用于评估免疫应答的组合物和方法与流程

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背景技术：
：癌症免疫疗法的进展已经开始在肿瘤学中提供有希望的结果。与常规或靶向治疗相比，免疫检查点抑制剂、癌症疫苗和t细胞疗法在响应性群体中显示出可持续的结果。然而，有效识别响应候选者和/或监测响应已证明具有挑战性。急需更好地了解肿瘤微环境、肿瘤-淋巴细胞相互作用和药物反应生物标志物。特别地，例如，虽然已经报道pd-l1的存在是预测对抗pd-l1疗法的阳性反应的有希望的标志物，但是使用免疫组织化学来测量pd-l1蛋白水平的当前方法是低效且高度可变的。更高吞吐量、系统化和标准化的解决方案是更理想的替代方案。技术实现要素：在本发明的一个方面，提供用于单流多重确定样品中的免疫应答的组合物。在一些实施方案中，所述组合物由多个引物对试剂组成，所述引物对试剂针对多个靶序列以测量样品中靶标的表达水平。提供的组合物靶向免疫应答基因和持家基因序列，其中多个免疫应答靶基因序列选自以下功能中的靶：检查点途径、t细胞相关信号传导途径、肿瘤浸润淋巴细胞(til)的标志物、肿瘤标志物和持家基因。在一些实施方案中，所述多个免疫应答靶基因选自以下的靶：免疫检查点途径和靶标；t细胞和b细胞信号传导基因、淋巴细胞亚群标志物、干扰素信号传导基因、细胞因子信号传导基因；肿瘤标志物、肿瘤抗原和增殖标志物。在特定实施方案中，提供的组合物包括选自表2的多种引物对试剂。在一些实施方案中，提供了包含本发明组合物的多重测定。在一些实施方案中，提供了包含本发明组合物的测试试剂盒。在本发明的另一方面，提供了用于确定生物样品中的免疫应答活性的方法。此类方法包括从含有靶序列的生物样品中进行多个靶表达序列的多重扩增。扩增包括在扩增条件下在聚合酶存在下使用多个靶特异性引物对接触包含多个目标靶序列的至少一部分样品，以产生多个扩增的靶表达序列。该方法还包括检测多个靶免疫应答序列中的每一个的表达水平，其中与对照样品相比，一种或多种靶免疫应答标志物的表达水平的变化确定了样品中免疫应答活性的变化。本文描述的方法使用本文提供的本发明的组合物。附图说明并入到说明书中且形成说明书的一部分的随附图式说明一个或多个示例性实施例且用以解释各个示例性实施例的原理。图式仅是示例性和解释性的，且不应理解为以任何方式限制或约束。图1描绘了免疫应答研究测定的示例性可重复性结果。免疫应答测定在nsclc、黑色素瘤和正常肝组织的ffpe研究样品的重复之间产生的相关性大于0.98。图2a-2c描绘了免疫应答测定确定检测限度和动态范围的示例性结果：图2a描绘单独地测量的hl-60和人肺总rna的样品的比率，以及在4种不同的比率下混合以评估动态范围；图2b描绘了纯的和混合的样品之间倍数变化的相关性的示例性结果；以及图2c描绘了在纯的和混合的样品之间的倍数变化的等级序列(rankorder)的相关性的示例性结果。图3描绘了定量rt-pcr检测与本发明的免疫应答ngs测定之间的相关性的示例性结果。选择了22个基因，并在nsclc和黑色素瘤ffpe样品中通过定量rt-pcr进行了测试。结果表明定量rt-pcr和ngs之间的相关性为0.85至0.95。图4描绘了新鲜冷冻和ffpe样品之间的相关性的示例性结果。nsclc新鲜冷冻和ffpe样品显示大于0.96的相关性。图5a-5d描绘了免疫应答测定的示例性结果。图5a是基因表达分布图；图5b是描述持家基因表达的条形图；图5c是样品相关性热图；图5d描绘了测试样品的两个主成分分析的结果。图6描绘了免疫应答测定的样品相关性的示例性结果。图7描绘了免疫应答测定的所有靶标的示例性热图结果。图8描绘了应用来测量基因表达和计算倍数变化的模拟cpm归一化的结果。使用内源性对照准确估计倍数变化，因为虽然大多数基因在样品之间不变，但倍数变化估计可忽略不计；然而，当许多基因发生变化时，倍数变化估计非常不准确。图9a-b描绘了表明持家基因控制允许更好的表达估计的结果。图9a描绘了各种基因中估计和真实表达的相关性的结果，包括仅由与白细胞抑制类别相关的5种基因进行的测定。假设只对白细胞抑制试验感兴趣，并且只使用那些基因，我们与真实表达没有获得高度相关性；添加白细胞迁移仅轻度有帮助(21个基因)；添加干性和肿瘤标志物(不相关的类别；27个基因)增加了相关性。然而，仅使用靶标和11个持家(hk)基因与包含非信息基因和真实表达一样有效。图9b描绘了比较hk归一化、cpm和没有持家基因的cpm的性能的结果，证明持家归一化随着表达降低而增加与真实表达的相关性。具体实施方式各种示例性实施方案的以下描述仅是示例性和说明性的，不应以任何方式解释为限制或限制性的。根据说明书和附图以及权利要求，本教导的其他实施方案、特征、目的和优点将显而易见。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。如本文所用，术语“包含(comprises/comprising)”、“包括(includes/including)”、“具有(has/having)”或其任何其它变化形式打算涵盖非排它性的包括。举例来说，包含一列特征的工艺、方法、物件或设备不一定仅限于那些特征，而是可包括没有明确列出或这类工艺、方法、物件或设备所固有的其它特征。另外，除非明确相反地陈述，否则“或”是指包括性的或而不是排它性的或。如本文中所使用，“扩增”或“扩增反应”和其派生词指用于将核酸分子(称为模板核酸分子)的至少一部分复写或复制到至少一个其它核酸分子中的任何作用或过程。其它核酸分子任选地包括与模板核酸分子的至少某一部分实质上一致或大体上互补的序列。模板核酸分子可以是单链或双链并且另一个核酸分子可以独立地是单链或双链。在一些实施方案中，扩增包括模板依赖性活体外酶催化反应，其用于制备核酸分子的至少某一部分的至少一个拷贝或制备与核酸分子的至少某一部分互补的核酸序列的至少一个拷贝。扩增任选地包括核酸分子的线性或指数复制。在一些实施方案中，使用等温条件进行这类扩增；在其它实施方案中，这类扩增可包括热循环。在一些实施方案中，扩增是多元扩增，其包括在单次扩增反应中同时扩增多个靶序列。至少一些靶序列可单次扩增反应中所包括的相同核酸分子或不同靶核酸分子上。在一些实施方案中，“扩增”包括单独或呈组合形式的基于dna和rna的核酸的至少某一部分的扩增。扩增反应可包括单链或双链核酸底物并且可进一步包括所属领域的一般技术人员已知的扩增方法中的任一种。在一些实施方案中，扩增反应包括聚合酶链反应(pcr)。如本文中所使用，“扩增条件”和其派生词指适用于扩增一个或多个核酸序列的条件。这类扩增可以是线性或指数的。在一些实施方案中，扩增条件可包括等温条件或可包括热循环条件，或等温和热循环条件的组合。在一些实施方案中，适用于扩增一个或多个核酸序列的条件包括聚合酶链反应(pcr)条件。通常，扩增条件指足以扩增核酸(如一个或多个靶序列)或扩增接合到一个或多个衔接子的经扩增的靶序列(例如衔接子接合的经扩增的靶序列)的反应混合物。扩增条件包括用于扩增或用于核酸合成的催化剂，例如聚合酶；与待扩增的核酸具有一定程度的互补性的引物；以及核苷酸，诸如脱氧核糖核苷酸三磷酸酯(dntp)，以促进与核酸杂交之后引物的延伸。扩增条件需要引物与核酸的杂交或粘接，引物的延伸和变性步骤，其中经延伸的引物与经历扩增的核酸序列分离。通常但未必，扩增条件可包括热循环，在一些实施方案中，扩增条件包括多个循环，其中重复粘接、延伸和分离步骤。通常，扩增条件包括阳离子，如mg++或mn++(例如mgcl2等)，并且还可以包括多种离子强度调节剂。如本文中所使用，“靶序列”或“目标靶序列”和其派生词指可根据本发明扩增或合成的任何单链或双链核酸序列，包括怀疑或预期样品中存在的任何核酸序列。在一些实施方案中，在添加靶特异性引物或附接衔接子之前，靶序列以双链形式存在并且包括待扩增或合成的具体核苷酸序列的至少一部分或其补体。靶序列可包括可与适用于扩增或合成反应的引物在聚合酶延伸之前杂交的核酸。在一些实施方案中，所述术语指核酸序列。其序列一致性、核苷酸的次序或位置由本发明的方法中的一种或多种测定。如本文中所定义，“样品”和其派生词以其最广泛含义使用并且包括任何怀疑包括目标的样品、培养物等。在一些实施方案中，样品包含cdna、rna、pna、lna、嵌合、杂交或多重形式的核酸。样品可包括任何含有一个或多个核酸的基于生物、临床、手术、农业、大气压或水生的样品。所述术语还包括任何经分离的核酸样品，例如表达rna、新鲜冷冻或福尔马林(formalin)固定的石蜡包埋的核酸样品。如本文中所使用，当关于两种或更多种组分使用时，“接触”和其派生词是指用于促进或实现参考组分的接近、靠近、混合物或共混而未必需要这类组分的物理接触的任何过程，并且包括含有所述参考组分中的任一种或多种的溶液的彼此混合。所提及的组分可以任何具体顺序或组合接触并且组分引述的具体顺序不具限制性。例如，“使a与b和c接触”包括其中a首先与b然后与c接触的实施方案，以及其中c与a然后与b接触的实施方案，以及其中a和c的混合物与b接触的实施方案，等等。此外，这种接触不一定要求接触过程的最终结果是包括所有提及组分的混合物，只要在接触过程中的某些时间点，所有提及组分同时存在或同时包含在同一混合物或溶液中。当待接触的一个或多个提及组分包括多个(例如，“使靶序列与多个靶特异性引物和聚合酶接触”)时，所述多个中的每个成员可以被视为接触过程的单个组分，使得接触可以包括多个中的任何一个或多个成员与多个中的任何其他成员和/或与任何其他提及组分以任何顺序或组合接触(例如，多个靶特异性引物中的一些但不是全部可以接触靶序列，然后是聚合酶，然后与多个靶特异性引物的其他成员接触)。如本文中所使用，术语“引物”和其派生物指可与相关靶序列杂交的任何多核苷酸。在一些实施方案中，引物也可以用于激活核酸合成。典型地，引物充当底物，其上可由聚合酶聚合核苷酸；然而，在一些实施方案中，引物可变得并入合成的核酸链中并且提供另一引物可杂交的位点以激活与所合成的核酸分子互补的新股的合成。引物可包含核苷酸或其类似物的任何组合，其可任选地连接以形成任何适合长度的线形聚合物。在一些实施方案中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。(在本发明中，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换地使用并且未必指示两个核苷酸之间长度的任何差异)。在一些实施方案中，引物是单链，但其也可以是双链。引物任选地天然产生，如在纯化的限制消化中，或可以合成方式产生。在一些实施方案中，当暴露于扩增或合成条件时，引物充当用于扩增或合成的起始点；这类扩增或合成可以模板依赖性方式进行并且任选地形成与至少一部分靶序列互补的引物延伸产物。例示性扩增或合成条件可包括使引物与多核苷酸模板(例如包括靶序列的模板)、核苷酸和诱导剂(如聚合酶)在适合的温度和ph值下接触，以诱导靶特异性引物的末端上核苷酸的聚合。如果是双链，在用于制备引物延伸产物之前，引物可任选地经处理以分离其各股。在一些实施方案中，引物是寡脱氧核苷酸或寡核糖核苷酸。在一些实施方案中，引物可包括一个或多个核苷酸类似物。靶特异性引物的确切长度和/或组成(包括序列)可影响许多特性，包括熔融温度(tm)、gc含量、次要结构的形成、重复核苷酸主结构、所预测的引物延伸产物的长度、跨越相关核酸分子的覆盖度的程度、单次扩增或合成反应中的引物数目、引物内是否存在核苷酸类似物或经修饰的核苷酸等。在一些实施方案中，引物可在扩增或合成反应内与相容的引物配对以形成由正向引物和反向引物组成的引物对。在一些实施方案中，引物对的正向引物包括基本上与核酸分子的一个股的至少一部分互补的序列，并且引物对中引物的反向引物包括基本上与所述股线的至少一部分一致的序列。在一些实施方案中，正向引物和反向引物能够与核酸双螺旋的相对股杂交。任选地，正向引物激活第一核酸链的合成，并且反向引物激活第二核酸链的合成，其中第一和第二股基本上彼此互补，或可杂交以形成双链核酸分子。在一些实施方案中，扩增或合成产物的一端由正向引物定义并且扩增或合成产物的另一端由反向引物定义。在一些实施方案中，当需要扩增或合成冗长引物延伸产物(如扩增外显子、编码区或基因)时，可产生若干引物对而非跨越所需长度以实现所述区域的足够扩增。在一些实施方案中，引物可包括一个或多个可裂解基团。在一些实施方案中，引物长度在约10到约60个核苷酸、约12到约50个核苷酸和约15到约40个核苷酸长度范围内。典型地，当在存在dntp和聚合酶的情况下暴露于扩增条件时，引物能够与相应的靶序列杂交并且进行引物延伸。在一些情况下，具体核苷酸序列或引物的一部分在扩增反应开始时已知或可通过本文所披露的方法中的一种或多种测定。在一些实施方案中，引物在引物内的一个或多个位置包括一个或多个可裂解基团。如本文中所使用，“靶特异性引物”和其派生物指单链或双链多核苷酸，通常是寡核苷酸，其包括至少一个与包括靶序列的核酸分子的至少一部分至少50％互补，通常至少75％互补或至少85％互补，更通常至少90％互补，更通常至少95％互补，更通常至少98％或至少99％互补或一致的序列。在这类情况下，靶特异性引物和靶序列描述成彼此“相应”。在一些实施方案中，靶特异性引物能够与其相应靶序列的至少一部分(或靶序列的补体)杂交；这类杂交可任选地在标准杂交条件下或在严格杂交条件下进行。在一些实施方案中，靶特异性引物不能与靶序列或其补体杂交，但能够与包括靶序列的核酸链的一部分或其补体杂交。在一些实施方案中，靶特异性引物包括至少一个与靶序列本身的至少一部分至少75％互补，通常至少85％互补，更通常至少90％互补，更通常至少95％互补，更通常至少98％互补或更通常至少99％互补的序列；在其它实施例中，靶特异性引物包括至少一个与除靶序列以外的核酸分子的至少一部分至少75％互补，通常至少85％互补，更通常至少90％互补，更通常至少95％互补，更通常至少98％互补或更通常至少99％互补的序列。在一些实施方案中，靶特异性引物基本上不与样品中的其它靶序列互补；任选地，靶特异性引物基本上不与样品中的其它核酸分子互补。在一些实施方案中，样品中不包括或对应于靶序列(或靶序列的补体)的核酸分子称为“非特异性”序列或“非特异性核酸”。在一些实施方案中，靶特异性引物经设计以包括基本上与其相应靶序列的至少一部分互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，靶特异性引物与包括其相应靶序列的核酸分子的至少一部分至少95％互补或至少99％互补或一致(跨越其全部长度)。在一些实施方案中，靶特异性引物可与其相应靶序列的至少一部分至少90％、至少95％互补、至少98％互补或至少99％互补或一致(跨越其全部长度)。在一些实施方案中，正向靶特异性引物和反向靶特异性引物定义靶特异性引物对，其可用于经由模板依赖性引物延伸来扩增靶序列。通常，靶特异性引物对中的每个引物包括至少一个与包括相应靶序列的核酸分子的至少一部分基本上互补，但与样品中的至少一个其它靶序列小于50％互补的序列。在一些实施方案中，扩增可在单次扩增反应中使用多个靶特异性引物对进行，其中每个引物对包括正向靶特异性引物和反向靶特异性引物，各自包括至少一个与样品中的相应靶序列基本上互补或基本上一致的序列，并且每个引物对具有不同的相应靶序列。在一些实施方案中，靶特异性引物可在其3'端或其5'端与扩增反应中的任何其它靶特异性引物是基本上非互补性。在一些实施方案中，靶特异性引物可包括扩增反应中与其它靶特异性引物的最小交叉杂交。在一些实施方案中，靶特异性引物包括与扩增反应混合物中非特异性序列的最小交叉杂交。在一些实施方案中，靶特异性引物包括最小自身互补性。在一些实施方案中，靶特异性引物可包括位于3'端的一个或多个可裂解基团。在一些实施方案中，靶特异性引物可包括位于靶特异性引物的中心核苷酸附近或周围的一个或多个可裂解基团。在一些实施方案中，更多个靶特异性引物中的一个仅包括靶特异性引物的5'端处的非可裂解核苷酸。在一些实施方案中，任选地在相同扩增反应中，与一个或多个不同靶特异性引物相比，靶特异性引物包括引物的3'端或5'端处的最小核苷酸序列重叠。在一些实施方案中，单一反应混合物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种靶特异性引物包括以上实施例中的一个或多个。在一些实施方案中，单一反应混合物中基本上所有的多种靶特异性引物包括以上实施例中的一个或多个。如本文中使用，“聚合酶”和其派生词指可催化核苷酸(包括其类似物)聚合成核酸链的任何酶。典型地但未必，这类核苷酸聚合可以模板依赖性方式进行。这类聚合酶可以包括(但不限于)天然存在的聚合酶和其任何子单元和截断、突变聚合酶、变异聚合酶、重组、融合或以其它方式工程改造的聚合酶、经化学修饰的聚合酶、合成分子或组件以及保留催化这类聚合的能力的任何类似物、衍生物或其片段。任选地，聚合酶可以是包含一个或多个突变的突变型聚合酶，所述突变涉及用其它氨基酸替换一个或多个氨基酸，来自聚合酶的一个或多个氨基酸的插入或缺失或两个或更多个聚合酶的部分的连接。典型地，聚合酶包含可以进行核苷酸结合和/或核苷酸聚合催化的一个或多个活性位点。一些例示性聚合酶包括(但不限于)dna聚合酶和rna聚合酶。如本文中所使用，术语“聚合酶”和其变化形式也指包含至少两个彼此连接的部分的融合蛋白，其中第一部分包含可以催化核苷酸聚合成核酸链的肽并且所述第一部分连接到包含第二多肽的第二部分。在一些实施方案中，第二多肽可以包括报导子酶或增强持续合成能力的结构域。任选地，聚合酶可具有5'外切核酸酶活性或末端转移酶活性。在一些实施方案中，聚合酶可任选地再活化，例如通过使用热、化学物质或将新的量的聚合酶再添加到反应混合物中。在一些实施方案中，聚合酶可包括可任选地再活化的热起始聚合酶或基于适体的聚合酶。如本文中使用，术语“核苷酸”和其派生词包含任何可选择性结合于聚合酶或可通过聚合酶聚合的化合物，包括(但不限于)任何天然存在的核苷酸或其类似物。典型地但未必，核苷酸与聚合酶的选择性结合后面是核苷酸通过聚合酶聚合成核酸链；然而偶尔，核苷酸可从聚合酶解离而不变得掺入到核酸链中，这是在本文中被称为“非生产性”事件的事件。这类核苷酸不仅包括天然存在的核苷酸，而且包括可以与聚合酶选择性结合或可以通过聚合酶聚合的任何类似物(与其结构无关)。虽然天然存在的核苷酸典型地包含碱基、糖和磷酸酯部分，但本发明的核苷酸可以包括不具有这类部分中的任一个、一些或全部的化合物。在一些实施方案中，核苷酸可以任选地包括包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个磷原子的磷原子链。在一些实施方案中，磷链可以附接到糖环的任何碳，如5’碳。磷链可以用插入的o或s连接到糖。在一个实施方案中，链中的一个或多个磷原子可以是具有p和o的磷酸基的一部分。在另一个实施例中，链中的磷原子可以用插入的o、nh、s、亚甲基、经取代的亚甲基、亚乙基、经取代的亚乙基、cnh2、c(o)、c(ch2)、ch2ch2或c(oh)ch2r(其中r可以是4-吡啶或1-咪唑)连接在一起。在一个实施方案中，链中的磷原子可具有含o、bh3或s的侧基。在磷链中，具有除o以外的侧基的磷原子可以是经取代的磷酸基。在磷链中，具有除o以外的插入原子的磷原子可以是经取代的磷酸基。核苷酸类似物的一些实例描述于xu的美国专利第7,405,281号中。在一些实施方案中，核苷酸包含标记并且在本文中称为“经标记的核苷酸”；经标记的核苷酸的标记在本文中称为“核苷酸标记”。在一些实施方案中，标记可呈连接到末端磷酸基(即距离糖最远的磷酸基)的荧光染料形式。可以用于所公开的方法和组合物中的核苷酸的一些实例包括(但不限于)核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸聚磷酸、脱氧核糖核苷酸聚磷酸、经修饰的核糖核苷酸聚磷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸聚磷酸、肽核苷酸、经修饰的肽核苷酸、金属核苷酸、膦酸核苷和经修饰的磷酸-糖主链核苷酸，前述化合物的类似物、衍生物或变异体等。