的非天然存在的核苷酸，其含有修饰的含氮碱基、糖或磷酸基团，或其在其结构中掺入非天然的部分。非天然的核苷酸的实例包括双脱氧核苷酸、生物素化的、胺化的、脱氨基的、烷基化的、苄基化的和荧光团标记的核苷酸。在本公开的上下文中，双链核酸通常是指未经分离和再杂交(通过watsoncrick碱基配对再匹配)的未变性的天然配对的dna段。在液体活检样品(诸如血液、血浆、血清、尿液、粘液、脑脊液和羊水)中，无细胞核酸包括长度范围为约40-1000个碱基对长的此类双链核酸。无细胞核酸从细胞释放，例如从通过凋亡杀死的细胞释放，或释放在细胞外囊泡或外来体中。双链片段，因为它们被释放至无细胞核酸中，所以通常几乎完全匹配，例如在任一末端没有或只有少数突出的非碱基配对的核苷酸。双链dna片段也可以合成产生，例如通过超声处理或剪切基因组dna产生。这些合成产生的dsdna片段也主要具有平末端。具有平末端的双链dna片段也可以通过限制性酶消化或扩增产生。当此类双链片段的混合物暴露于高温时，它们可能变成未配对的(解链的，变性的，未杂交的)，并且在降低的温度下，保持单链，或与具有序列或长度不同于其当从细胞释放时与之配对的链的一段序列的链再杂交(再碱基配对，复性)。后者可以导致重叠片段的配对，使得在双链区段的任一末端上存在更长的、错配的单链部分，即更多的突出端。与突出端或单链核酸的错配可以导致下游处理期间的产量降低，其或者是由于在连接衔接子序列(例如，用于测序)之前无法填为平末端，或者是在纯化方法中更有效地回收dsdna而非单链。可选地，错配对可以在有限数目的内部位点处发生，例如，其中一条链具有突变而另一条链不具有突变。此类单碱基对错配与下游的下一代测序（其中检查链一致性以确保准确性）不相容。术语“引物”是指在合适的条件下充当通过核酸聚合酶的多核苷酸链合成的起始点的短单链核酸(寡核苷酸)。多核苷酸合成和扩增反应通常包括适当的缓冲液、dntp和/或rntp、和一种或多种任选的辅因子，并且在合适的温度下实施。引物通常包括至少一个靶标杂交的区域，其与靶序列至少基本上互补(例如，具有0、1、2或3个错配)。该区域通常具有约8至约40个核苷酸的长度，例如，12-25个核苷酸。如本文所用，“探针”是指能够选择性结合特别预期的靶生物分子(例如，待由探针结合、捕获或杂交的目标核酸序列)的任何分子。词语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸中的核酸与第二种多核苷酸中的另一核酸形成碱基对的能力。例如，序列a-g-t(对于rna，为a-g-u)与序列t-c-a(对于rna，为u-c-a)互补。互补性可以是部分的，其中仅一些核酸根据碱基配对匹配，或可以是完全的，其中所有核酸都根据碱基配对匹配。如果探针或引物与靶序列至少部分地互补，则所述探针或引物被视为对靶序列“特异性的”。取决于条件，与靶序列的互补性程度对于较短核酸诸如引物而言(例如，大于80%、90%、95%或更高)通常高于较长序列。在两种或更多种核酸、或两种或更多种多肽的背景下，术语“相同的”或“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列是相同的，或具有指明的百分比的相同的核苷酸或氨基酸(例如，当在比较窗口或指定区域上关于最大对应性进行比较和比对时，在指明的区域上的约60%同一性，例如，65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性中的至少任一种)，如使用blast或blast2.0序列比较算法(用默认参数)测量的，或通过手工比对和目检测量的。参见例如，ncbi网站ncbi.nlm.nih.gov/blast处。此类序列因此被称作是“基本上相同的”。通常在最佳比对的序列上确定同一性百分比，使得所述定义适用于具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。在本领域中通常使用的算法考虑缺口等。通常，同一性存在于包含至少约8-25个氨基酸或核苷酸长度的序列的区域上，或者50-100个氨基酸或核苷酸长度的区域上，或者参考序列的整个长度上。