在一些实施方案中，核苷酸可包含非氧部分(如硫基或硼烷部分)代替氧部分，所述氧部分桥连核苷酸的α磷酸酯与糖、或核苷酸的α与β磷酸酯、或核苷酸的β与γ磷酸酯、或核苷酸的任何其它两种磷酸酯之间、或其任何组合。“核苷酸5'-三磷酸”指在5'位置具有三磷酸酯基并且有时表示为“ntp”或“dntp”和“ddntp”以具体指出核糖的结构特征的核苷酸。三磷酸酯基可包括多个氧的硫取代，例如α-硫基-核苷酸5'-三磷酸酯。关于核酸化学的综述，参见：shabarova,z.和bogdanov,a.,《核酸的高级有机化学(advancedorganicchemistryofnucleicacids)》,vch,newyork,1994。如本文中所使用，当关于既定引物使用时，术语“延伸”和其派生词包含涉及一个或多个核苷酸在现有核酸分子的末端上的聚合的既定聚合酶的任何体内或体外酶促活性特征。典型地但未必，这类引物延伸以模板依赖性方式进行；在模板依赖性延伸期间，通过既定碱基配对规则进行碱基的排序和选择，所述规则可包括沃森-克里克型碱基配对规则，或(并且尤其在涉及核苷酸类似物的延伸反应的情况下)通过一些其它类型的碱基配对范例进行。在一个非限制性实例中，延伸通过聚合酶经由核酸分子的3'oh端上核苷酸的聚合进行。如本文所用，术语“部分”及其派生词，当用于提及给定的核酸分子例如引物或模板核酸分子时，在核酸分子的长度(包括核酸分子的部分或全部长度)内包含任何数目的连续核苷酸。如本文所用，术语“同一性”和“相同的”及其派生词，当用于提及两个或更多个核酸序列时，是指两个或更多个序列(例如，核苷酸或多肽序列)的序列相似性。在两个或更多个同源序列的背景下，序列或其子序列的百分比同一性或同源性表示相同的所有单体单元(例如，核苷酸或氨基酸)的百分比(即，约70％同一性，优选75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)。当比较并对齐以在比较窗口上进行最大对应，或者使用具有下述默认参数的blast或blast2.0序列比较算法或通过手动对齐和目视检查测量的指定区域时，百分比同一性可以在整个指定区域上。当在氨基酸水平或核苷酸水平上具有至少85％的同一性时，序列被称为“基本相同”。优选地，同一性存在于长度为至少约25、50或100个残基的区域上，或者在至少一个比较序列的整个长度上。确定序列一致性百分比和序列相似性的典型算法的实例是blast算法和blast2.0算法，其分别描述于altschul等人nuc.acidsres.25:3389-3402(1977)。其他方法包括smith&waterman，adv.appl.math.2:482(1981)和needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)等的算法。两个核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或它们的互补序列在严格条件下彼此杂交。如本文中所使用，术语“互补”和“补体”以及其派生词指可在反平行定向(如在杂交双螺旋中)的两个或更多个个别相应位置经历累积碱基配对的任何两个或更多个核酸序列(例如部分或全部模板核酸分子、靶序列及/或引物)。这类碱基配对可根据任何现有规则集合进行，例如根据沃森-克里克碱基配对规则(watson-crickbasepairingrules)或根据一些其它碱基配对范例。任选地，第一与第二核酸序列之间可以存在“完全”或“总体”互补性，其中第一核酸序列中的每个核苷酸可以经历与第二核酸序列上的相应的反平行位置中的核苷酸的稳定化碱基配对相互作用。“部分”互补性描述一个核酸序列的至少20％但少于100％的残基与另一个核酸序列残基互补的核酸序列。在一些实施方案中，一个核酸序列的至少50％但少于100％的残基与另一个核酸序列中的残基互补。在一些实施方案中，一个核酸序列的至少70％、80％、90％、95％或98％但少于100％的残基与另一个核酸序列中的残基互补。当一个核酸序列的至少85％的残基与另一个核酸序列中的残基互补时，序列被称为“基本上互补”。在一些实施方案中，两个互补或基本上互补序列能够在标准或严格杂交条件下彼此杂交。“非互补”描述其中一个核酸序列的少于20％的残基与另一个核酸序列中的残基互补的核酸序列。当一个核酸序列的少于15％的残基与另一个核酸序列中的残基互补时，序列被称为“基本上非互补”。在一些实施方案中，两个非互补或基本上非互补序列无法在标准或严格杂交条件下彼此杂交。“错配”存在于不互补的两个相对核苷酸中的任何位置。互补核苷酸包括在生理条件下在dna复制期间通过与彼此相对的dna聚合酶有效并入的核苷酸。在典型实施方案中，在彼此位于反平行位置的核苷酸及/或多核苷酸的核碱基之间，互补核苷酸可彼此形成碱基对，如通过特异性沃森-克里克型氢键形成的a-t/u和g-c碱基对，或通过某种其它类型的碱基配对范例形成的碱基对。其它人工碱基对的互补性可以是基于其它类型的氢键和/或碱基的疏水性和/或碱基之间的形状互补性。如本文所用，“扩增的靶序列”及其衍生物是指通过使用靶特异性引物和本文提供的方法扩增/扩增靶序列而产生的核酸序列。扩增的靶序列可以是关于靶序列相同的有义(在第二轮和随后的偶数轮扩增中产生的正链)或反义(即在第一轮和随后的奇数轮扩增期间产生的负链)。出于本公开的目的，扩增的靶序列通常与反应中另一扩增的靶序列的任何部分互补小于50％。如本文中所使用，术语“接合”和其派生词指用于将两个或更多个分子共价连接在一起(例如使两个或更多个核酸分子彼此共价连接)的动作或方法。在一些实施方案中，接合包括核酸的相邻核苷酸之间的结合口。在一些实施方案中，接合包括形成第一核酸分子的末端与第二核酸分子的末端之间的共价键。在一些实施方案中，例如其中待接合的核酸分子包括常规核苷酸残基的实施例，接合可包括形成一个核酸的5'磷酸基与第二核酸的3'羟基之间的共价键，从而形成经接合的核酸分子。在一些实施方案中，可使用任何用于在相邻核苷酸之间使5'磷酸与3'羟基接合或结合的方法。在例示性实施方案中，可使用酶，如连接酶。出于本公开的目的，经扩增的靶序列可与衔接子接合以产生衔接子接合的经扩增的靶序列。如本文中所使用，“连接酶”和其派生词指任何能够催化两个底物分子的接合的试剂。在一些实施方案中，连接酶包括能够催化核酸的相邻核苷酸之间的接口的接合的酶。在一些实施方案中，连接酶包括能够催化一个核酸分子的5'磷酸与另一个核酸分子的3'羟基之间形成共价键，从而形成经接合的核酸分子的酶。适合的连接酶可包括(但不限于)t4dna连接酶、t4rna连接酶以及大肠杆菌(e.coli)dna连接酶。如本文所用，“连接条件”及其衍生物是指适合于将两个分子彼此连接的条件。在一些实施方案中，连接条件适合于密封核酸之间的切口或间隙。如本文所定义，“切口”或“间隙”是指在核酸序列的内部核苷酸内缺少单核苷酸戊糖环的5'磷酸直接与相邻单核苷酸戊糖环的3'羟基结合的核酸分子。如本文所用，术语切口或间隙与本领域术语的使用一致。通常，切口或间隙可以在适当的温度和ph下在酶例如连接酶的存在下连接。在一些实施方案中，t4dna连接酶可在约70-72℃的温度在核酸之间加入切口。如本文中所使用，“钝端连接”和其派生词指两个钝端双链核酸分子彼此连接。“钝端”指其中核酸分子的一个股的末端中的基本上所有核苷酸与同一个核酸分子的另一个股中的相对核苷酸碱基配对的双链核酸分子的末端。如果核酸分子具有包括长度超过两个核苷酸的单链部分的末端(本文中称为“悬垂物”)，那么其不是钝端的。在一些实施方案中，核酸分子的末端不包括任何单链部分，使得末端的一个股中的每个核苷酸与同一个核酸分子的另一个股中的相对核苷酸碱基配对。在一些实施方案中，变成彼此接合的两个钝端核酸分子的末端不包括任何重叠、共有或互补序列。通常，钝端接合不包括使用其它寡核苷酸衔接子帮助双链经扩增的靶序列与双链衔接子的接合，如2010年5月27日公开的mitra和varley,us2010/0129874中所描述的补丁寡核苷酸。在一些实施方案中，钝端接合包括接口平移反应以密封在接合过程期间产生的接口。如本文中所使用，术语“衔接子”或“衔接子和其补体”以及其派生词指任何可与本发明的核酸分子接合的线形寡核苷酸。任选地，衔接子包括基本上不与样品内至少一个靶序列的3'端或5'端互补的核酸序列。在一些实施方案中，衔接子基本上不与样品中任何靶序列的3'端或5'端互补。在一些实施方案中，衔接子包括任何基本上不与经扩增的靶序列互补的单链或双链线形寡核苷酸。在一些实施方案中，衔接子基本上不与样品的至少一个、一些或全部核酸分子互补。在一些实施方案中，适合的衔接子长度在约10-100个核苷酸、约12-60个核苷酸和约15-50个核苷酸长度范围内。衔接子可包括核苷酸和/或核酸的任何组合。在一些方面中，衔接子可在一个或多个位置包括一个或多个可裂解基团。在另一个方面中，衔接子可包括与引物(例如通用引物)的至少一部分基本上一致或基本上互补的序列。在一些实施方案中，衔接子可包括条码或标签以辅助下游编目、鉴别或测序。在一些实施方案中，当与经扩增的靶序列接合时，尤其在存在聚合酶和dntp的情况下在适合的温度和ph值下，单链衔接子可充当用于扩增的底物。如本文所用，“再扩增(reamplifying或reamplification)”及其衍生物是指通过任何合适的扩增过程进一步扩增至少一部分扩增的核酸分子的任何过程(在一些实施方案中称为“二级”扩增或“再扩增”)，从而产生再扩增的核酸分子。二级扩增不需要与产生扩增的核酸分子的原始扩增过程相同；也不需要再扩增的核酸分子与扩增的核酸分子完全相同或完全互补；所需要的只是再扩增的核酸分子包括至少一部分扩增的核酸分子或其互补物。例如，再扩增可涉及使用不同的扩增条件和/或不同的引物，包括与初级扩增不同的靶特异性引物。如本文中所定义，“可裂解基团”指在并入核酸后可在适当条件下裂解的任何部分。举例来说，可将可裂解基团并入样品的引物、经扩增的序列、衔接子或核酸分子中。在例示性实施例中，靶特异性引物可包括可裂解基团，其变成并入经扩增的产物中并且接着在扩增之后裂解，从而从经扩增的产物移除一部分或所有靶特异性引物。可裂解基团可裂解或以其它方式通过任何可接受的手段从样品的靶特异性引物、经扩增的序列、衔接子或核酸分子移除。举例来说，可通过酶促、热学、光氧化或化学处理从样品的靶特异性引物、经扩增的序列、衔接子或核酸分子移除可裂解基团。在一个方面中，可裂解基团可包括非天然存在的核碱基。举例来说，寡脱氧核苷酸可包括一个或多个rna核碱基，如可通过尿嘧啶糖基化酶移除的尿嘧啶。在一些实施方案中，可裂解基团可包括一个或多个经修饰的核碱基(如7-甲基鸟嘌呤、8-侧氧基-鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶或5-甲基胞嘧啶)或一个或多个经修饰的核苷(即，7-甲基鸟苷、8-侧氧基-脱氧鸟苷、黄苷、肌苷、二氢尿苷或5-甲基胞啶)。可通过酶促、化学或热学手段从核酸移除经修饰的核碱基或核苷酸。在一个实施方案中，可裂解基团可包括在暴露于紫外光(即，溴脱氧尿苷)时，可在扩增(或合成)之后从引物移除的部分。在另一实施方案中，可裂解基团可包括甲基化胞嘧啶。通常，甲基化胞嘧啶可由引物裂解，例如在诱导扩增(或合成)之后、在亚硫酸氢钠处理时。在一些实施方案中，可裂解部分可包括限制位点。举例来说，引物或靶序列可包括对一种或多种限制酶具有特异性的核酸序列，并且在扩增(或合成)之后，引物或靶序列可用一种或多种限制酶处理使得移除可裂解基团。通常，可在一个或多个位置包括一个或多个可裂解基团以及样品的靶特异性引物、经扩增的序列、衔接子或核酸分子。如本文所用，“裂解步骤”和其派生词是指可裂解基团从样品的靶特异性引物、经扩增的序列、衔接子或核酸分子裂解或以其它方式移除的任何过程。在一些实施方案中，裂解步骤可以涉及化学、热学、光氧化或消化过程。如本文中所使用，术语“杂交”符合其在所属领域中的用途，并且指用于使两个核酸分子经历碱基配对相互作用的方法。当一个核酸分子的任何部分与另一个核酸分子的任何部分碱基配对时，两个核酸分子分子称为杂交；未必需要两个核酸分子跨越其全部各别长度杂交并且在一些实施方案中，至少一个核酸分子可包括不与另一个核酸分子杂交的部分。短语“在严格条件下杂交”和其派生词指可在存在高杂交温度和低离子强度的条件下进行靶特异性引物与靶序列的杂交的条件。在一个例示性实施方案中，严格杂交条件包括在约60-68℃下含有约30mm硫酸镁、约300mmtris-硫酸盐(ph8.9)和约90mm硫酸铵的水性环境或其等效物。如本文中所使用，短语“标准杂交条件”和其派生词指可在存在低杂交温度和高离子强度的情况下进行引物与寡核苷酸(即，靶序列)的杂交的条件。在一个例示性实施方案中，标准杂交条件包括在约50-55℃下含有约100mm硫酸镁、约500mmtris-硫酸盐(ph8.9)和约200mm硫酸铵的水性环境或其等效物。如本文所用，“gc含量”及其衍生物是指核酸分子的胞嘧啶和鸟嘌呤含量。本公开的靶特异性引物(或衔接子)的gc含量为85％或更低。更典型地，本公开的靶特异性引物或衔接子的gc含量为15-85％。如本文中所使用，当关于核酸分子(例如靶序列或经扩增的靶序列)使用时，术语“末端”和其派生词可包括核酸分子的末端30个核苷酸、末端20和甚至更通常末端15个核苷酸。包含一连串相邻核苷酸的线形核酸分子通常包括至少两个末端。在一些实施方案中，核酸分子的一端可包括3’羟基或其等效物，并且可称为“3’端”和其衍生物。任选地，3'端包括未连接到单核苷酸戊糖环的5'磷酸基的3'羟基。典型地，3'端包括经定位与包括未连接的3'羟基的核苷酸相邻的一个或多个5'连接的核苷酸，通常经定位与3'羟基相邻的30个核苷酸，通常末端20个并且甚至更通常末端15个核苷酸。一个或多个连接的核苷酸可表示成寡核苷酸中存在的核苷酸的百分比，或可以与未连接的3'羟基相邻的许多连接的核苷酸形式提供。举例来说，3'端可占寡核苷酸的核苷酸长度的小于50％。在一些实施方案中，3'末端不包括任何未连接的3'羟基，但可包括任何能够充当核苷酸通过引物延伸和/或核苷酸聚合进行的连接的位点的部分。在一些实施方案中，例如当参考靶特异性引物时，术语“3'端”可包括3'端处的末端10个核苷酸、末端5个核苷酸、末端4、3、2或更少个核苷酸。在一些实施方案中，当参考靶特异性引物时，术语“3'端”可包括位于核苷酸位置10的核苷酸或更少的来自3'端的核苷酸。如本文中所使用，“5'端”和其派生词指核酸分子(例如靶序列或经扩增的靶序列)的末端，其包括自由5'磷酸基或其等效物。在一些实施方案中，5'端包括未连接到相邻单核苷酸戊糖环的3'羟基的5'磷酸基。通常，5'端包括经定位与5'磷酸相邻的一个或多个连接的核苷酸，通常经定位与包括5'磷酸基的核苷酸相邻的30个核苷酸，通常末端20个并且甚至更通常末端15个核苷酸。一个或多个连接的核苷酸可表示成寡核苷酸中存在的核苷酸的百分比，或可以与5'磷酸相邻的许多连接的核苷酸形式提供。举例来说，5'端可小于寡核苷酸的核苷酸长度的50％。在另一个例示性实施例中，5'端可包括与包括末端5'磷酸的核苷酸相邻的约15个核苷酸。在一些实施方案中，5'端不包括任何未连接的5'磷酸基，但可包括任何能够充当与3'羟基或另一个核酸分子的3'端的连接位点的部分。在一些实施方案中，例如当参考靶特异性引物时，术语“5'端”可包括5'端处的末端10个核苷酸、末端5个核苷酸、末端4、3、2或更少个核苷酸。在一些实施方案中，当参考靶特异性引物时，术语“5'端”可包括位于核苷酸位置10的核苷酸或更少的来自5'端的核苷酸。在一些实施方案中，靶特异性引物的5'端可仅包括非可裂解核苷酸，例如不含如本文中所披露的一个或多个可裂解基团的核苷酸，或可由所属领域的一般技术人员容易地测定的可裂解核苷酸。如本文中所使用，“dna条码”或“dna标记序列”和其派生词是指可充当‘用于区分或分离样品中多个经扩增的靶序列'的衔接子内的独特短(6-14个核苷酸)核酸序列。出于本发明的目的，dna条形码或dna标记序列可以并入衔接子的核苷酸序列中。如本文所用，短语“两轮靶特异性杂交”或“两轮靶特异性选择”及其衍生物是指相同靶序列经历两轮连续的基于杂交的靶特异性选择的任何过程，其中靶序列与靶特异性序列杂交。每轮基于杂交的靶特异性选择可以包括针对靶特异性序列的至少一些部分的多个靶特异性杂交。在一个示例性实施方案中，一轮靶特异性选择包括涉及靶序列的第一区域的第一靶特异性杂交和涉及靶序列的第二区域的第二靶特异性杂交。第一和第二区域可以相同或不同。在一些实施方案中，每轮基于杂交的靶特异性选择可包括使用两种靶特异性寡核苷酸(例如，正向靶特异性引物和反向靶特异性引物)，使得每轮选择包括两个靶特异性杂交。如本文所用，“可比较的最大最小解链温度”及其衍生词是指切割可切割基团后单个衔接子或靶特异性引物的每个核酸片段的解链温度(tm)。比较由单个衔接子或靶特异性引物产生的每个核酸片段的杂交温度，以确定防止靶特异性引物或衔接子的任何核酸片段与靶序列杂交所需的最大最小温度。一旦知道最大杂交温度，就可以操作衔接子或靶特异性引物，例如通过沿着引物的长度移动可切割基团的位置，以获得相对于每个核酸片段的可比较的最大最小解链温度。如本文所用，“仅添加”及其衍生词是指一系列步骤，其中将试剂和组分加入第一或单一反应混合物中。通常，该系列步骤不包括将反应混合物从第一容器移至第二容器以完成一系列步骤。仅添加过程不包括在含有反应混合物的容器外操作反应混合物。通常，仅添加过程适合自动化和高吞吐量。如本文所用，“合成”及其衍生词是指涉及聚合酶的核苷酸聚合的反应，任选地以模板依赖性方式。聚合酶通过将核苷一磷酸从核苷三磷酸(ntp)、脱氧核苷三磷酸(dntp)或双脱氧核苷三磷酸(ddntp)转移至延伸的寡核苷酸链的3'羟基来合成寡核苷酸。出于本公开的目的，合成包括通过从脱氧核苷三磷酸转移核苷一磷酸来连续延伸杂交的衔接子或靶特异性引物。如本文所用，“聚合条件”及其衍生词是指适合于核苷酸聚合的条件。在典型的实施方案中，这种核苷酸聚合由聚合酶催化。在一些实施方案中，聚合条件包括引物延伸的条件，任选地以模板依赖性方式，导致合成的核酸序列的产生。在一些实施方案中，聚合条件包括聚合酶链反应(pcr)。通常，聚合条件包括使用足以合成核酸的反应混合物，并包括聚合酶和核苷酸。聚合条件可包括使靶特异性引物与靶序列退火和在聚合酶存在下以模板依赖性方式延伸引物的条件。在一些实施方案中，可以使用热循环实施聚合条件。另外，聚合条件可包括多个循环，其中重复退火、延伸和分离两条核酸链的步骤。通常，聚合条件包括阳离子如mgcl2。一个或多个核苷酸的聚合以形成核酸链包括核苷酸通过磷酸二酯键彼此连接，然而，在特定核苷酸类似物的背景下，替代连接可能是可能的。如本文所用，术语“核酸”是指天然核酸、人工核酸、其类似物或其组合，其包括多核苷酸和寡核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指核苷酸的单链和双链聚合物，包括但不限于2'-脱氧核糖核苷酸(核酸)和核糖核苷酸(rna)，其通过核苷酸间磷酸二酯键接例如3'-5'和2'-5'、反向连接例如3'-3'和5'-5'、支链结构或类似物核酸连接。多核苷酸具有相关的抗衡离子，例如h+、nh4+、三烷基铵、mg2+、na+等。寡核苷酸可完全由脱氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或其嵌合混合物组成。寡核苷酸可由核碱基和糖类似物组成。当它们在本领域中更常被称为寡核苷酸时，多核苷酸的大小通常在几个单体单元的范围内，例如5-40，当它们在本领域中更常被称为多核苷酸时，到数千个单体核苷酸单元；然而，为了本公开的目的，寡核苷酸和多核苷酸都可以具有任何合适的长度。除非另外指出，否则每当呈现寡核苷酸序列时，都应了解，核苷酸从左到右是按5'到3'的顺序并且“a”表示脱氧腺苷，“c”表示脱氧胞苷，“g”表示脱氧鸟苷，“t”表示胸苷，并且“u”表示脱氧尿苷。寡核苷酸被称为具有“5'末端”和“3'末端”，因为单核苷酸通常通过将5'磷酸或一个核苷酸的等同基团连接到(任选地通过磷酸二酯或其他合适的键)其相邻核苷酸的3'羟基或等同基团而反应形成寡核苷酸。如本文所定义，术语“切口平移”及其派生词包括核酸链内的一个或多个切口或间隙易位至沿核酸链的新位置。在一些实施方案中，当双链衔接子与双链扩增的靶序列连接时，可以形成切口。在一个实例中，引物可在其5'末端包含磷酸基团，其可连接至双链扩增的靶序列，在衔接子和互补链中的扩增的靶序列之间留下切口。在一些实施方案中，切口平移导致切口移动到核酸链的3'末端。在一些实施方案中，移动切口可以包括在衔接子连接的扩增的靶序列上进行切口平移反应。在一些实施方案中，切口平移反应可以是偶联的5'至3'dna聚合/降解反应，或偶联至5'至3'dna聚合/链置换反应。在一些实施方案中，移动切口可包括在切口位点处进行dna链延伸反应。在一些实施方案中，移动切口可包括在切口上进行单链外切核酸酶反应以形成衔接子连接的扩增的靶序列的单链部分，并在衔接子连接的扩增的单链靶序列上进行dna链延伸反应至新位置。在一些实施方案中，在与连接位点相对的核酸链中形成切口。如本文所用，术语“聚合酶链式反应”(“pcr”)是指k.b.mullis美国专利4,683,195和4,683,202的方法，在此通过引用并入，其描述用于在不进行克隆或纯化的情况下增加基因组dna的混合物中相关多核苷酸的片段的浓度的方法。这种用于扩增相关多核苷酸的过程由以下组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入含有所需相关多核苷酸的dna混合物，接着是在dna聚合酶存在下热循环的精确序列。两种引物与相关双链多核苷酸的其相应股互补。为了实现扩增，使混合物变性，并且然后将引物粘接到相关多核苷酸分子内的其互补序列。在粘接之后，用聚合酶使引物延伸以形成一对新互补股。变性、引物粘接和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、粘接和延伸构成一个“循环”；可以存在众多“循环”)以获得所需相关多核苷酸的高浓度的扩增的片段。所需相关多核苷酸的扩增的片段(扩增子)的长度通过引物相对于彼此的相对位置测定，并且因此这一长度是可控制参数。借助于重复所述过程，所述方法被称为“聚合酶链反应”(在下文中“pcr”)。因为相关多核苷酸的所需扩增的片段变为混合物中的主要核酸序列(就浓度来说)，所以其被称为“pcr扩增的”。如本文中所定义，包括多种靶核酸分子的样品内的靶核酸分子经由pcr而扩增。在上文所论述的方法的一个改进中，靶核酸分子可以使用多种不同引物对、在一些情况下一种或多种引物对/相关标靶核酸分子而pcr扩增，由此形成多重pcr反应。使用多重pcr，有可能同时从样品扩增多种相关核酸分子以形成经扩增的靶序列。还可能通过数种不同方法(例如，用生物分析仪或qpcr定量，用经标记的探针杂交；并入生物素化的引物，接着进行抗生物素蛋白-酶结合物检测；将经32p标记的脱氧核苷酸三磷酸酯(例如dctp或datp)并入到经扩增的靶序列中)检测扩增的靶序列。任何寡核苷酸序列可用适合的引物集合扩增，从而实现靶核酸分子从rna、cdna、福马林固定的链烷烃嵌入型dna、细针穿刺活检(fine-needlebiopsies)和多种其它来源的扩增。具体来说，由如本文中所披露的多重pcr过程产生的经扩增的靶序列本身是用于后续pcr扩增或多种下游分析或操作的有效底物。如本文中所定义，“多重扩增”是指样品内的两种或更多种靶序列使用至少一种靶特异性引物的选择性并且非随机的扩增。在一些实施方案中，进行多重扩增，使得一些或全部靶序列在单一反应容器内扩增。既定多重扩增的“重数(plexy)”或“重(plex)”是指在所述单一多重扩增期间扩增的不同目标特异性序列的数目。在一些实施方案中，重数可以是约12重、24重、48重、74重、96重、120重、144重、168重、192重、216重、240重、264重、288重、312重、336重、360重、384重或398重。除非另外指出，否则本主题的实践可以采用在本领域的技能内的有机化学、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学和生物化学的常规技术和描述。这些常规技术包括但不限于合成多核苷酸的制备、聚合技术、聚合物颗粒的化学和物理分析、核酸文库的制备、核酸测序和分析等。合适技术的具体说明可以参看本文提供的实例使用。也可以使用其它等效的常规程序。这些常规技术和描述可以在标准实验室手册中找到，例如genomeanalysis:alaboratorymanualseries(vols.i-iv),pcrprimer:alaboratorymanual,andmolecularcloning:alaboratorymanual(均来自coldspringharborlaboratorypress),hermanson,bioconjugatetechniques,第二版(academicpress,2008)；merkus,particlesizemeasurements(springer,2009)；rubinsteinandcolby,polymerphysics(oxforduniversitypress,2003)；等等。我们开发了多重下一代测序工艺流程，用于测量参与免疫应答的基因表达，例如检查点途径、t细胞相关信号传导途径、不同肿瘤浸润淋巴细胞(til)亚群的标志物和肿瘤标志物，以确定样品中的免疫应答。本发明的免疫应答测定组合物和方法为生物标记物筛选和理解与肿瘤免疫应答有关的机制提供了特异且稳健的解决方案。因此，提供了多重基因表达组合物，其用于多重文库制备，并与下一代测序技术和工艺流程解决方案(例如，iontorrenttmngs工艺流程)结合使用，手动或自动地，以评估保护肿瘤免受免疫应答的途径。因此，提供了用于单流多重确定样品中的免疫应答的组合物。在一些实施方案中，所述组合物由多组引物对试剂组成，所述引物对试剂针对多个靶序列以测量样品中靶标的表达水平，其中靶基因选自由以下功能组成的免疫应答基因：检查点途径、t细胞相关信号传导途径、肿瘤浸润淋巴细胞(til)标志物、肿瘤标志物和持家基因。在一些实施方案中，靶基因选自由表a的一个或多个功能组成的免疫应答基因。在一些实施方案中，所述靶基因选自以下功能的免疫应答基因：免疫检查点途径和靶标；t细胞和b细胞信号传导基因、淋巴细胞亚群标志物、干扰素信号传导基因、细胞因子信号传导基因；肿瘤标志物、肿瘤抗原和增殖标志物；和持家基因。在一些实施方案中，靶基因是从阐明t和b淋巴细胞的功能，从激活到抗原加工的免疫应答基因选择，包括，例如，由下列功能组成的基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞活化、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、b细胞受体信号传导、t细胞受体信号传导、t细胞调节和tcr共表达。在一些实施方案中，靶基因选自这样的免疫应答基因，其阐明炎症和活化以及辅助细胞的合作的水平，包括例如由以下功能组成的基因：趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、i型干扰素信号传导和ii型干扰素信号传导。在一些实施方案中，靶基因鉴定各种相关细胞类型的存在，包括例如选自由以下功能组成的免疫应答基因的基因：b细胞标志物、树突细胞、树突细胞/巨噬细胞、辅助t细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、nk激活、nk细胞和t细胞分化。在一些实施方案中，靶基因阐明了作用机制，包括例如选自由以下功能组成的免疫应答基因的基因：检查点途径、pd-信号传导和药物靶标。在一些实施方案中，靶基因证明肿瘤细胞的增殖活性和/或干性特征，包括例如选自由以下功能组成的免疫应答基因的基因：粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。总之，包含本发明提供的多重组的基因的各种功能提供了肿瘤微环境的复杂活性的全面图像。在一些实施方案中，免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、b细胞受体信号传导、t细胞受体信号传导、t细胞调节、tcr共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、i型干扰素信号传导、ii型干扰素信号传导、b细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助t细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、nk活化、nk细胞、t细胞分化、检查点途径、pd信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。表a：免疫应答基因在一些实施方案中，免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、b细胞受体信号传导、t细胞受体信号传导、t细胞调节、tcr共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、i型干扰素信号传导、ii型干扰素信号传导、b细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助t细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、nk活化、nk细胞、t细胞分化、检查点途径、pd信号传导和药物靶标。在一些实施方案中，免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、b细胞受体信号传导、t细胞受体信号传导、t细胞调节、tcr共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、i型干扰素信号传导、ii型干扰素信号传导、b细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助t细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、nk活化、nk细胞、t细胞分化、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、b细胞受体信号传导、t细胞受体信号传导、t细胞调节、tcr共表达、检查点途径、pd信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、b细胞受体信号传导、t细胞受体信号传导、t细胞调节、tcr共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、i型干扰素信号传导、ii型干扰素信号传导、b细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助t细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、nk活化、nk细胞、t细胞分化、检查点途径、pd信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：tcr共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、i型干扰素信号传导、ii型干扰素信号传导、b细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助t细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、nk活化、nk细胞、t细胞分化、检查点途径、pd信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在某些实施方案中，靶免疫应答序列针对具有与癌症相关的异常表达的序列。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种实体瘤癌相关的异常表达的序列，所述实体瘤癌选自头颈癌(例如，hnscc、鼻咽、唾液腺)，脑癌(例如，胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)，乳腺癌(例如，tnbc、曲妥珠单抗耐药的her2+乳腺癌、er+/her-乳腺癌)，妇科(例如，子宫、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌)，结肠直肠癌，胆囊癌，食道癌，胃肠癌，胃癌，膀胱癌，前列腺癌，睾丸癌，尿路上皮癌，肝癌(如肝细胞癌、hcc)，肺癌(如非小细胞肺、小细胞肺)，肾(肾细胞)癌，胰腺癌(如腺癌、导管)，甲状腺癌，胆管癌，垂体瘤，维尔姆斯肿瘤，卡波西肉瘤，毛细胞癌，骨肉瘤，胸腺癌，皮肤癌，黑色素瘤，心脏癌，口腔癌和喉癌，神经母细胞瘤，间皮瘤和其他实体瘤(胸腺、骨、软组织、口腔scc、骨髓纤维化、滑膜肉瘤)。在一个实施方案中，突变可包括取代、插入、反转、点突变、缺失、错配和易位。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种血液/血液癌相关的异常表达的序列，所述血液/血液癌选自多发性骨髓瘤，弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)，淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，白血病，急性髓性白血病(aml)，慢性淋巴细胞白血病(cll)，骨髓增生异常综合征。在一个实施方案中，与癌症相关的异常表达位于表1中提供的至少一种基因中。在一些实施方案中，一种或多种异常表达免疫应答序列位于选自以下的至少一种基因中：cd63、cd69、cxcl1、klrd1、hla-dob、cxcr5、il12b、ptk7、ceacam1、cxcl9、il13、nt5e、vegfa、abcf1、cd38、jaml、s100a8、myc、irf1、ccl22、cxcr2、ifit1、ifit2、cd68、m6pr、sh2d1a、isg20、gbp1、tbp、stat6、id3、cx3cl1、klrb1、tnfsf4、cd52、il10ra、hla-doa、ifnb1、ccr5、ikzf3、stat1、cd6、brca1、coro1a、tbx21、klrk1、cxcr6、pten、pmel、dmbt1、ifi44l、laptm5、cd226、tnfsf13b、icos、cd160、trim29、lst1、zbtb46、vtcn1、kremen1、pdcd1lg2、tubb、clec4c、cd86、havcr2、gzmh、nfatc1、cd8b、bcl2、gadd45gip1、cblb、itga1、cd8a、il2ra、eif2ak2、madcam1、ptpn6、lrg1、adgre5、sh2d1b、itgb2、hla-dpa1、dgat2、igf1r、tagap、lmna、ncam1、tigit、il17f、hla-f-as1、cd247、cd79b、ido2、il4、tyrobp、btla、akt1、il2rg、polr2a、itgax、il1b、csf2rb、ddx58、kiaa0101、cd274、lamp3、tnfaip8、foxp3、il12a、samhd1、sit1、cd3e、icoslg、hgf、melk、igsf6、gnly、tdo2、krt7、hla-e、hla-dm、lamp1、ntn3、cd28、tarp、egfr、ccr4、magea3、batf、klrg1、irs1、csf1r、ctla4、tnfsf18、pou2af1、gzma、pik3ca、itk、ifi27、eomes、lcn2、cd80、cd83、cxcl13、mtor、fcer1g、tfrc、rorc、mmp9、bst2、pik3cd、fcgr2b、tnfrsf14、oas3、grap2、ccnb2、mlana、magea12、vcam1、cdkn3、ncr1、fas、gzmb、irf9、ifitm2、tnfsf14、hla-b、sdha、nrp1、ebi3、efna4、pvr、bub1、skap2、prf1、ccl20、tnfrsf18、ctss、nkg7、isg15、pdcd1、snai1、cxcl11、ciita、ifi35、tnfsf9、tnfsf10、mmp2、egr3、magea1、cd163、il6、klrf1、b3gat1、c1qa、oas1、ikzf2、tlr9、klf2、gusb、nfkbia、il23a、herc6、slamf8、il15、tlr7、oas2、hla-dr、crtam、magec2、icam1、cd4、mapk14、c1qb、notch3、ncr3、stat3、tlr8、cybb、ikzf4、ifih1、lck、bcl2l11、itgam、itgb7、jchain、cd209、slamf7、il10、il1a、fcgr3a、ifna17、egr2、top2a、c10orf54、foxm1、axl、ms4a1、ifi6、cd3d、gpr18、cd3g、zap70、hmbs、il7、ifit3、rb1、ptgs2、tgfb1、ncf1、twist1、ca4、sell、lilrb1、cd14、alox15b、pecam1、nos2、faslg、cd44、entpd1、cmklr1、cd53、tnf、cxcl8、cd40lg、hla-f、gata3、lyz、arg1、il2rb、nectin2、mpo、ccr2、brca2、adora2a、g6pd、tap1、mx1、hla-dqb2、cd27、cd276、stat4、ptpn7、ptprc、psmb9、cd244、cxcr4、mapk1、tp63、irf4、ccl3、ccl18、il7r、hla-drb1、ceacam8、cxcl10、ccl2、srgn、cd19、itgb1、ifitm1、ccl21、mrc1、pgf、itgal、id2、cd22、ccl17、itgae、il3ra、ccr7、cd1c、mad2l1、pygl、cd40、ly9、hla-g、tlr3、cd48、stat5a、fcrla、bcl6、zeb1、ccl5、ido1、il18、tnfrsf9、hif1a、hla-dpb1、foxo1、cd33、s100a9、hla-dmb、hla-a、snai2、tnfrsf17、lrp1、magea4、hla-dqa1、cd1d、rps6、mki67、gzmk、cd79a、cd37、fut4、aif1、ccr1、prdm1、cd47、cd74、lag3、tnfrsf4、cd2、ccl4、bage、lexm、ccr6、cd70、cdk1、ctag1b、ctag2、cx3cr1、cx3cr1、cx3cr1、cx3cr1、gage1,gage12i,gage12f、gage12j、gage2c,gage2a,gage2e、gage10、gage13、ikzf1、il17a、il2、il21、il22、kir2dl2、kir2dl3、magea10、mif、ptprcap、ssx2、tcf7、xage1b、ceacam8、cxcr3、fcgr1a、fcgr3b、fyb、hla-c、hla-dqa2、ifng、kir2dl1、krt5、lmna、和ptpn11。在一些实施方案中，一种或多种异常表达序列指示癌症活性。