术语“试剂盒”是指包含至少一种试剂(诸如核酸探针或探针库等)的任何制造品(例如，包装或容器)，其用于特异性扩增、捕获、标记/转换或检测rna或dna，如本文所述。术语“扩增条件”是指核酸扩增反应(例如，pcr扩增)中的条件，其允许引物的杂交和模板依赖性延伸。术语“扩增子”或“扩增产物”是指这样的核酸分子，其含有靶核酸序列的全部或片段，并且其通过任意合适的扩增方法形成为体外扩增产物。技术人员会理解，正向和反向引物(引物对)限定扩增产物的边界。当应用于引物时，术语“产生扩增产物”表示，所述引物在适当的条件下(例如，在核苷酸聚合酶和ntp的存在下)将产生确定的扩增产物。各种pcr条件描述于pcrstrategies(innis等人,1995,academicpress,sandiego,ca)第14章;pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(innis等人,academicpress,ny,1990)中。术语“扩增产物”是指扩增反应的产物。所述扩增产物包括用于起始每轮多核苷酸合成的引物。“扩增子”是靶向用于扩增的序列，且该术语也可以用于指扩增产物。扩增子的5'和3'边界由正向引物和反向引物限定。术语“样品”或“生物样品”是指含有或假定含有核酸的任何组合物。该术语包括纯化的或分离的细胞、组织或血液的组分，例如，dna、rna、蛋白、无细胞部分或细胞裂解物。在本公开的背景下，所述样品是液体，例如，血液或血液组分(血浆或血清)、尿液、精液、唾液、痰、粘液、精液、泪液、淋巴液、脑脊液、口腔/喉冲洗液、支气管肺泡灌洗液、从拭子洗下的物质等。样品也可以包括从个体获得的细胞的体外培养物(包括细胞系)的成分和组分。液体样品还可以从直接获得自个体的样品部分地处理，例如，细胞裂解物或去除红细胞的血液。在本公开的上下文中，术语“未结合的液体”或“未结合的样品”是指没有与固体支持物或mgp结合的液体和其他组分(例如，蛋白物质或细胞碎片)，例如，去除核酸或其他靶标的液体。所述未结合的液体可以仍然包括残余量的核酸或靶标。细胞外囊泡(包括外来体、微泡和凋亡小体)是存在于生物流体(例如，血液和尿液)中的细胞来源的囊泡(膜包封体)。细胞外囊泡可以从细胞释放，例如，从质膜直接释放，或当多泡体与质膜融合时形成。细胞外囊泡通常包含组分诸如来自它们的起源细胞的核酸和蛋白。外来体通常直径为40-120nm，微泡通常直径为50-1000nm，且凋亡小体通常直径为500-2000nm。“对照”样品或值是指充当参考（通常是已知的参考）用于与测试样品或测试条件比较的值。例如，测试样品可以取自测试条件，例如，来自疑似具有癌症的个体，并且与来自已知条件(例如，来自无癌个体(阴性对照)或来自已知具有癌症的个体(阳性对照))的样品进行比较。对照还可以代表从许多测试或结果收集的平均值或范围。还可以为反应条件制备对照。例如，关于核酸的存在的阳性对照可以包括将检测已知存在于样品中的序列(例如，持家基因诸如β肌动蛋白、β珠蛋白、dhfr或琥珀酸脱氢酶、或已知添加的多核苷酸(例如，具有指定长度))的引物或探针。阴性对照的一个实例是不含核酸的对照，或包括对不存在于样品中的序列(例如，来自不同物种)特异性的引物或探针的对照。技术人员会理解，阳性和阴性对照的选择将取决于具体测定，例如，使得所述对照是细胞类型和生物适当的。本领域技术人员会认识到，可以设计对照用于评估任意数目的参数。例如，可以设计对照以基于药理学数据(例如，半衰期)或治疗性措施(例如，益处和/或副作用的比较)来比较治疗益处。可以设计对照用于体外应用，例如已知量的已知序列。本领域技术人员会理解哪些对照在给定的情形下是有价值的，且能够基于与对照值的比较来分析数据。对照对于确定数据的显著性也是有价值的。例如，如果给定参数的值在对照中宽泛地变化，测试样品中的变化不会被视作显著的。术语“标记物”、“标签”、“可检测的部分”和类似术语是指通过光谱、光化学、生化、免疫化学、化学或其他物理方式可检测的组合物。