在一些实施方案中，一种或多种异常表达序列指示患者对治疗剂的反应的可能性。在一些实施方案中，一种或多种异常表达序列指示患者不对治疗剂有响应的可能性。在某些实施方案中，相关治疗剂可以是免疫疗法，包括但不限于检查点阻断、t细胞疗法和治疗性疫苗。在一些实施方案中，治疗剂可以修饰选自以下的免疫应答基因：pd1(例如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、amp-244、medi0680、amp-514、pidlizumab)，ctla4(例如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美母单抗(tremelimumab))，pd-l1(例如阿特珠单抗(atezolizumab)、mdx1105-01、medi4736、阿维鲁单抗(avelumab))，kir(例如lirilumab、ncc0141-0000-0100)，cd9/nkg2a(例如iph2201)，lag3(例如bms986016)，gitr(例如trx518)，ox40(例如medi6383、medi6489、moxr0916)，ido(例如indoximod(nlg8189)、incb024360、f001287、nlg919)，tgfbeta(例如sotaracept、fresolumimab、trabedersen、lucanix)，tgfbetar(例如ly2157299、ace536)，cd137(例如urelumab)，cd137/41bb(例如pf05082566)，cd289/tlr9(例如mgn1703)，muc1/cd227(例如oint-10、asn-004)，cd27(例如varlilumab)，cd27l(例如amg172)，slamf7/cd1(例如埃罗妥珠单抗(elotuzumab))，cd20(例如di-leu16-il2)，talimogenelaherparepvec，cd70(例如argx110)，il10(例如am0010)，psa(例如prostvac)，gp100(例如mdx1379)，stat3(例如azd9150)，cvac，il12(例如veledimex、inxn2001、msb0010360n、immunopulse、gen-1、ino-9012；il2：msb0010445、rg7813/ro6895882)，il33(例如警报素il33)，ict140，cndo-109，htert(例如ino-1400)，发育不良组织(例如adxs-hpv)，smac-模拟物(例如birinapant)，immtac(例如imcgp100)和cd40(例如ro7009789)。在某些实施方案中，相关治疗剂是选自检查点阻断、t细胞疗法和治疗性疫苗的免疫疗法。在一些实施方案中，治疗剂修饰选自以下任一种的免疫应答基因：pd1(例如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、amp-244、medi0680、amp-514、pidlizumab)，ctla4(例如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美母单抗(tremelimumab))，pd-l1(例如阿特珠单抗(atezolizumab)、mdx1105-01、medi4736、阿维鲁单抗(avelumab))，kir(例如lirilumab、ncc0141-0000-0100)，cd9/nkg2a(例如iph2201)，lag3(例如bms986016)，gitr(例如trx518)，ox40(例如medi6383、medi6489、moxr0916)，ido(例如indoximod(nlg8189)、incb024360、f001287、nlg919)，tgfbeta(例如sotaracept、fresolumimab、trabedersen、lucanix)，tgfbetar(例如ly2157299、ace536)，cd137(例如urelumab)，cd137/41bb(例如pf05082566)，cd289/tlr9(例如mgn1703)，muc1/cd227(例如oint-10、asn-004)，cd27(例如varlilumab)，cd27l(例如amg172)，slamf7/cd1(例如埃罗妥珠单抗(elotuzumab))，cd20(例如di-leu16-il2)，talimogenelaherparepvec，cd70(例如argx110)，il10(例如am0010)，psa(例如prostvac)，gp100(例如mdx1379)，stat3(例如azd9150)，cvac，il12(例如veledimex、inxn2001、msb0010360n、immunopulse、gen-1、ino-9012；il2：msb0010445、rg7813/ro6895882)，il33(例如警报素il33)，ict140，cndo-109，htert(例如ino-1400)，发育不良组织(例如adxs-hpv)，smac-模拟物(例如birinapant)，immtac(例如imcgp100)和cd40(例如ro7009789)。在一些实施方案中，针对与癌症相关的突变引导靶序列或经扩增的靶序列。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种实体瘤癌相关的突变，所述实体瘤癌选自头颈癌(例如，hnscc、鼻咽、唾液腺)，脑癌(例如，胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)，乳腺癌(例如，tnbc、曲妥珠单抗耐药的her2+乳腺癌、er+/her-乳腺癌)，妇科(例如，子宫、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌)，结肠直肠癌，胆囊癌，食道癌，胃肠癌，胃癌，膀胱癌，前列腺癌，睾丸癌，尿路上皮癌，肝癌(如肝细胞癌、hcc)，肺癌(如非小细胞肺、小细胞肺)，肾(肾细胞)癌，胰腺癌(如腺癌、导管)，甲状腺癌，胆管癌，垂体瘤，维尔姆斯肿瘤，卡波西肉瘤，毛细胞癌，骨肉瘤，胸腺癌，皮肤癌，黑色素瘤，心脏癌，口腔癌和喉癌，神经母细胞瘤，间皮瘤和其他实体瘤(胸腺、骨、软组织、口腔scc、骨髓纤维化、滑膜肉瘤)。在一个实施方案中，突变可包括取代、插入、反转、点突变、缺失、错配和易位。在一个实施方案中，突变可包括拷贝数的变化。在一个实施方案中，突变可包括生殖系或体细胞突变。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种血液/血液癌相关的突变的序列，所述血液/血液癌选自多发性骨髓瘤，弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)，淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，白血病，急性髓性白血病(aml)，慢性淋巴细胞白血病(cll)，骨髓增生异常综合征。在一个实施方案中，与癌症相关的突变位于表1中提供的至少一种基因中。在一些实施方案中，与癌症相关的免疫应答序列中的一个或多个突变位于选自以下的至少一种基因中：cd63、cd69、cxcl1、klrd1、hla-dob、cxcr5、il12b、ptk7、ceacam1、cxcl9、il13、nt5e、vegfa、abcf1、cd38、jaml、s100a8、myc、irf1、ccl22、cxcr2、ifit1、ifit2、cd68、m6pr、sh2d1a、isg20、gbp1、tbp、stat6、id3、cx3cl1、klrb1、tnfsf4、cd52、il10ra、hla-doa、ifnb1、ccr5、ikzf3、stat1、cd6、brca1、coro1a、tbx21、klrk1、cxcr6、pten、pmel、dmbt1、ifi44l、laptm5、cd226、tnfsf13b、icos、cd160、trim29、lst1、zbtb46、vtcn1、kremen1、pdcd1lg2、tubb、clec4c、cd86、havcr2、gzmh、nfatc1、cd8b、bcl2、gadd45gip1、cblb、itga1、cd8a、il2ra、eif2ak2、madcam1、ptpn6、lrg1、adgre5、sh2d1b、itgb2、hla-dpa1、dgat2、igf1r、tagap、lmna、ncam1、tigit、il17f、hla-f-as1、cd247、cd79b、ido2、il4、tyrobp、btla、akt1、il2rg、polr2a、itgax、il1b、csf2rb、ddx58、kiaa0101、cd274、lamp3、tnfaip8、foxp3、il12a、samhd1、sit1、cd3e、icoslg、hgf、melk、igsf6、gnly、tdo2、krt7、hla-e、hla-dm、lamp1、ntn3、cd28、tarp、egfr、ccr4、magea3、batf、klrg1、irs1、csf1r、ctla4、tnfsf18、pou2af1、gzma、pik3ca、itk、ifi27、eomes、lcn2、cd80、cd83、cxcl13、mtor、fcer1g、tfrc、rorc、mmp9、bst2、pik3cd、fcgr2b、tnfrsf14、oas3、grap2、ccnb2、mlana、magea12、vcam1、cdkn3、ncr1、fas、gzmb、irf9、ifitm2、tnfsf14、hla-b、sdha、nrp1、ebi3、efna4、pvr、bub1、skap2、prf1、ccl20、tnfrsf18、ctss、nkg7、isg15、pdcd1、snai1、cxcl11、ciita、ifi35、tnfsf9、tnfsf10、mmp2、egr3、magea1、cd163、il6、klrf1、b3gat1、c1qa、oas1、ikzf2、tlr9、klf2、gusb、nfkbia、il23a、herc6、slamf8、il15、tlr7、oas2、hla-dr、crtam、magec2、icam1、cd4、mapk14、c1qb、notch3、ncr3、stat3、tlr8、cybb、ikzf4、ifih1、lck、bcl2l11、itgam、itgb7、jchain、cd209、slamf7、il10、il1a、fcgr3a、ifna17、egr2、top2a、c10orf54、foxm1、axl、ms4a1、ifi6、cd3d、gpr18、cd3g、zap70、hmbs、il7、ifit3、rb1、ptgs2、tgfb1、ncf1、twist1、ca4、sell、lilrb1、cd14、alox15b、pecam1、nos2、faslg、cd44、entpd1、cmklr1、cd53、tnf、cxcl8、cd40lg、hla-f、gata3、lyz、arg1、il2rb、nectin2、mpo、ccr2、brca2、adora2a、g6pd、tap1、mx1、hla-dqb2、cd27、cd276、stat4、ptpn7、ptprc、psmb9、cd244、cxcr4、mapk1、tp63、irf4、ccl3、ccl18、il7r、hla-drb1、ceacam8、cxcl10、ccl2、srgn、cd19、itgb1、ifitm1、ccl21、mrc1、pgf、itgal、id2、cd22、ccl17、itgae、il3ra、ccr7、cd1c、mad2l1、pygl、cd40、ly9、hla-g、tlr3、cd48、stat5a、fcrla、bcl6、zeb1、ccl5、ido1、il18、tnfrsf9、hif1a、hla-dpb1、foxo1、cd33、s100a9、hla-dmb、hla-a、snai2、tnfrsf17、lrp1、magea4、hla-dqa1、cd1d、rps6、mki67、gzmk、cd79a、cd37、fut4、aif1、ccr1、prdm1、cd47、cd74、lag3、tnfrsf4、cd2、ccl4、bage、lexm、ccr6、cd70、cdk1、ctag1b、ctag2、cx3cr1、cx3cr1、cx3cr1、cx3cr1、gage1,gage12i,gage12f、gage12j、gage2c,gage2a,gage2e、gage10、gage13、ikzf1、il17a、il2、il21、il22、kir2dl2、kir2dl3、magea10、mif、ptprcap、ssx2、tcf7、xage1b、ceacam8、cxcr3、fcgr1a、fcgr3b、fyb、hla-c、hla-dqa2、ifng、kir2dl1、krt5、lmna、和ptpn11。在一些实施方案中，扩增的靶序列针对表1中提供的任何一种或多种基因。在一些实施方案中，扩增的靶序列包含表1中提供的任何一种或多种扩增子序列。在一些实施方案中，扩增的靶序列由表1中提供的任何一种或多种扩增子序列组成。在一些实施方案中，扩增的靶序列包括表1中提供的每个扩增子序列。在一些实施方案中，组合物包含表2中提供的任何一种或多种免疫应答靶特异性引物对。在一些实施方案中，组合物包含表2中提供的所有免疫应答靶特异性引物对。在一些实施方案中，表2中提供的任何一种或多种免疫应答靶特异性引物对可用于扩增样品中存在的靶序列，如本文所述的方法所公开的。在一些实施方案中，来自表2的免疫应答靶特异性引物可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、40、60、80、100、150、200、250、300、350、398或更多个靶特异性引物对。在一些实施方案中，扩增的靶序列可包括表1中提供的任何一种或多种扩增的靶序列(例如，使用表2中提供的扩增子id靶特异性引物)。在一些实施方案中，与癌症相关的至少一个靶特异性引物与选自seqidnos:399-1194的至少一个核酸序列至少90％同一。在一些实施例中，与免疫反应相关的靶特异性引物中的至少一个跨越其全部长度与样品中的至少一个靶序列互补。在一些实施方案中，与免疫反应相关的靶特异性引物中的至少一个包括3'端处的非可裂解核苷酸。在一些实施方案中，3'端处的非可裂解核苷酸包括末端3'核苷酸。在一个实施方案中，经扩增的靶序列针对具有与癌症相关的异常表达的一个或多个个别外显子。在一个实施方案中，经扩增的靶序列针对具有与癌症相关的突变的个别外显子。在一些实施方案中，提供的方法包括样品中超过一个靶序列的选择性扩增和与癌症相关的突变的检测和/或鉴别。在一些实施方案中，经扩增的靶序列包括两个或更多个表2中提供的核苷酸序列。在一些实施方案中，扩增的靶序列可包括使用表2中提供的靶特异性引物产生的任何一种或多种扩增的靶序列。在一个实施方案中，扩增的靶序列包括表1中的10、50、100、150、200、250、300、350或更多个扩增子。在一些实施方案中，方法包括检测和任选地鉴定临床上可行标志物。如本文中所定义，术语“临床上可行标志物”包括已知的或可由所属领域的一般技术人员与(但不限于)癌症治疗的预后相关联的临床上可行的突变和/或临床上可行的表达模式。在一个实施方案中，癌症治疗的预后包括与癌症对药物、药物组合或治疗方案起反应或不起反应相关的突变和/或表达模式的鉴别。在一个实施方案中，方法包括多个靶序列从与癌症的发作、进展或缓解有关或相关的核酸分子群体的扩增。在一些实施方案中，持家基因包含在免疫应答测定中。在某些实施方案中，一种或多种持家基因序列包括在测定中。在特定实施方案中，一种或多种持家基因选自abcf1、g6pd、gusb、hmbs、lmna、lrp1、polr2a、sdha、tbp、tfrc和tubb。本文提供了用于确定样品中的免疫应答活性的方法。在一些实施方案中，该方法包括多重扩增来自生物样品的多个靶表达序列，其中扩增包括在扩增条件下使至少一部分样品与针对多个靶序列的多组引物对试剂和聚合酶接触，从而产生扩增的靶表达序列。该方法还包括检测样品中靶序列的表达水平，其中与对照相比，一种或多种免疫应答标志物的表达水平的变化决定了样品中免疫应答活性的变化。在一些实施方案中，所述方法的靶表达序列选自由以下功能组成的免疫应答基因：检查点途径、t细胞相关信号传导途径、肿瘤浸润淋巴细胞(til)的标志物、肿瘤标志物和持家基因。在一些实施方案中，所述靶基因选自以下功能的免疫应答基因：免疫检查点途径和靶标；t细胞和b细胞信号传导基因、淋巴细胞亚群标志物、干扰素信号传导基因、细胞因子信号传导基因；肿瘤标志物、肿瘤抗原和增殖标志物；和持家基因。在一些实施方案中，所述方法的靶基因选自由下列功能组成的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞活化、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、b细胞受体信号传导、t细胞受体信号传导、t细胞调节和tcr共表达。在一些实施方案中，所述方法的靶基因选自由下列功能组成的免疫应答基因：趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、i型干扰素信号传导和ii型干扰素信号传导。在一些实施方案中，所述方法的靶基因选自由下列标志物功能组成的免疫应答基因：b细胞标志物、树突细胞、树突细胞/巨噬细胞、辅助t细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、nk激活、nk细胞和t细胞分化。在一些实施方案中，所述方法的靶基因选自免疫应答基因，所述免疫应答基因由标记物的以下功能组成：检查点途径、pd-信号传导和药物靶标。在一些实施方案中，所述方法的靶基因选自免疫应答基因，所述免疫应答基因由以下标志物功能组成：粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，所述方法的免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、b细胞受体信号传导、t细胞受体信号传导、t细胞调节、tcr共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、i型干扰素信号传导、ii型干扰素信号传导、b细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助t细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、nk活化、nk细胞、t细胞分化、检查点途径、pd信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，所述的方法免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、b细胞受体信号传导、t细胞受体信号传导、t细胞调节、tcr共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、i型干扰素信号传导、ii型干扰素信号传导、b细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助t细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、nk活化、nk细胞、t细胞分化、检查点途径、pd信号传导和药物靶标。在一些实施方案中，所述方法的免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、b细胞受体信号传导、t细胞受体信号传导、t细胞调节、tcr共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、i型干扰素信号传导、ii型干扰素信号传导、b细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助t细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、nk活化、nk细胞、t细胞分化、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，所述方法的免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、b细胞受体信号传导、t细胞受体信号传导、t细胞调节、tcr共表达、检查点途径、pd信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，所述方法的免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、b细胞受体信号传导、t细胞受体信号传导、t细胞调节、tcr共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、i型干扰素信号传导、ii型干扰素信号传导、b细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助t细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、nk活化、nk细胞、t细胞分化、检查点途径、pd信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，所述方法的免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：tcr共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、i型干扰素信号传导、ii型干扰素信号传导、b细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助t细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、nk活化、nk细胞、t细胞分化、检查点途径、pd信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在某些实施方案中，所述方法的靶免疫应答序列针对具有与癌症相关的异常表达的序列。在一些实施方案中，所述方法的靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种实体瘤癌相关的异常表达的序列，所述实体瘤癌选自头颈癌(例如，hnscc、鼻咽、唾液腺)，脑癌(例如，胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)，乳腺癌(例如，tnbc、曲妥珠单抗耐药的her2+乳腺癌、er+/her-乳腺癌)，妇科(例如，子宫、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌)，结肠直肠癌，胆囊癌，食道癌，胃肠癌，胃癌，膀胱癌，前列腺癌，睾丸癌，尿路上皮癌，肝癌(如肝细胞癌、hcc)，肺癌(如非小细胞肺、小细胞肺)，肾(肾细胞)癌，胰腺癌(如腺癌、导管)，甲状腺癌，胆管癌，垂体瘤，维尔姆斯肿瘤，卡波西肉瘤，毛细胞癌，骨肉瘤，胸腺癌，皮肤癌，黑色素瘤，心脏癌，口腔癌和喉癌，神经母细胞瘤，间皮瘤和其他实体瘤(胸腺、骨、软组织、口腔scc、骨髓纤维化、滑膜肉瘤)。在某些实施方案中，突变可包括取代、插入、反转、点突变、缺失、错配和易位的任一种。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种血液/血液癌相关的异常表达的序列，所述血液/血液癌选自多发性骨髓瘤，弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)，淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，白血病，急性髓性白血病(aml)，慢性淋巴细胞白血病(cll)，骨髓增生异常综合征。在某些实施方案中，与癌症相关的异常表达涉及表1中提供的至少一种基因。在一些实施方案中，所述方法的一种或多种异常表达免疫应答序列是选自以下的至少一种基因：cd63、cd69、cxcl1、klrd1、hla-dob、cxcr5、il12b、ptk7、ceacam1、cxcl9、il13、nt5e、vegfa、abcf1、cd38、jaml、s100a8、myc、irf1、ccl22、cxcr2、ifit1、ifit2、cd68、m6pr、sh2d1a、isg20、gbp1、tbp、stat6、id3、cx3cl1、klrb1、tnfsf4、cd52、il10ra、hla-doa、ifnb1、ccr5、ikzf3、stat1、cd6、brca1、coro1a、tbx21、klrk1、cxcr6、pten、pmel、dmbt1、ifi44l、laptm5、cd226、tnfsf13b、icos、cd160、trim29、lst1、zbtb46、vtcn1、kremen1、pdcd1lg2、tubb、clec4c、cd86、havcr2、gzmh、nfatc1、cd8b、bcl2、gadd45gip1、cblb、itga1、cd8a、il2ra、eif2ak2、madcam1、ptpn6、lrg1、adgre5、sh2d1b、itgb2、hla-dpa1、dgat2、igf1r、tagap、lmna、ncam1、tigit、il17f、hla-f-as1、cd247、cd79b、ido2、il4、tyrobp、btla、akt1、il2rg、polr2a、itgax、il1b、csf2rb、ddx58、kiaa0101、cd274、lamp3、tnfaip8、foxp3、il12a、samhd1、sit1、cd3e、icoslg、hgf、melk、igsf6、gnly、tdo2、krt7、hla-e、hla-dm、lamp1、ntn3、cd28、tarp、egfr、ccr4、magea3、batf、klrg1、irs1、csf1r、ctla4、tnfsf18、pou2af1、gzma、pik3ca、itk、ifi27、eomes、lcn2、cd80、cd83、cxcl13、mtor、fcer1g、tfrc、rorc、mmp9、bst2、pik3cd、fcgr2b、tnfrsf14、oas3、grap2、ccnb2、mlana、magea12、vcam1、cdkn3、ncr1、fas、gzmb、irf9、ifitm2、tnfsf14、hla-b、sdha、nrp1、ebi3、efna4、pvr、bub1、skap2、prf1、ccl20、tnfrsf18、ctss、nkg7、isg15、pdcd1、snai1、cxcl11、ciita、ifi35、tnfsf9、tnfsf10、mmp2、egr3、magea1、cd163、il6、klrf1、b3gat1、c1qa、oas1、ikzf2、tlr9、klf2、gusb、nfkbia、il23a、herc6、slamf8、il15、tlr7、oas2、hla-dr、crtam、magec2、icam1、cd4、mapk14、c1qb、notch3、ncr3、stat3、tlr8、cybb、ikzf4、ifih1、lck、bcl2l11、itgam、itgb7、jchain、cd209、slamf7、il10、il1a、fcgr3a、ifna17、egr2、top2a、c10orf54、foxm1、axl、ms4a1、ifi6、cd3d、gpr18、cd3g、zap70、hmbs、il7、ifit3、rb1、ptgs2、tgfb1、ncf1、twist1、ca4、sell、lilrb1、cd14、alox15b、pecam1、nos2、faslg、cd44、entpd1、cmklr1、cd53、tnf、cxcl8、cd40lg、hla-f、gata3、lyz、arg1、il2rb、nectin2、mpo、ccr2、brca2、adora2a、g6pd、tap1、mx1、hla-dqb2、cd27、cd276、stat4、ptpn7、ptprc、psmb9、cd244、cxcr4、mapk1、tp63、irf4、ccl3、ccl18、il7r、hla-drb1、ceacam8、cxcl10、ccl2、srgn、cd19、itgb1、ifitm1、ccl21、mrc1、pgf、itgal、id2、cd22、ccl17、itgae、il3ra、ccr7、cd1c、mad2l1、pygl、cd40、ly9、hla-g、tlr3、cd48、stat5a、fcrla、bcl6、zeb1、ccl5、ido1、il18、tnfrsf9、hif1a、hla-dpb1、foxo1、cd33、s100a9、hla-dmb、hla-a、snai2、tnfrsf17、lrp1、magea4、hla-dqa1、cd1d、rps6、mki67、gzmk、cd79a、cd37、fut4、aif1、ccr1、prdm1、cd47、cd74、lag3、tnfrsf4、cd2、ccl4、bage、lexm、ccr6、cd70、cdk1、ctag1b、ctag2、cx3cr1、cx3cr1、cx3cr1、cx3cr1、gage1,gage12i,gage12f、gage12j、gage2c,gage2a,gage2e、gage10、gage13、ikzf1、il17a、il2、il21、il22、kir2dl2、kir2dl3、magea10、mif、ptprcap、ssx2、tcf7、xage1b、ceacam8、cxcr3、fcgr1a、fcgr3b、fyb、hla-c、hla-dqa2、ifng、kir2dl1、krt5、lmna、和ptpn11。在一些实施方案中，一种或多种异常表达序列指示癌症活性。在一些实施方案中，一种或多种异常表达序列指示患者对治疗剂的反应的可能性。在一些实施方案中，一种或多种异常表达序列指示患者不对治疗剂有响应的可能性。在某些实施方案中，相关治疗剂可以是免疫疗法，包括但不限于检查点阻断、t细胞疗法和治疗性疫苗。在一些实施方案中，治疗剂可以修饰选自以下的免疫应答基因：pd1(例如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、amp-244、medi0680、amp-514、pidlizumab)，ctla4(例如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美母单抗(tremelimumab))，pd-l1(例如阿特珠单抗(atezolizumab)、mdx1105-01、medi4736、阿维鲁单抗(avelumab))，kir(例如lirilumab、ncc0141-0000-0100)，cd9/nkg2a(例如iph2201)，lag3(例如bms986016)，gitr(例如trx518)，ox40(例如medi6383、medi6489、moxr0916)，ido(例如indoximod(nlg8189)、incb024360、f001287、nlg919)，tgfbeta(例如sotaracept、fresolumimab、trabedersen、lucanix)，tgfbetar(例如ly2157299、ace536)，cd137(例如urelumab)，cd137/41bb(例如pf05082566)，cd289/tlr9(例如mgn1703)，muc1/cd227(例如oint-10、asn-004)，cd27(例如varlilumab)，cd27l(例如amg172)，slamf7/cd1(例如埃罗妥珠单抗(elotuzumab))，cd20(例如di-leu16-il2)，talimogenelaherparepvec，cd70(例如argx110)，il10(例如am0010)，psa(例如prostvac)，gp100(例如mdx1379)，stat3(例如azd9150)，cvac，il12(例如veledimex、inxn2001、msb0010360n、immunopulse、gen-1、ino-9012；il2：msb0010445、rg7813/ro6895882)，il33(例如警报素il33)，ict140，cndo-109，htert(例如ino-1400)，发育不良组织(例如adxs-hpv)，smac-模拟物(例如birinapant)，immtac(例如imcgp100)和cd40(例如ro7009789)。在某些实施方案中，相关治疗剂是选自检查点阻断、t细胞疗法和治疗性疫苗的免疫疗法。在一些实施方案中，治疗剂修饰选自以下任一种的免疫应答基因：pd1(例如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、amp-244、medi0680、amp-514、pidlizumab)，ctla4(例如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美母单抗(tremelimumab))，pd-l1(例如阿特珠单抗(atezolizumab)、mdx1105-01、medi4736、阿维鲁单抗(avelumab))，kir(例如lirilumab、ncc0141-0000-0100)，cd9/nkg2a(例如iph2201)，lag3(例如bms986016)，gitr(例如trx518)，ox40(例如medi6383、medi6489、moxr0916)，ido(例如indoximod(nlg8189)、incb024360、f001287、nlg919)，tgfbeta(例如sotaracept、fresolumimab、trabedersen、lucanix)，tgfbetar(例如ly2157299、ace536)，cd137(例如urelumab)，cd137/41bb(例如pf05082566)，cd289/tlr9(例如mgn1703)，muc1/cd227(例如oint-10、asn-004)，cd27(例如varlilumab)，cd27l(例如amg172)，slamf7/cd1(例如埃罗妥珠单抗(elotuzumab))，cd20(例如di-leu16-il2)，talimogenelaherparepvec，cd70(例如argx110)，il10(例如am0010)，psa(例如prostvac)，gp100(例如mdx1379)，stat3(例如azd9150)，cvac，il12(例如veledimex、inxn2001、msb0010360n、immunopulse、gen-1、ino-9012；il2：msb0010445、rg7813/ro6895882)，il33(例如警报素il33)，ict140，cndo-109，htert(例如ino-1400)，发育不良组织(例如adxs-hpv)，smac-模拟物(例如birinapant)，immtac(例如imcgp100)和cd40(例如ro7009789)。在一些实施方案中，所述方法的靶序列或经扩增的靶序列针对与癌症相关的突变。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种实体瘤癌相关的突变，所述实体瘤癌选自头颈癌(例如，hnscc、鼻咽、唾液腺)，脑癌(例如，胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)，乳腺癌(例如，tnbc、曲妥珠单抗耐药的her2+乳腺癌、er+/her-乳腺癌)，妇科(例如，子宫、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌)，结肠直肠癌，胆囊癌，食道癌，胃肠癌，胃癌，膀胱癌，前列腺癌，睾丸癌，尿路上皮癌，肝癌(如肝细胞癌、hcc)，肺癌(如非小细胞肺、小细胞肺)，肾(肾细胞)癌，胰腺癌(如腺癌、导管)，甲状腺癌，胆管癌，垂体瘤，维尔姆斯肿瘤，卡波西肉瘤，毛细胞癌，骨肉瘤，胸腺癌，皮肤癌，黑色素瘤，心脏癌，口腔癌和喉癌，神经母细胞瘤，间皮瘤和其他实体瘤(胸腺、骨、软组织、口腔scc、骨髓纤维化、滑膜肉瘤)。在一个实施方案中，突变可包括取代、插入、反转、点突变、缺失、错配和易位。在一个实施方案中，突变可包括拷贝数的变化。在一个实施方案中，突变可包括生殖系或体细胞突变。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种血液/血液癌相关的突变的序列，所述血液/血液癌选自多发性骨髓瘤，弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)，淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，白血病，急性髓性白血病(aml)，慢性淋巴细胞白血病(cll)，骨髓增生异常综合征。在一个实施方案中，与癌症相关的突变位于表1中提供的至少一种基因中。