例如，有用的标记包括荧光染料、发光试剂、放射性同位素(例如，32p、3h)、电子致密试剂或基于亲和力的部分，例如，聚-a(与聚-t相互作用)或聚-t标签(与聚-a相互作用)，his标签(与ni相互作用)，或链霉抗生物素蛋白标签(可用生物素分离)。除非另外定义，否则在本文中使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。参见，例如，lackie,dictionaryofcellandmolecularbiology,elsevier(第4版2007);sambrook等人,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringsharborpress(coldspringsharbor,n.y.1989)。术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”意图指“一个/种或多个/种”。当在步骤或要素的描述前面时，术语“包含/包括(comprise,comprises,comprising)”意图指其他步骤或要素的添加是任选的且不被排除。iii.核酸样品用于核酸扩增的样品可以获得自疑似含有核酸的任何来源。在一些实施方案中，所述样品以非侵入性方式例如从尿液、皮肤、拭子、唾液、血液或血液级分获得。样品也可以取自组织活检样品、福尔马林固定石蜡包埋的组织(ffpet)或培养的细胞。用于从生物样品分离核酸的方法是已知的，例如，如在sambrook中所述，且几种试剂盒是商购可得的(例如，dnaisolationkitforcellsandtissues、dnaisolationkitformammalianblood、highpureffpetdnaisolationkit、highpurernaisolationkit、highpureviralnucleicacidkit和magnapurelctotalnucleicacidisolationkit，可得自roche)。本方法还可以应用于液体，例如，从食品或植物样品或从表面的擦拭物(例如，在医院场合)制备。在包含细胞的样品中，可以分离出细胞(例如，使用基于大小的过滤或离心)，由此留下无细胞的核酸(cfna)，包括在外来体、微泡、病毒颗粒中的核酸，或自由循环的那些核酸。可选地，可以在mgp的存在下或在将细胞裂解物添加至mgp之前，裂解细胞以获得细胞核酸。可用于核酸分离的裂解缓冲液(lb)可以包含3-6mguscn或尿素、0-500mm缓冲液(tris-hcl，mops，hepes等)、10-25%去污剂(例如，tween，triton-x或聚多卡醇(polydocanol)等)、0-200mm柠檬酸钠，ph5.0-8。尽管lb是指裂解，但其可以用于无细胞样品诸如血浆或血清中，并且可以用于裂解细胞外囊泡、外来体或微泡(如果存在的话)。iv.固体支持物和磁性玻璃颗粒(mgp)本发明描述的核酸制备方法涉及使用固体或半固体支持物，例如颗粒(例如，微粒或珠粒)。微粒的大小范围可以变化，并且具体大小范围不是关键的。在大多数情况下，微粒的总计的(aggregated)大小范围落在粒径为约5纳米至约500微米的范围内，例如，落在约500纳米至约50微米、约1微米至约100微米或约1微米至30微米的范围内。磁性玻璃颗粒(mgp)是本领域已知的，且描述于例如美国专利号6,255,477和6,545,143中。用于本文描述的方法的颗粒通常是铁磁性的。所述颗粒通常是大致球形的，具有0.5-15µm(例如，1-10、0.8-2或1-1.5µm)的直径。在一些实施方案中，所述颗粒是无孔的。mgp可以具有被玻璃包被的单个磁性芯，或包含灌入有几个磁性物体的玻璃。所述磁性物质可以是铁或氧化铁如磁铁(fe3o4)或fe2o3(例如，γ-fe2o3)。可以使用钡铁氧体、镍、钴、al-ni-fe-co合金或其他铁磁性的物质。在磁性芯中还可以包含金属氧化物，例如，氧化铝、氧化铁、氧化铬、氧化铜、氧化锰、氧化铅、氧化锡、氧化钛、氧化锌或氧化锆。