在一些实施方案中，与癌症相关的免疫应答序列中的一个或多个突变位于选自以下的至少一种基因中：cd63、cd69、cxcl1、klrd1、hla-dob、cxcr5、il12b、ptk7、ceacam1、cxcl9、il13、nt5e、vegfa、abcf1、cd38、jaml、s100a8、myc、irf1、ccl22、cxcr2、ifit1、ifit2、cd68、m6pr、sh2d1a、isg20、gbp1、tbp、stat6、id3、cx3cl1、klrb1、tnfsf4、cd52、il10ra、hla-doa、ifnb1、ccr5、ikzf3、stat1、cd6、brca1、coro1a、tbx21、klrk1、cxcr6、pten、pmel、dmbt1、ifi44l、laptm5、cd226、tnfsf13b、icos、cd160、trim29、lst1、zbtb46、vtcn1、kremen1、pdcd1lg2、tubb、clec4c、cd86、havcr2、gzmh、nfatc1、cd8b、bcl2、gadd45gip1、cblb、itga1、cd8a、il2ra、eif2ak2、madcam1、ptpn6、lrg1、adgre5、sh2d1b、itgb2、hla-dpa1、dgat2、igf1r、tagap、lmna、ncam1、tigit、il17f、hla-f-as1、cd247、cd79b、ido2、il4、tyrobp、btla、akt1、il2rg、polr2a、itgax、il1b、csf2rb、ddx58、kiaa0101、cd274、lamp3、tnfaip8、foxp3、il12a、samhd1、sit1、cd3e、icoslg、hgf、melk、igsf6、gnly、tdo2、krt7、hla-e、hla-dm、lamp1、ntn3、cd28、tarp、egfr、ccr4、magea3、batf、klrg1、irs1、csf1r、ctla4、tnfsf18、pou2af1、gzma、pik3ca、itk、ifi27、eomes、lcn2、cd80、cd83、cxcl13、mtor、fcer1g、tfrc、rorc、mmp9、bst2、pik3cd、fcgr2b、tnfrsf14、oas3、grap2、ccnb2、mlana、magea12、vcam1、cdkn3、ncr1、fas、gzmb、irf9、ifitm2、tnfsf14、hla-b、sdha、nrp1、ebi3、efna4、pvr、bub1、skap2、prf1、ccl20、tnfrsf18、ctss、nkg7、isg15、pdcd1、snai1、cxcl11、ciita、ifi35、tnfsf9、tnfsf10、mmp2、egr3、magea1、cd163、il6、klrf1、b3gat1、c1qa、oas1、ikzf2、tlr9、klf2、gusb、nfkbia、il23a、herc6、slamf8、il15、tlr7、oas2、hla-dr、crtam、magec2、icam1、cd4、mapk14、c1qb、notch3、ncr3、stat3、tlr8、cybb、ikzf4、ifih1、lck、bcl2l11、itgam、itgb7、jchain、cd209、slamf7、il10、il1a、fcgr3a、ifna17、egr2、top2a、c10orf54、foxm1、axl、ms4a1、ifi6、cd3d、gpr18、cd3g、zap70、hmbs、il7、ifit3、rb1、ptgs2、tgfb1、ncf1、twist1、ca4、sell、lilrb1、cd14、alox15b、pecam1、nos2、faslg、cd44、entpd1、cmklr1、cd53、tnf、cxcl8、cd40lg、hla-f、gata3、lyz、arg1、il2rb、nectin2、mpo、ccr2、brca2、adora2a、g6pd、tap1、mx1、hla-dqb2、cd27、cd276、stat4、ptpn7、ptprc、psmb9、cd244、cxcr4、mapk1、tp63、irf4、ccl3、ccl18、il7r、hla-drb1、ceacam8、cxcl10、ccl2、srgn、cd19、itgb1、ifitm1、ccl21、mrc1、pgf、itgal、id2、cd22、ccl17、itgae、il3ra、ccr7、cd1c、mad2l1、pygl、cd40、ly9、hla-g、tlr3、cd48、stat5a、fcrla、bcl6、zeb1、ccl5、ido1、il18、tnfrsf9、hif1a、hla-dpb1、foxo1、cd33、s100a9、hla-dmb、hla-a、snai2、tnfrsf17、lrp1、magea4、hla-dqa1、cd1d、rps6、mki67、gzmk、cd79a、cd37、fut4、aif1、ccr1、prdm1、cd47、cd74、lag3、tnfrsf4、cd2、ccl4、bage、lexm、ccr6、cd70、cdk1、ctag1b、ctag2、cx3cr1、cx3cr1、cx3cr1、cx3cr1、gage1,gage12i,gage12f、gage12j、gage2c,gage2a,gage2e、gage10、gage13、ikzf1、il17a、il2、il21、il22、kir2dl2、kir2dl3、magea10、mif、ptprcap、ssx2、tcf7、xage1b、ceacam8、cxcr3、fcgr1a、fcgr3b、fyb、hla-c、hla-dqa2、ifng、kir2dl1、krt5、lmna、和ptpn11。在一个方面，本发明的组合物和方法用于鉴定响应、敏感性和/或无应答的生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自无应答患者的样品之间的绝对或相对基因表达变化。表现出显著不同表达水平(例如，应答组高、非应答组低)的任何一种或多种基因被认为是预测药物应答的生物标志物。在某些实施方案中，这种应答的生物标志物用于对患者进行免疫应答治疗的分层。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于鉴定治疗后监测免疫应答的生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较与已建立的临床制剂(例如，pd-l1、ny-eso-1、mage)的免疫组织化学读数相关的绝对或相对基因表达变化。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较与任何治疗靶标、药效学标志物或免疫原性抗原的变化相关的绝对或相对基因表达变化。显示与这些读数相关的向上或向下表达的任何基因或基因组合可以被认为是药物应答的预测标志物。在一些实施方案中，所提供的组合物和方法用于比较与含有高水平肿瘤浸润淋巴细胞(til)和含有低水平til的样品相关的绝对或相对基因表达变化，如病理学综述所报道的。在这两组之间表达显著不同的任何基因或基因组合可以被认为是药物应答的预测因子。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较与不同分子亚型的样品相关的绝对或相对基因表达变化(例如，结肠直肠癌的实例包括但不限于微卫星不稳定免疫；超突变，微卫星不稳定和强免疫激活；上皮和明显的代谢失调；间充质[http://www.nature.com/nm/journal/vaop/ncurrent/full/nm.3967.html])。任何基因或基因组合在任何这些组之间的表达显著不同可被认为是药物应答的预测因子。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较与不同组织病理学亚型的样品相关的绝对或相对基因表达变化(例如，非小细胞肺的实例包括但不限于腺癌、鳞状细胞癌，除非另行指定；结肠直肠的例子)。在这两组之间表达显著不同的任何基因或基因组合可以被认为是药物应答的预测因子。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的t细胞信号传导途径。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的t细胞调节途径。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的抗原加工和/或抗原呈递。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的细胞因子信号传导途径。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如来自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的i型或ii型干扰素途径。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的淋巴细胞发育和/或淋巴细胞迁移。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的免疫检查点途径。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估在源自响应于免疫疗法治疗的患者的样品和来自无应答者的样品之间在组中包含的任何基因(例如，pd-1、pd-l1、ctla4等)或其组合的表达水平。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和来自无应答者的样品之间的抗原(例如，癌症睾丸抗原(gage)、黑素瘤抗原(mage))的基因或同种型的表达水平。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估在源自响应于免疫疗法治疗的患者的样品和来自无应答者的样品之间在组中包含的任何基因或其组合(例如，pd-1、pd-l1、ctla4等)的原始读数或归一化读数的不同数学、定量或定性转化的表达水平。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于分析肿瘤微环境中的不同免疫亚群(例如：细胞毒性t细胞、辅助性t细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、骨髓衍生的抑制细胞)的炎性水平和丰度。来自治疗的应答者和非应答者的样品之间的这些标志物的表达水平的任何差异可以被认为是预测应答的生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于确定hla类型及其与抗原呈递、t细胞和b细胞活化和药物反应的相关性。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于基于另一种测定法定义的分类器将肿瘤样品分类为治疗剂的可能的应答者或非应答者。在具体的实施方案中，提供的组合物和方法用于鉴定基因的子集，从中可以衍生另一组以用于本文所述的目的。在一个具体的实施方案中，可以将额外的引物组添加到当前组以产生可以用于本文所述目的的另外的组。在另一个方面，提供的组合物和方法用于评估由免疫检查点调节剂上调或下调的基因的表达水平。见，例如https://en.wikipedia.org/wiki/immune_checkpoint。由任何特定治疗剂调节的一种或多种基因的身份可用于阐明该药剂的作用机制。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估免疫检查点途径(包括例如pd-l1信号传导途径)中涉及的基因的表达水平。由任何特定治疗剂调节的一种或多种基因的身份可用于阐明该药剂的作用机制。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估涉及趋化因子信号传导、细胞因子信号传导和/或干扰素信号传导的基因的表达水平。由任何特定治疗剂调节的一种或多种基因的身份可用于阐明该药剂的作用机制。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估涉及肿瘤细胞粘附、肿瘤细胞迁移、肿瘤细胞增殖或癌症干性的基因的表达水平。与每种治疗剂相关的表达模式可用于推断该药剂的作用机制。在具体的实施方案中，提供的组合物和方法用于检测组中任何一种或多种基因表达的治疗后变化。这些基因的高或低表达水平将用于阐明经处理的药剂的作用机制。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于检测包含在组中的任何细胞内或细胞外蛋白质编码基因的表达的治疗后变化。这些基因的高或低表达水平可用于阐明该药剂的作用机制。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于研究响应于治疗剂或调节细胞外蛋白的药剂的治疗而改变的细胞内蛋白编码基因的表达。这些基因的高或低表达水平可用于阐明这些药剂的作用机制。在另外的实施方案中，提供的组合物和方法用于研究在不同时间点或治疗条件下包含在组中的任何基因的表达。这些基因的高或低表达水平可用于阐明药剂的作用机制。在具体的实施方案中，提供的组合物和方法用于研究在不同时间点或治疗条件下用不同治疗剂的包含在组中的任何基因的表达。被认为是互补的表达模式可以提供将相应的药剂组合以获得更大益处的理由。在具体的实施方案中，提供的组合物和方法用于研究在不同时间点或治疗条件下用不同治疗剂的包含在组中的任何基因的表达。被认为是互补的表达模式可以提供将相应的药剂组合以降低不良事件风险的理由。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于研究通过任何放射疗法、化学疗法、靶向疗法或免疫疗法调节的任何基因的表达。表达补充的互补模式可以提供将相应的药剂组合以获得更大益处或降低不良事件风险的理由。在其他实施方案中，提供的组合物和方法用于研究由t细胞疗法和免疫抑制疗法调节的任何基因的表达。表达的互补模式可以提供将相应的药剂组合以获得更大益处或降低不良事件风险的理由。在一些实施方案中，所述方法的扩增的靶序列针对表1中提供的任何一种或多种基因。在一些实施方案中，所述方法的扩增的靶序列包含表1中提供的任何一种或多种扩增子序列。在一些实施方案中，所述方法的扩增的靶序列由表1中提供的任何一种或多种扩增子序列组成。在一些实施方案中，所述方法的扩增的靶序列包括表1中提供的每个扩增子序列。在一些实施方案中，所提供的方法中使用的组合物包含表2中提供的任何一种或多种免疫应答靶特异性引物对。在一些实施方案中，与所提供的方法结合使用的组合物包含表2中提供的所有免疫应答靶特异性引物对。在一些实施方案中，表2中提供的任何一种或多种免疫应答靶特异性引物对可用于扩增样品中存在的靶序列，如本文所述的方法所公开的。在一些实施方案中，所述方法利用表2的免疫应答靶特异性引物并且包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、40、60、80、100、150、200、250、300、350、398或更多个靶特异性引物对。在一些实施方案中，方法包括靶向扩增的靶序列，其包括表1中产生的一种或多种扩增的靶序列(例如，使用表2中提供的扩增子靶特异性引物)。在一些实施方案中，方法包括使用至少一种靶特异性引物对，其中每种引物与选自seqidnos:399-1194的至少一个核酸序列至少90％同一。在一些实施方案中，方法包括使用与癌症相关的靶特异性引物中的至少一个跨越其全部长度与样品中的至少一个靶序列互补。在一些实施方案中，方法包括使用与癌症相关的靶特异性引物中的至少一个包括3'端处的非可裂解核苷酸。在一些实施方案中，方法包括使用靶特异性引物，其中3'末端的不可切割核苷酸包括末端3'核苷酸。在一个实施方案中，方法包括使用针对具有与癌症相关的异常表达的一个或多个个别外显子的经扩增的靶序列。在一个实施方案中，方法包括使用针对具有与癌症相关的突变的个别外显子的经扩增的靶序列。在一些实施方案中，提供的方法包括样品中超过一个靶序列的选择性扩增和与癌症相关的突变的检测和/或鉴别。在一些实施方案中，方法包括使用扩增的靶序列，其包括表2中提供的两个或更多个核苷酸序列。在一些实施方案中，方法包括使用扩增的靶序列，其包括使用表2中提供的靶特异性引物产生的任何一种或多种扩增的靶序列。在一个实施方案中，方法包括使用扩增的靶序列，其包括包括表1中的10、50、100、150、200、250、300、350或更多个扩增子。在一些实施方案中，方法包括检测和任选地鉴定临床上可行标志物。如本文中所定义，术语“临床上可行标志物”包括已知的或可由所属领域的一般技术人员与(但不限于)癌症治疗的预后相关联的临床上可行的突变和/或临床上可行的表达模式。在一个实施方案中，癌症治疗的预后包括与癌症对药物、药物组合或治疗方案起反应或不起反应相关的突变和/或表达模式的鉴别。在一个实施方案中，方法包括多个靶序列从与癌症的发作、进展或缓解有关或相关的核酸分子群体的扩增。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较来自具有良好预后(由持久应答、总体存活率或5年存活率定义)和预后不良的患者的样品之间的绝对或相对基因表达变化。例如，显示显著不同表达水平的基因(例如，一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，所提供的组合物和方法用于比较与含有高水平肿瘤浸润淋巴细胞(til)和含有低水平til的样品相关的绝对或相对基因表达变化，如病理学综述所报道的。例如，基因或基因组合在这两组之间的表达显著不同可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较与不同组织病理学亚型分子亚型(乳腺癌的实例包括腔a、腔b、基底样、her2阳性)的样品相关的绝对或相对基因表达变化。例如，在任何这些组之间表达显著不同的基因或基因组合可以被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较与不同组织病理学亚型(例如，对于乳腺癌，包括例如er+、pr+、her2+、三阴性)的样品相关的绝对或相对基因表达变化。例如，在这两组之间表达显著不同的基因或基因组合可以被认为是预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的t细胞信号传导途径。例如，显示显著不同表达水平的基因(例如，一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的t细胞调节途径。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的抗原加工和/或抗原呈递的基因表达。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的细胞因子信号传导途径的基因表达。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如来自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的i型或ii型干扰素途径。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的淋巴细胞发育和迁移。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的免疫检查点途径。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估在源自响应于免疫疗法治疗的患者的样品和来自无应答者的样品之间在组中包含的任何基因(例如，如pd-1、pd-l1、ctla4等)或其组合的表达水平。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估在源自响应于免疫疗法治疗的患者的样品和来自无应答者的样品之间在组中包含的任何基因或其组合(例如，如pd-1、pd-l1、ctla4等)的原始读数或归一化读数的不同数学、定量或定性转化的表达水平。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于分析肿瘤微环境中的不同免疫亚群(例如：细胞毒性t细胞、辅助性t细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、骨髓衍生的抑制细胞)的炎性水平和存在。来自治疗的应答者和非应答者的样品之间的这些标志物的表达水平的任何差异可以被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，持家基因与免疫应答测定中提供的方法结合使用。在某些实施方案中，一种或多种持家基因序列包括在测定方法中。在特定方法实施方案中，一种或多种持家基因选自abcf1、g6pd、gusb、hmbs、lmna、lrp1、polr2a、sdha、tbp、tfrc和tubb。在一些实施方案中，本公开内容提供了来自表达的核酸分子群的多个靶特异性序列的扩增。在一些实施方案中，所述方法包括将一个或多个靶特异性引物对杂交到靶序列，延伸引物对的第一引物，使来自核酸分子群体的延伸第一引物产物变性，将引物对的第二引物杂交到延伸第一引物产物，延伸第二引物以形成双链产物，和远离双链产物消化靶特异性引物对来产生多个扩增靶序列。在一些实施方案中，消化包括从扩增的靶序列中部分消化一种或多种靶特异性引物。在一些实施方案中，扩增靶序列可以连接到一个或多个衔接子。在一些实施方案中，衔接子可以包括一个或多个dna条码或标记序列。在一些实施方案中，扩增靶序列一旦连接到衔接子，可以经历切口平移反应和/或进一步扩增来产生衔接子连接的扩增靶序列库。在一些实施方案中，提供的方法包括制备和形成多种免疫应答靶特异性扩增子。在一些实施方案中，该方法包括将一个或多个靶特异性引物对与核酸分子杂交，延伸引物的第一引物，使来自核酸分子的延伸的第一引物变性，将引物对的第二引物与延伸的第一引物产物杂交，并延伸第二引物，消化靶特异性引物对以产生多个靶特异性扩增子。在一些实施方案中，可以在进行切口平移反应之前将衔接子连接至靶特异性扩增子的末端，以产生适合于核酸测序的多个靶特异性扩增子。在一些实施方案中，可以使用桥式扩增或empcr扩增一种或多种靶特异性扩增子，以产生适合于核酸测序的多种克隆模板。在一些实施方案中，本公开提供了用于制备靶特异性扩增子文库的方法，用于多种下游过程或测定例如核酸测序或克隆扩增中。在一个实施方案中，本公开提供了使用具有可切割基团的引物对具有多个表达的靶序列的核酸样品进行靶特异性多重pcr的方法。在某些实施方案中，待测序的文库和/或模板制备可以使用自动化系统，例如ioncheftm系统，使用本文提供的组合物从核酸样品群自动制备。在一个实施方案中，使用iontorrentpgm318tm或iontorrents5520tm或iontorrents5530tm系统测序的核酸模板可以使用本文概述的靶特异性扩增技术从核酸分子群制备。。任选地，在靶特异性扩增后，可以进行二级和/或三级扩增过程，包括但不限于文库扩增步骤和/或克隆扩增步骤如empcr。在一些实施方案中，提供了包含多个靶特异性引物对的组合物，每个引物对包含正向引物和反向引物，所述反向引物具有至少一个可切割基团，其位于a)3'末端或5'末端，和/或b)在靶特异性引物的中心核苷酸位置附近，并且其中靶特异性引物对可以与组合物中的其他引物对基本上不互补。在一些实施方案中，组合物包含至少50、100、150、200、250、300、350、398或更多个靶特异性引物对。在一些实施方案中，靶特异性引物对包含长度为约15个核苷酸至约40个核苷酸，其中至少一个核苷酸被可切割基团取代。在一些实施例中，可裂解基团可以是尿苷核苷酸。在一些实施方案中，靶特异性引物组被设计用于扩增与临床或病理状况相关的基因组的外显子、基因、外显子组或区域，例如，与癌症相关的一种或多种表达序列的扩增，其中表达的增加和/或降低与免疫应答的变化有关。在一些实施方案中，靶特异性引物组被设计为扩增与免疫应答的变化相关的基因组的外显子、基因、外显子组或区域，其中表达的增加和/或减少指示癌症患者应答一种或多种治疗剂的可能性。在一些实施方案中，靶特异性引物组被设计为扩增与临床或病理状况相关的基因组的外显子、基因、外显子组或区域，例如，与癌症相关的一种或多种突变的扩增。在一些实施方案中，当与靶序列杂交并如本文所概述的那样扩增时，靶特异性引物对可以产生长度为约100至约500个碱基对的衔接子连接的扩增靶序列文库。在一些实施方案中，与文库中衔接子连接的扩增的靶序列的其余部分相比，文库中没有一个衔接子连接的扩增的靶序列过表达超过30％。在一些实施方案中，衔接子连接的扩增的靶序列文库相对于gc含量、扩增的靶序列长度或解链温度(tm)基本上是同源的。在一些实施方案中，提供了用于进行多重pcr的试剂盒，其包含多个具有可切割基团的靶特异性引物、dna聚合酶、衔接子、datp、dctp、dgtp和dttp。在一些实施例中，可裂解基团可以是尿嘧啶核苷酸。试剂盒可以进一步包括一种或多种抗体、核酸条形码、纯化溶液或柱。在一些实施方案中，提供了用于产生靶特异性扩增子文库的试剂盒，其包含多个具有可切割基团的靶特异性引物、dna聚合酶、衔接子、datp、dctp、dgtp、dttp和切割试剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或多种抗体、核酸条形码、纯化溶液或柱。在一个实施方案中，提供了用于从单个核酸来源或样品扩增多个靶特异性序列的方法。在另一个实施方案中，提供了用于来自两种或更多种核酸来源、样品或物种的两种或更多种靶序列的靶特异性扩增的方法。例如，本公开内容设想单个核酸样品可包括表达的rna或固定的福尔马林石蜡包埋的(ffpe)rna。还设想样品可来自单个个体，来自遗传相关成员的核酸样品的集合，来自遗传无关成员的多个核酸样品，来自单个个体的(匹配的)多个核酸样品(例如肿瘤样品)和正常组织样品，或来自单一来源的遗传物质，所述单一来源含有两种不同形式的遗传物质，例如从母体受试者获得的母体和胎儿rna，或含有植物或动物核酸的样品中存在污染细菌rna。在一些实施方案中，核酸材料源可包括从新生儿获得的核酸，例如通常作为用于新生儿筛选的血液样品获得的核酸。核酸样品可包括高分子量物质，例如表达的rna或cdna。样品可包括低分子量材料，例如从ffpe获得的核酸分子或存档的rna样品。在另一个实施方案中，低分子量材料包括酶促或机械剪切的核酸样品。样品可包括无细胞循环rna，例如从母体受试者获得的材料。在一些实施方案中，样品可包括从活组织检查、肿瘤、刮屑、拭子、血液、粘液、尿液、血浆、精液、毛发、激光捕获微解剖、手术切除和其他临床或实验室获得的样品获得的核酸分子。在一些实施方案中，样品可包括从动物例如人或哺乳动物来源获得的核酸分子。在另一个实施方案中，样品可包括从非哺乳动物来源例如植物、细菌、病毒或真菌获得的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子的来源可以是存档的或灭绝的样品或物种。在一些实施方案中，提供的方法包括选择性扩增正常或患病的含有组织、活组织检查、核心、肿瘤、细针抽吸物、细针活组织检查、肿瘤微环境、血液、血清或其他样品中的至少一种靶序列。在一些实施方案中，提供的方法包括选择性扩增至少一种靶序列和检测和/或鉴定患病组织、活组织检查、核心、肿瘤、细针抽吸物、细针活组织检查、肿瘤微环境、血液、血清或其他样品中的突变。在一些实施方案中，患病或正常样品可包括完整转录组rna、福尔马林固定的石蜡包埋组织(ffpe)、剪切或酶处理的rna。在一些实施方案中，本公开内容涉及至少一种靶序列的选择性扩增和临床上可行的突变或表达模式的检测和/或鉴定。在一些实施方案中，本公开内容涉及检测和/或鉴定与药物抗性或药物敏感性相关的突变或表达。在一些实施方案中，提供的方法包括在无细胞循环rna中选择性扩增至少一种靶序列。在一些实施方案中，样品中至少一种靶序列的选择性扩增包括不同核酸分子的混合物。选择性扩增可任选地伴随检测和/或鉴定在循环rna中观察到的突变。在一些实施方案中，选择性扩增可任选地伴随检测和/或鉴定与癌症或遗传性疾病例如代谢、神经肌肉、发育，心血管、自身免疫或其他遗传性疾病相关的突变。在一些实施方案中，靶特异性引物和引物对是可以扩增核酸分子的特定区域的靶特异性序列。在一些实施方案中，靶特异性引物可以扩增表达的rna或cdna。在一些实施方案中，靶特异性引物可以扩增哺乳动物rna，例如人rna或由其制备的cdna。在一些实施方案中，选择性扩增所需的rna量可为约1ng至1微克。在一些实施方案中，选择性扩增一种或多种靶序列所需的rna量可为约1ng、约5ng或约10ng。在一些实施方案中，选择性扩增靶序列所需的rna量为约10ng至约200ng。在一些实施方案中，至少一种靶序列的选择性扩增还包括扩增的靶序列的核酸测序。任选地，所述方法进一步包括检测和/或鉴别经由经扩增的靶序列的核酸测序鉴别的样品中的突变。在一个实施方案中，可以使用本文公开的任何一种或多种靶特异性引物扩增含有一种或多种靶序列的样品。在另一个实施方案中，使用本文公开的方法(和相关组合物、系统、设备和试剂盒)获得的扩增的靶序列可以与下游过程相联，例如但不限于核酸测序。例如，一旦已知扩增的靶序列的核酸序列，就可以将该核酸序列与一种或多种参考样品例如hg19基因组进行比较。hg19基因组通常在基因组学领域中用作人类的参考基因组样品。设想本领域普通技术人员可以使用本文公开的引物标准容易地制备一种或多种靶特异性引物，而无需过多的实验。还设想本领域普通技术人员可以使用本文公开的标准容易地制备一种或多种靶特异性引物，以鉴定至少一种医学相关的多态性。在某些情况下，医学相关的多态性可用于法医或人类鉴定目的。医学相关突变包括与多个群体(例如，欧洲高加索人群)中的至少一种疾病状态相关的突变。在一些实施方案中，医学相关的多态性包括下文概述的任何一种或多种多态性。在一些实施方案中，提供了用于减少多重pcr中扩增假象的形成的方法(和相关组合物、系统、装置和试剂盒)。在一些实施方案中，与现有技术的标准多重pcr相比，以较低的数量或产率获得引物二聚体或非特异性扩增产物。在一些实施方案中，扩增假象的减少部分地由多重pcr反应中靶特异性引物对的使用决定。在一个实施方案中，多重pcr反应中靶特异性引物对的数量可以大于50、100、150、200、250、300或更多。在一些实施方案中，提供了使用含有可切割基团的靶特异性引物进行多重pcr的方法(和相关组合物、系统、装置和试剂盒)。在一个实施方案中，含有可切割基团的靶特异性引物可以包括每个引物对的每个引物的一个或多个可切割部分。在一些实施方案中，含有可切割基团的靶特异性引物包括通常不存在于非患病样品中的核苷酸，也不是经历多重pcr的核酸群体的天然核苷酸。例如，靶特异性引物可包括一种或多种非天然核酸分子，例如但不限于胸腺嘧啶二聚体、8-氧代-2'-脱氧鸟苷、肌苷、脱氧尿苷、溴脱氧尿苷、脱嘌呤核苷酸等。在一些实施方案中，提供的方法(和相关的组合物，系统等)涉及从核酸群体进行靶序列的初级扩增，任选地使用靶特异性引物。在一些实施方案中，提供的方法涉及使用靶特异性正向和反向引物对扩增靶序列。靶特异性正向和反向引物对可任选地包括一个或多个内含子特异性和/或外显子特异性正向和反向引物对。在一些实施方案中，每个引物对针对单个或离散的外显子。在一些实施方案中，提供的方法涉及使用含有至少一个可切割基团的外显子特异性正向和反向引物对扩增靶序列。在一些实施方案中，靶特异性正向和反向引物对含有尿嘧啶核苷酸作为一个或多个可切割基团。在一个实施方案中，靶特异性引物对可以在每个引物对的每个正向和反向引物中包含尿嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，靶特异性正向或反向引物含有一个、两个、三个或更多个尿嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，提供的方法涉及使用含有至少两个尿嘧啶核苷酸的正向和反向引物对从具有多个靶序列的核酸群扩增至少10、50、100、150、200、250、300、350、398或更多个靶序列。在一些实施方案中，可以使用根据指定设计标准产生寡核苷酸序列的算法从头设计靶特异性引物(包括但不限于内含子特异性和外显子特异性引物，其可以是正向和/或反向引物)。例如，可以根据本文指定的任何一种或多种标准选择引物。在一些实施方案中，选择或设计一种或多种靶特异性引物以满足以下标准中的任何一个或多个：(1)在引物序列内包含两个或更多个修饰的核苷酸，其中至少一个包括在引物的末端附近或末端处，并且其中至少一个包含在引物序列的中心核苷酸位置处或附近；(2)引物长度约15至约40个碱基；(3)tm为约60℃至约70℃；(4)与靶基因组或目标样品中存在的非靶序列的低交叉反应性；(5)对于给定反应中的每个引物，至少前四个核苷酸的序列(从3'到5'方向)与同一反应中存在的任何其他引物内的任何序列不互补；(6)没有扩增子包括与任何其他扩增子内的任何序列互补的至少5个核苷酸的任何连续段。在一些实施方案中，靶特异性引物包括一个或多个引物对，其设计用于扩增来自样品的靶序列，其长度为约100个碱基对至约500个碱基对。在一些实施方案中，靶特异性引物包括设计用于扩增靶序列的多个引物对，其中预测扩增的靶序列的长度彼此变化不超过50％，通常不超过25％，甚至通常不超过10％或5％。例如，如果选择或预测一个靶特异性引物对以扩增长度为100个核苷酸的产物，则选择或预测其他引物对以扩增长度在50-150个核苷酸之间的产物，通常长度为75-125个核苷酸，甚至更通常为90-110个核苷酸，或95-105个核苷酸，或长度为99-101个核苷酸。在一些实施方案中，根据任何预定的选择标准，不是从头设计扩增反应中的至少一个引物对。例如，至少一个引物对可以是随机选择或产生的寡核苷酸序列，或者先前为其他应用选择或产生的寡核苷酸序列。在一个示例性实施方案中，扩增反应可包括至少一种选自探针试剂(rochemolecularsystems)的引物对。试剂包括标记的探针，尤其可用于测量样品中存在的靶序列的量，可选地实时进行。taqman技术的一些例子公开在美国专利5,210,015、5,487,972、5,804,375、6,214,979、7,141,377和7,445,900中，其全部内容在此引入作为参考。在一些实施方案中，扩增反应中的至少一种引物可以例如用光学可检测的标记进行标记，以促进特定的目标应用。例如，标记可以促进靶模板和/或扩增产物的定量、靶模板和/或扩增产物的分离等等。在一些实施方案中，扩增反应中的一个或多个引物可用于核酸样品的基因分型。在一些实施方案中，靶特异性引物可以作为一组靶特异性引物对在单个扩增容器中提供。在一些实施方案中，靶特异性引物可以以一个或多个等分的靶特异性引物对提供，所述靶特异性引物对可以在单个扩增容器或反应室中进行多重pcr反应之前合并。在一个实施方案中，靶特异性引物可以作为靶特异性正向引物库和单独的靶特异性反向引物库提供。在另一个实施方案中，可以将靶特异性引物对合并成子集，例如非重叠的靶特异性引物对。在一些实施方案中，靶特异性引物对的库可以在单个反应室或微孔中提供，例如在pcr板上提供，以使用热循环仪进行多重pcr。在一些实施方案中，靶特异性正向和反向引物对可以与靶序列基本上互补。在一些实施方案中，进行多重pcr扩增的方法包括使具有正向和反向引物的多个靶特异性引物对与靶序列群体接触以形成多个模板/引物双螺旋；持续足够时间并在足够温度下将dna聚合酶和dntp混合物添加到所述多个模板/引物双螺旋中以经由模板依赖性合成延伸每一靶特异性引物对中的正向或反向引物(或两者)，进而产生多个延伸引物产物/模板双螺旋；使延伸引物产物/模板双螺旋变性；将来自靶特异性引物对的互补引物结合到延伸引物产物；以及在dna聚合酶和dntp存在下延伸结合引物以形成多个靶特异性双链核酸分子。在一些实施方案中，扩增pcr方法的步骤可以以任何顺序进行。在一些情况下，可以进一步优化本文公开的方法以去除一个或多个步骤，并且仍然获得足够的扩增的靶序列以用于各种下游过程。例如，可以修改纯化或清除步骤的数量以包括比本文公开的更多或更少的步骤，条件是以足够的产率产生扩增的靶序列。在一些实施方案中，靶特异性引物对在引物的3'或5'末端不含有共同的延伸(尾部)。在另一个实施方案中，靶特异性引物不含tag或通用序列。在一些实施方案中，靶特异性引物对被设计为消除或减少促进非特异性扩增形成的相互作用。在一个实施方案中，靶特异性引物对包含每个正向和反向靶特异性引物的至少一个可切割基团。在一个实施方案中，可切割基团可以是尿嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，在产生扩增的靶序列后部分或基本上除去靶特异性引物对。在一个实施方案中，去除可以包括酶、热或碱处理作为扩增的靶序列的一部分的靶特异性引物对。在一些实施方案中，进一步处理扩增的靶序列以形成平端扩增产物，在本文中称为平端扩增的靶序列。需要新的方法、计算机可读介质和系统，用于鉴定或设计使用pcr来富集一个或多个目标基因组区域(其可以是例如1kb至1mb的累积区域)用于后续测序的产品或试剂盒。需要用于鉴定或设计产品或试剂盒的新方法、计算机可读介质和系统，所述产品或试剂盒包括使一种或多种基因组区域或目标靶标的覆盖最大化同时使脱靶杂交、引物数量和引物库数量的一种或多种最小化的引物或测定法。根据本申请中体现的教导内容和原理，提供了新的方法、计算机可读介质和系统，其坚定或设计使用pcr来富集一个或多个目标基因组区域或靶标以用于后续测序的产品或试剂盒，和/或包括使一个或多个目的基因组区域或靶标的覆盖度最大化同时使脱靶杂交、引物数量和引物库数量的一种或多种最小化的引物或测定法。根据示例性实施方案，提供了一种方法，包括：(1)接收或提供基因组靶区域和所述基因组靶区域的一组候选扩增子作为输入；(2)生成包括源顶点、与该组候选扩增子对应排列的一组扩增子顶点和汇顶点的图形；(3)确定与通过扩增子顶点从源顶点到汇顶点的图形上的一条或多条路径相关联的成本；(4)从相关联的成本最低的图中一条或多条路径中的一条路径提取扩增子顶点。在各种实施方案中，所述一条或多条路径可包含扩增子序列，其中扩增子序列中第一扩增子的插入物的末端部分与扩增子序列中第二扩增子的插入物的起始部分重叠。扩增子序列中第二扩增子插入物的末端部分可以与扩增子序列中第三扩增子插入物的起始部分重叠。扩增子序列中第三扩增子插入物的末端部分可以与扩增子序列中第四扩增子插入物的起始部分重叠。在各种实施方案中，所述一条或多个条路径可包含n个扩增子的序列，n为正整数，其中扩增子序列中扩增子amp的插入物的末端部分与扩增子序列中扩增子amp+1的插入物的起始部分重叠，其中amp是取数值1,...,n-1的整数。一条或多条路径可以包括l＝n+m个扩增子的序列，n和m是正整数，其中扩增子序列中的扩增子amp的插入物的末端部分重叠(可以仅包括触摸)扩增子序列中扩增子amp+1的插入物的起始部分，其中amp是取值为1,...,n-1的整数；其中扩增子序列中扩增子amp插入物的末端部分与扩增子序列中扩增子amp+1的插入物的起始部分重叠(可仅包括触摸)，其中amp是取值为n+1,...,n+m-1的整数；并且其中在扩增子amp＝n的插入物的末端部分和扩增子amp＝n+1的插入物的起始部分之间存在间隙。在各种实施方案中，与一条或多条路径中的每一条相关联的成本可以是链接两个扩增子顶点的路径的每个边缘的成本的总和。与连接两个扩增子顶点的路径的每个边缘相关联的成本可以是与边缘的目的地扩增子顶点的成本相关的第一项和与边缘的目的地扩增子的插入物和边缘的起源扩增子的插入物之间的重叠的成本相关的第二项的总和。可以通过混合因子对第一项和第二项进行加权，使得第一项乘以混合因子或其函数，并且第二项乘以1减去混合因子或其函数。扩增子顶点的成本可以是沿第一值和第二值之间的标度的数值，所述第一值表示选自至少包含脱靶扩增水平和引物二聚体倾向水平的组的一个或多个不期望特征的较低水平，所述第二值表示所述一个或多个不期望特征的较高水平。边缘的目的地扩增子的插入物与边缘的起源扩增子的插入物之间的重叠的成本可以基于由重叠插入物引入的冗余来确定。边缘的目的地扩增子的插入物与边缘的起源扩增子的插入物之间的重叠的成本可以是边缘的目的地扩增子的插入物与边缘的起源扩增子的插入物之间的重叠中碱基对的数量和边缘的目的地扩增子的插入物与边缘的起源扩增子的插入物的联合中碱基对数量之间的商的函数。根据示例性实施方案，提供了一种包括指令的非暂时性机器可读存储介质，所述指令在由处理器执行时使处理器执行包括以下步骤的方法：(1)接收或提供基因组靶区域和所述基因组靶区域的一组候选扩增子作为输入；(2)生成包括源顶点、与该组候选扩增子对应排列的一组扩增子顶点和汇顶点的图形；(3)确定与通过扩增子顶点从源顶点到汇顶点的图形上的一条或多条路径相关联的成本；(4)从相关联的成本最低的图中一条或多条路径中的一条路径提取扩增子顶点。在一些实施方案中，这种方法可以扩展到通过使用对应于提取的顶点的扩增子作为输入在多个库中汇集扩增子的方法。根据示例性实施方案，提供了一种系统，其包括：(1)机器可读存储器；和(2)处理器，其被配置为执行机器可读指令，当由处理器执行时，所述指令使得系统执行包括以下的步骤：(a)接收或提供基因组靶区域和所述基因组靶区域的一组候选扩增子作为输入；(b)生成包括源顶点、与该组候选扩增子对应排列的一组扩增子顶点和汇顶点的图形；(c)确定与通过扩增子顶点从源顶点到汇顶点的图形上的一条或多条路径相关联的成本；(d)从相关联的成本最低的图中一条或多条路径中的一条路径提取扩增子顶点。在一些实施方案中，通过使用对应于提取的顶点的扩增子作为输入，这样的系统可以扩展到用于跨多个库汇集扩增子的系统。