玻璃组分通常是基于二氧化硅的，例如，氧化硅和玻璃粉末、烷基二氧化硅、硅酸铝、或nh2-活化的二氧化硅。在一些实施方案中，玻璃包含至少一种金属氧化物(例如，sio2、b2o3、al2o3、k2o、cao和/或zno)。在一些实施方案中，按照摩尔百分比的次序，玻璃包含sio2、b2o3、al2o3、k2o和cao。在一些实施方案中，按照摩尔百分比的次序，玻璃包含sio2、b2o3、al2o3、k2o、cao和zno。在一些实施方案中，除了sio2以外，玻璃还可以包含b2o3(0-30%)、al2o3(0-20%)、cao(0-20%)、bao(0-10%)、k2o(0-20%)、na2o(0-20%)、mgo(0-18%)、pb2o3(0-15%)、zno(0-6%)。在一些实施方案中，玻璃包含约70-75%sio2、约14-16%b2o3、约4-6%al2o3、约4-5%k2o、约2-3%cao和约0-5%zno。用于本公开的方法的适当的mgp是商业可得的，例如在来自roche的magnapure和cobas®4800样品制备试剂盒。核酸在离液序列高的溶液中结合mgp。离液序列高的溶液可以包括硫氰酸胍(guscn)、盐酸胍、尿素、亚碘酸钠、高氯酸钠、硫氰酸根离子、碘离子、高氯酸根离子、硝酸根离子、溴离子、乙酸根离子、氯离子、氟离子或硫离子或其组合。在一些实施方案中，离液剂以约1-10m(例如，2-8或4-6m)在溶液中，以允许核酸结合。作为测定的一部分的施加和移除磁场的方法和仪器是本领域技术人员已知的并且在文献中报道。实例包括美国专利号4,141,687和4,115,534以及vlieger等人,analyticalbiochemistry205:1-7(1992)。可以使用能够使用mgp实施磁性分离的任何仪器。取决于装置，可以在多容器盒或板中或在单个容器中处理样品。用于自动化仪器的容器(例如，处理试管或孔)通常盛放50µl至4ml(更通常1-2ml)的液体体积。可以用于使本文公开的方法自动化的仪器的实例包括但不限于magnapure仪器(roche)、dynamag®仪器(thermofisher)qiasymphony®系统(qiagen)、biomek®系统(beckman)和maxwell®仪器(promega)。v.下游处理和检测通常在分析之前从珠粒洗脱核酸，尽管mgp与一些测定相容(例如，与mgp上的核酸杂交的标记的探针的检测，pcr，或其中洗脱作为测定的部分发生，诸如southern印迹)。如同本领域技术人员会理解，洗脱条件干扰核酸与mgp的非共价(例如，离液序列高的或离子的)相互作用，例如，水，(与用于使核酸结合mgp的浓度相比)具有更低离液剂浓度的缓冲液和/或升高的温度。术语“洗脱物”是指在溶液中从固体支持物或其他分离基质释放的期望的分析物(例如，核酸)。纯化的核酸样品可以用于检测，例如，使用下一代测序、微阵列(rna或dna)、southern或northern印迹或核酸扩增，例如，使用任何引物依赖性的方法。基于dna的方法可以用于扩增和检测，例如，pcr。在一些实施方案中，使用实时或定量pcr(rtpcr或qpcr)。qpcr允许可靠地检测和测量在pcr过程的每个循环中产生的产物。此类技术是本领域众所周知的，且试剂盒和试剂是商购可得的，例如，来自rochemolecularsystems、lifetechnologies、bio-rad等。参见例如，pfaffl(2010)methods:theongoingevolutionofqpcr,vol.50。在一些实施方案中，支链引物-探针的探针部分被用猝灭剂和荧光团双重标记(例如，taqman、cpt、lna或mgb探针)(参见，例如，gasparic等人(2010)anal.bioanal.chem.396:2023)。在一些实施方案中，实施初步的逆转录步骤(也被称作rt-pcr，不与实时pcr混淆)。参见，例如，hierro等人(2006)72:7148。如本文所用，术语“qrt-pcr”是指逆转录随后为定量pcr。两个反应可以在单个管中且无间断(例如，以添加试剂)地实施。例如，可以使用聚t引物来逆转录样品中所有具有聚a尾的mrna，或者可以设计对将逆转录成cdna的特定靶转录物特异性的引物。还可以使用额外的基于rna的扩增方法，例如，基于核酸序列的扩增(nasba)或转录介导的扩增(tma)。检测装置是本领域已知的，且可以选择为对于选定的标记物适当的。适合于定量pcr的检测装置包括cobas®和lightcycler®系统(roche)、prism7000和7300实时pcr系统(appliedbiosystems)等。结果可以以阈值循环数(缩写为ct、cq或cp)的方式表示。较低的ct值反映了快速达到预定的阈值水平，例如，因为更高的靶核酸浓度或更有效的扩增。较高的ct值可以反映较低的靶核酸浓度，或无效的或受抑制的扩增。通常将阈值循环数选择成在给定靶标的扩增的线性范围内。在一些实施方案中，将ct设定为生长信号超过预定义的阈值线(例如，与基线有关)时的循环数(ct)，或通过确定生长曲线的二阶导数的最大值(cp)而设定。因为ct和cp值通常是相当接近的，所以它们经常可互换使用。ct/cq/cp的确定是本领域已知的，且描述在例如bustin等人(2009)clin.chem.55:4(描述miqe指南)和美国专利号7,363,168中。额外技术包括定量，例如使用qubit(thermofisher)或agilentbioanalyzer，和测序，例如下一代测序(ngs)技术。某些ngs技术依赖于平末端衔接子与双链dna片段的连接。这些衔接子可以进而连接至具有已知序列的衔接子，以允许序列特异性引发和扩增/测序(参见，例如，poptsova等人(2014)nature)。实例包括illumina基因组dna样品制备、roche454文库制备和lifesolid文库制备。为了使样品中具有5'磷酸平末端的dsdna片段的百分比最大化，可以使用修复试剂盒，例如mclabfragmenteddnaendrepairkit。vi.试剂盒在一些实施方案中，用于实施本发明公开的方法的试剂和材料包含在试剂盒中。在一些实施方案中，试剂盒包含结合核酸的mgp、一种或多种结合缓冲液、一种或多种洗涤缓冲液、和洗脱缓冲液。在一些实施方案中，结合缓冲液包含离液剂、去污剂和ph缓冲剂(例如，tris、mops、hepes、pipes或涉及柠檬酸盐、硼酸盐、乙酸盐等的缓冲系统)。任选地，结合缓冲液包含至少一种盐、异丙醇和/或蛋白酶k。可以根据样品中核酸的浓度和大小调整结合缓冲液。类似地，洗涤缓冲液通常具有离液剂、去污剂和ph缓冲剂，并且可以根据样品中非期望物质的预期量而变化。如果使用多于一种洗涤缓冲液，则后来的洗涤缓冲液可以具有较低浓度的此类组分，使得洗脱将更有效，且洗脱物将不具有高浓度的离液剂、去污剂、盐等，其可能干扰下游分析。洗脱缓冲液通常具有最少的成分，使得洗脱物可以直接用于分析(例如，扩增或测序)。例如，洗脱缓冲液可以包含ph缓冲剂和/或至少一种盐。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含至少一种对照，例如，已知大小和浓度的核酸片段。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含消耗品，例如，用于核酸制备的板或管、用于样品收集的管等。在一些实施方案中，试剂盒还包含使用说明书、对网站的提及或软件。vii.实施例与来自正常非癌症个体的血浆相比，在癌症患者的血浆中观察到更高的cfna水平。另外，与正常血浆相比，在约50-1000bp范围内的短多核苷酸通常在来自癌症患者的血浆中普遍得多。这些cfna可用于诊断技术，例如以检测疾病相关突变、遗传变体或基因表达水平，以及用于产前遗传测试。磁性玻璃珠粒(mgp)提供了以自动化方式纯化核酸的便利方法。设计自动化工作流程并应用于使用rochemgp回收小dna片段，特别是双链cfna。本发明公开的方法和组合物可以与类似的核酸制备试剂例如提供离液序列高的条件的裂解或结合缓冲液和利用boom技术的mgp(参见，例如，美国专利号6,562,569和boom(1990)j.clin.microbiol.28:495)一起使用。实施例1回收最大量的与mgp结合的核酸，而不破坏双链核酸的杂交。目前的洗脱方法在升高的温度(例如，90-100℃)下实施，以确保核酸与mgp完全解离。双链核酸在此类升高的温度下变性或变成单链。对于较短的核酸诸如cfna(其可以具有低至约60℃的解链温度)，这尤其如此。由于某些下游分析技术需要双链核酸，所以通过降低洗脱温度来保留双链核酸的杂交。将掺有已知浓度、大小和序列的dsdna的血浆用于分析。已知序列是gusb(葡糖醛酸糖苷酶β；86bp靶序列)和pbgd(胆色素原脱氨酶；150bp靶序列)。所使用的血浆从孕妇合并，且因此含有来自妇女的cfna，以及来自其胎儿的一些cfna。此外，选择内源性、cfna特异性靶序列用于分析：line序列(在基因组dna中以不同拷贝数存在，并且充当cfna中dna的标志物)，和149bpdyz(胎儿来源的y染色体序列，当存在于女性血浆中时，其表明她的cfna中的男性胎儿dna)。对于内源性靶标，精确浓度未知。对于line，计算的产率可用于比较来自相同起始材料(例如，血浆)的相对产率，但不是绝对定量。所述程序在magnapure96仪器和正在开发的类似但较小的仪器上实施，其差异导致相当的结果。例如，将血浆与结合缓冲液(离液剂、去污剂、蛋白酶k和异丙醇)以约1:1(范围为5:1-1:5)添加至mgp。结合在25℃、37℃和45℃下实施4-8分钟。在一些情况下，将掺料血浆的多个等份试样添加至mgp以增加捕获的cfna的量。使用磁场将mgp与未结合的材料分离，随后通过在洗涤缓冲液中移液来重悬浮。实施几次(2-5次)缺乏蛋白酶k且具有递减量的去污剂和盐的洗涤。一旦洗涤mgp，通过使用一次洗脱或两次洗脱(两者均在低温下实施)来洗脱dsdna。一次或多次洗脱在低于50℃(25℃-45℃)下实施，每次持续5-30分钟。使用特异性扩增和检测每种靶标的引物和探针在lightcycler®480上使用qpcr扩增和检测每种靶标。使用cp值与已知标准品比较来计算百分比回收率或产率。对于已知靶标，对照是用掺入血浆样品中该靶标的总量实施的扩增，所以可以按照百分比回收率表示。对于内源性靶标，可以基于已知量的对照靶序列的扩增来外推回收的量[ng]。代表性结果显示于下表1中。表1掺料的靶标单一洗脱产率[%]双重洗脱产率[%]双重洗脱产率[%]gusb52.971.269.2pbgd40.154.7n/d内源性靶标单一洗脱产量[ng]双重洗脱产量[ng]双重洗脱产量[ng]end6.3011.799.68dyz0.260.360.33结果显示双重洗脱有效地产生显著更高量的cfna。因为洗脱在低温下实施，所以维持样品中的dsdna的配对结构，使其可用于下游分析。实施例2测定来自单一高温洗脱的双链dna的产量，并将其与双重低温洗脱进行比较。方法基本上与实施例1中相同。合并的血浆掺入已知量的含有g6pd靶序列的150bp的双链dna。在rochemagnapure96上，使用单一高温洗脱(范围为90至96℃)、或双重低温洗脱(范围为30至47℃)，从血浆纯化核酸。使用thermofisherquant-itpicogreendsdna测定试剂盒(以检测双链dna)、lineqpcr(总内源性单链或双链dna)或g6pdqpcr(总掺料的单链或双链dna)评估所得洗脱物的产量/回收率。结果显示于表2中。表2定量方法(单位)高温单一洗脱低温双重洗脱qpcrline[ng]10.811.3qpcrg6pd[%回收率]87.565.5picogreendsdna测定[ng]4.131.2数据显示，尽管无论使用的洗脱条件如何，dna的总体回收率都相同，但在高温条件下，双链状态的dna的回收率大大降低。再次，line结果可用于比较使用相同样品合并物的条件，但不反映绝对dna产量。g6pd150bp片段的回收率与表1中对于双重洗脱所示的数据一致，尽管从单一高温洗脱稍微降低。然而，picogreendsdna测定结果显示，在降低温度双重洗脱中，双链dna的产量大大增加。当前第1页12