根据各种示例性实施方案，可以使用适当配置和/或编程的硬件和/或软件元件来执行或实施上述教导内容和/或示例性实施方案中的任一个或多个的一个或多个特征。确定是否使用硬件和/或软件元件来实施实施方案可以基于任何数量的因素，如期望的计算速率、功率水平、耐热性、处理周期预算、输入数据速率、输出数据速率、存储器资源、数据总线速度等以及其它设计或性能限制。硬件元件的实例可以包括通过以下各项通信耦合的处理器、微处理器、一个或多个输入设备和/或一个或多个输出设备(i/o)(或外围设备)：本地接口电路、电路元件(例如晶体管、电阻器、电容器、电感器等)、集成电路、专用集成电路(asic)、可编程逻辑设备(pld)、数字信号处理器(dsp)、现场可编程门阵列(fpga)、逻辑门、寄存器、半导体设备、芯片、微芯片、芯片组等。本地接口可以包括例如一个或多个总线或其它有线或无线连接、控制器、缓冲器(高速缓存器)、驱动器、中继器和接收器等以允许硬件组件之间的适当通信。处理器是用于执行软件的硬件设备，尤其是储存在存储器中的软件。处理器可以是任何定制的或市售的处理器、中央处理单元(cpu)、与计算机相关联的若干处理器中的辅助处理器、基于半导体的微处理器(例如呈微芯片或芯片组的形式)、宏处理器、或用于执行软件指令的任何设备。处理器还可以表示分布式处理架构。i/o设备可以包括输入设备，例如键盘、鼠标、扫描仪、麦克风、触摸屏、用于各种医疗设备和/或实验室仪器的接口、条形码读取器、触笔、激光读取器、射频设备读取器等。此外，i/o设备还可以包括输出设备，例如打印机、条形码打印机、显示器等。最后，i/o设备可以进一步包括作为输入件和输出件进行通信的设备，例如调制器/解调器(调制解调器；用于访问另一个设备、系统或网络)、射频(rf)或其它收发器、电话接口、桥接器、路由器等软件的实例可以包括软件组件、程序、应用、计算机程序、应用程序、系统程序、机器程序、操作系统软件、中间件、固件、软件模块、例程、子例程、函数、方法、过程、软件接口、应用程序接口(api)、指令集、计算代码、计算机代码、代码段、计算机代码段、单词、值、符号或其任何组合。存储器中的软件可以包括一个或多个单独的程序，所述程序可以包括用于实施逻辑函数的有序的可执行指令列表。存储器中的软件可以包括用于根据本教导内容标识数据流的系统和任何合适的定制或市售的操作系统(o/s)，其可以控制其它计算机程序如系统的执行，并提供调度、输入输出控制、文件和数据管理、存储管理、通信控制等。根据各种示例性实施方案，可以使用可以储存指令或指令集的适当地配置和/或编程的非暂时性机器可读介质或物件来执行或实施上述教导内容和/或示例性实施方案中的任一个或多个的一个或多个特征，所述指令或指令集如果由机器执行，则可以使机器执行根据示例性实施方案的方法和/或操作。这样的机器可以包括例如任何合适的处理平台、计算平台、计算设备、处理设备、计算系统、处理系统、计算机、处理器、科学或实验室仪器等，并且可以使用硬件和/或软件的任何合适的组合来实施。机器可读介质或物件可以包括例如任何合适类型的存储器单元、存储器设备、存储器物件、存储器介质、储存设备、储存物件、储存介质和/或储存单元，例如存储器、可移动介质或不可移动介质、可擦除介质或不可擦除介质、可写或可重写介质、数字或模拟介质、硬盘、软盘、只读存储器光盘(cd-rom)、可刻录光盘(cd-r)、可重写光盘(cd-rw)、光盘、磁介质、磁光介质、可移动存储卡或磁盘、各种类型的数字多功能光盘(dvd)、磁带、磁带盒等，包括适用于计算机的任何介质。存储器可以包括易失性存储器元件(例如随机存取存储器(ram，如dram、sram、sdram等))和非易失性存储器元件(例如rom、eprom、eerom、闪存器、硬盘驱动器、磁带、cdrom等)中的任一个或组合。此外，存储器可以并入电子、磁性、光学和/或其它类型的储存介质。存储器可以具有分布式架构，其中各种组件远离彼此定位，但仍然通过处理器访问。指令可以包括使用任何合适的高级的、低级的、面向对象的、可视的、编译的和/或解释的编程语言实施的任何合适类型的代码，如源代码、编译代码、解释代码、可执行代码、静态代码、动态代码、加密代码等。根据各种示例性实施方案，可以至少部分地使用分布式、群集、远程或云计算资源来执行或实施上述教导内容和/或示例性实施方案中的任一个或多个的一个或多个特征。根据各种示例性实施方案，可以使用源程序、可执行程序(对象代码)、脚本或包含一组待执行指令的任何其它实体来执行或实施上述教导内容和/或示例性实施方案中的任一个或多个的一个或多个特征。当源程序时，所述程序可以通过可以包括或不包括在存储器中的编译器、汇编器、解释器等翻译以便与o/s一起正确地操作。指令可以使用以下各项来书写：(a)具有数据类和方法类的面向对象的编程语言；或(b)具有例程、子例程和/或函数的过程编程语言，可以包括例如c、c++、pascal、basic、fortran、cobol、perl、java和ada。根据各种示例性实施方案，上述示例性实施方案中的一个或多个可以包括向使用者接口设备、计算机可读储存介质、本地计算机系统或远程计算机系统发送、显示、储存、打印或输出与可以通过这类示例性实施例生成、访问或使用的任何信息、信号、数据和/或中间结果或最终结果有关的信息。举例来说，这种发送、显示、储存、打印或输出的信息可以采用可搜索和/或可过滤的运行和报告、图片、表格、图表、图形、电子表格、相关性、序列和其组合列表的形式。可以通过重复、添加或替换在一个或多个上述示例性实施方案中阐述的任何一般或具体描述的特征和/或组件和/或物质和/或步骤和/或操作条件来导出各种另外的示例性实施方案。此外，应该理解，只要步骤或动作的目的仍然可以实现，步骤的顺序或执行某些动作的顺序是不重要的，除非另外特别说明。此外，除非特别说明，否则可以同时进行两个或更多个步骤或动作，只要步骤或动作的目标仍然可实现。此外，除非另外特别说明，在上述示例性实施方案的一个中提到的任何一个或多个特征、组件、方面、步骤或其他特征可以被认为是上述示例性实施方案的任何另一个的潜在的可选特征、组件、方面、步骤或其他特征，只要上述示例性实施方案的该任何另一个的目的仍然是可实现的。在一些实施方案中，通过本文公开的方法产生的扩增的靶序列代表从多个靶序列扩增的一个或多个外显子的至少60％、70％、80％、90％或更多。在一个实施方案中，本发明的扩增的靶序列长度为约90至约140个碱基对，长度为约100至约200个碱基对，长度为约100至约300个碱基对，或长度约100至约400个碱基对。在一个实施方案中，扩增的靶序列包括每个引物对的正向引物的长度和互补反向引物的长度。在另一个实施方案中，扩增的靶序列长度包括反向引物的长度和互补正向引物的长度。在一些实施方案中，扩增的靶序列的长度减去正向和反向引物长度为约40个碱基对至约350个碱基对。在一些实施方案中，在多重pcr反应中产生的扩增的靶序列的长度基本相同。如本文所定义，关于通过本文公开的方法产生的扩增的靶序列的长度，“基本上相同”是指在扩增的靶序列的总数上核苷酸长度的偏差不超过30％。在一个实施方案中，扩增子的gc含量百分比小于85％、小于75％、小于65％、小于60％或小于50％。在一个实施方案中，反应中基本上所有扩增的靶序列含有30％至小于85％的gc含量。在一个实施方案中，其中核酸分子是从存档的或ffperna样品中获得的，扩增的靶序列的长度通常为约100至约200个碱基对的长度。在一个实施方案中，如果核酸样品是从表达的rna或cdna衍生或获得的，则扩增的靶序列的长度可以是约100至约500个碱基对的长度。在一些实施方案中，所提供方法的扩增的靶序列可以在进行或不进行进一步纯化或操作的情况下用于各种下游分析或测定。例如，可以通过本领域已知的技术克隆扩增的靶序列，例如桥式扩增或empcr，以产生可用于下一代测序的模板文库。在一些实施方案中，所提供方法的扩增靶序列或所得模板文库可用于单核苷酸多态性(snp)分析，基因分型或表观遗传分析，拷贝数变异分析，基因表达分析，基因突变分析，包括但不限于检测、预后和/或诊断，检测和分析罕见或低频等位基因突变，核酸测序，包括但不限于从头测序、靶向重测序和合成装配分析。在一个实施方案中，扩增的靶序列可用于检测小于5％等位基因频率的突变。在一些实施方案中，本文公开的方法可用于检测核酸群中的突变，其具有小于4％、3％、2％或约1％的等位基因频率。在另一个实施方案中，可以对如本文所述制备的扩增的靶序列进行测序以检测和/或鉴定来自核酸分子群的种系或体细胞突变。在一些实施方案中，靶特异性引物对中的正向和/或反向靶特异性引物可以与核酸分子群“互补”或“基本上互补”。如本文所述，“与核酸分子群基本上互补”是指引物与引物将与之杂交的核酸分子之间的互补百分比。如本文所用的术语“基本上互补”是指至少70％的互补性。因此，基本上互补是指引物和核酸分子之间的互补性的至少70％但小于100％的互补性范围。互补引物是与核酸分子具有100％互补性的引物。在一个实施方案中，设计每个靶特异性引物对以使在相同多重pcr反应中与另一引物(或引物对)的交叉杂交最小化(即，降低引物二聚体的普遍性)。在另一个实施方案中，设计每个靶特异性引物对以使与核酸分子群中的非特异性核酸序列的交叉杂交最小化(即，使靶外杂交最小化)。在一个实施方案中，设计每种靶特异性引物以使自身互补性、发夹结构或其他二级结构的形成最小化。在一些实施方案中，扩增的靶序列通过聚合酶链式反应形成。可以使用一种或多种dna聚合酶完成靶特异性引物的延伸。在一个实施方案中，聚合酶可以是任何家族adna聚合酶(也称为poli家族)或任何家族bdna聚合酶。在一些实施方案中，与非重组dna聚合酶相比，dna聚合酶可以是能够以更高的准确度和产率延伸靶特异性引物的重组形式。例如，聚合酶可包括高保真聚合酶或热稳定聚合酶。在一些实施方案中，靶特异性引物延伸的条件可包括“热启动”条件，例如热启动聚合酶，例如amplitaqdna聚合酶(appliedbiosciences)、taqdna聚合酶高保真(invitrogen)或kod热启动dna聚合酶(emdbiosciences)。“热启动”聚合酶包括热稳定聚合酶和一种或多种在环境温度下抑制dna聚合酶和3'-5'核酸外切酶活性的抗体。在某些情况下，“热启动”条件可包括适体。在一些实施方案中，聚合酶可以是酶，例如taq聚合酶(来自水生栖热菌(thermusaquaticus))，tfi聚合酶(来自thermusfiliformis)，bst聚合酶(来自嗜热脂肪芽孢杆菌)，pfu聚合酶(来自激烈火球菌(pyrococcusfuriosus))，tth聚合酶(来自嗜热菌(thermusthermophilus)，pow聚合酶(来自pyrococcuswoesei)，tli聚合酶(来自斜纹热球菌(thermococcuslitoralis))，ultima聚合酶(来自海栖热袍菌(thermotogamaritima))，kod聚合酶(来自极端嗜热古生菌(thermococcuskodakaraensis))，poli和ii聚合酶(来自pyrococcusabyssi)和pab(来自pyrococcusabyssi)。在一些实施方案中，dna聚合酶可包括至少一种聚合酶，例如amplitaqdna聚合酶(appliedbiosciences)，dna聚合酶的stoffel片段(roche)，kod聚合酶(emdbiosciences)，kod热启动聚合酶(emdbiosciences)，deepventtmdna聚合酶(newenglandbiolabs)，phusion聚合酶(newenglandbiolabs)，klentaq1聚合酶(dnapolymerasetechnology，inc)，klentaqlongaccuracypolymerase(dnapolymerasetechnology，inc)，omniklentaqtmdna聚合酶(dna)polymerasetechnology，inc)，omniklentaqtmladna聚合酶(dnapolymerasetechnology，inc)，taqdna聚合酶(invitrogen)，hemoklentaqtm(newenglandbiolabs)，taqdnapolymerasehighfidelity(invitrogen)，pfx(invitrogen)，accuprimetmpfx(invitrogen)，或accuprimetmtaqdnapolymerasehighfidelity(invitrogen)。在一些实施方案中，dna聚合酶可以是热稳定的dna聚合酶。在一些实施方案中，dntp的混合物可以以随机或定义的顺序同时或顺序施用。在一些实施方案中，多重反应中存在的dna聚合酶的量显著高于相应的单重pcr反应中使用的dna聚合酶的量。如本文所定义，术语“显著更高”是指与相应的单重pcr反应相比，多重pcr反应中存在的dna聚合酶浓度至少高3倍。在一些实施方案中，扩增反应不包括扩增产物的环化，例如通过滚环扩增所公开的。在一些实施方案中，本公开内容的方法包括选择性扩增含有多个核酸分子的样品中的靶序列，并将扩增的靶序列连接至至少一个衔接子和/或条形码。用于分子生物学文库制备技术的衔接子和条形码是本领域技术人员熟知的。本文使用的衔接子和条形码的定义与本领域中使用的术语一致。例如，条形码的使用允许每个多重反应检测和分析多个样品、来源、组织或核酸分子群。条形码和扩增的靶序列含有独特的核酸序列，通常是短的6-15个核苷酸序列，其鉴定和区分一个扩增的核酸分子与另一个扩增的核酸分子，即使当减去条形码的两个核酸分子都包含相同的核酸序列时也是如此。衔接子的使用允许以均匀的方式扩增每个扩增的核酸分子并有助于减少链偏差。衔接子可以包括通用衔接子或专用衔接子，这两者都可以在下游使用以执行一个或多个不同的功能。例如，通过本文公开的方法制备的扩增的靶序列可以连接到可以在下游用作克隆扩增平台的衔接子。衔接子可以作为模板链用于随后使用第二组引物进行扩增，因此允许衔接子连接的扩增靶序列的通用扩增。在一些实施方案中，靶核酸的选择性扩增以产生扩增子库可以进一步包括将一个或多个条形码和/或衔接子连接至扩增的靶序列。结合条形码的能力提高了样品通量，并允许同时分析多个样品或材料来源。在一个实例中，通过提供的方法制备的扩增的靶核酸分子可以连接到iontorrenttm测序衔接子(a和p1衔接子，作为ionfragmentlibrarykit的组分出售，lifetechnologies，部件号4466464)或iontorrenttmdna条形码(lifetechnologies，部件号4468654)。本文公开的方法涉及通过聚合酶链式反应(pcr)扩增多个靶序列。在一些实施方案中，多重pcr包括将一个或多个靶特异性引物对与核酸分子杂交，在dna聚合酶和dntp存在下通过模板依赖性合成延伸靶特异性引物对的引物；重复杂交和延伸步骤足够的时间和足够的温度，产生多个扩增的靶序列。在一些实施方案中，多重扩增反应方法的步骤可以以任何顺序进行。成功多重扩增所需的核酸材料的量可为约1ng。在一些实施方案中，核酸材料的量可为约10ng至约50ng、约10ng至约100ng或约1ng至约200ng的核酸材料。可以使用更高量的输入材料，然而本公开的一个方面是从大约低(ng)的起始材料选择性地扩增多个靶序列。本文公开的多重pcr扩增反应可包括通常在热循环仪上进行的多个“循环”。每个循环包括至少一个退火步骤和至少一个延伸步骤。在一个实施方案中，进行多重pcr扩增反应，其中靶特异性引物对与靶序列杂交；延伸杂交的引物，产生延伸的引物产物/核酸双链体；使延伸的引物产物/核酸双链体变性，使互补引物与延伸的引物产物杂交，其中延伸互补引物以产生多个扩增的靶序列。在一个实施方案中，本文公开的方法每个预扩增反应具有约5至约18个循环。每个循环的退火温度和/或退火持续时间可以相同；可以包括增量增加或减少，或两者的组合。每个循环的延伸温度和/或延伸持续时间可以相同；可以包括增量增加或减少，或两者的组合。例如，退火温度或延伸温度可以每循环保持恒定。在一些实施方案中，退火温度可以在每个循环中保持恒定，并且延伸持续时间可以每个循环递增地增加。在一些实施方案中，持续时间的增加或减少可以以15秒、30秒、1分钟、2分钟或4分钟的增量发生。在一些实施方案中，温度的升高或降低可以发生为0.5、1、2、3或4摄氏度的偏差。在一些实施方案中，可以使用热启动pcr技术进行扩增反应。这些技术包括在聚合开始之前使用加热步骤(>60℃)，以减少不期望的pcr产物的形成。其他技术，例如反应的一种或多种关键试剂例如镁或dna聚合酶的可逆失活或物理分离，可以在蜡珠中隔离，其在变性步骤中加热反应时熔化，仅在更高的温度下释放试剂。dna聚合酶也可以通过与适体或抗体结合而保持活性状态。这种结合在较高温度下被破坏，释放出可以不受阻碍地进行pcr的功能性dna聚合酶。在一些实施方案中，所公开的方法可任选地包括破坏一种或多种含引物的扩增假象，例如引物-二聚体、二聚体-二聚体或超级扩增子。在一些实施方案中，破坏可任选地包括处理引物和/或扩增产物，以便切割引物和/或扩增产物中存在的特定可切割基团。在一些实施方案中，治疗可包括一种或多种靶特异性引物的部分或完全消化。在一个实施方案中，治疗可包括从扩增产物中除去至少40％的靶特异性引物。可裂解处理可包括酶、酸、碱、热、光或化学活性。可切割的处理可导致引物的一个或多个核苷酸之间或扩增产物的一个或多个核苷酸之间的连接的切割或其他破坏。引物和/或扩增产物可任选地包括一个或多个修饰的核苷酸或核碱基。在一些实施方案中，切割可以选择性地发生在这些位点，或与修饰的核苷酸或核碱基相邻。在一些实施方案中，扩增的靶序列的切割或处理可导致磷酸化的扩增的靶序列的形成。在一些实施方案中，扩增的靶序列在5'末端被磷酸化。在一些实施方案中，模板、引物和/或扩增产物包括可被特定酶识别的核苷酸或核碱基。在一些实施方案中，核苷酸或核碱基可以被特定酶结合。任选地，特定酶还可以在一个或多个位点切割模板、引物和/或扩增产物。在一些实施方案中，此类切割可发生在模板、引物和/或扩增产物内的特定核苷酸处。例如，模板、引物和/或扩增产物可包括一个或多个核苷酸或核碱基，其包括尿嘧啶，其可被酶识别和/或切割，例如尿嘧啶dna糖基化酶(udg，也称为ung)或甲脒嘧啶dna糖基化酶(fpg)。模板、引物和/或扩增产物可包括一个或多个核苷酸或核碱基，包括rna特异性碱基，其可被酶如rnaseh识别和/或切割。在一些实施方案中，模板、引物和/或扩增产物可包括一个或多个无碱基位点，其可使用各种校正聚合酶或腺苷三磷酸双磷酶处理来识别和/或切割。在一些实施方案中，模板、引物和/或扩增产物可包括7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤(8-oxog)核碱基，其可被酶如fpg识别或裂解。在一些实施方案中，一种或多种扩增的靶序列可以被fupa试剂部分消化。在一些实施方案中，引物和/或扩增产物包括一种或多种修饰的核苷酸，其包括通过化学键与其他核苷酸(例如互补核酸链中的核苷酸)结合的碱基(例如碱基对)。在一些实施方案中，化学键受到特定的化学攻击，其选择性地切割修饰的核苷酸(或选择性地切割修饰的核苷酸和引物和/或扩增产物内的相邻核苷酸之间的一个或多个共价连接)，但使其他核苷酸不受影响。例如，在一些实施方案中，修饰的核苷酸可以与互补链中的其他核苷酸形成亚硫酸氢盐键。这种亚硫酸氢盐键可以通过合适的处理进行氧化。类似地，某些修饰的核苷酸可以通过可以通过碱处理选择性破坏的连接与互补核酸链中的其他核苷酸碱基配对。在一些实施方案中，引物和/或扩增产物包括一个或多个修饰的核苷酸，其通过相对于天然碱基之间形成的典型碱基配对键表现出降低的热稳定性的键，与互补核酸链中的其他核苷酸结合(例如碱基对)。通过在扩增后将引物和/或扩增产物暴露于升高的温度，可以选择性地破坏这种降低热稳定性的连接。在一个示例性实施方案中，扩增引物在设计上是亚硫酸氢盐，具有与3'靶特异性正向引物连接的5'通用正向扩增序列，或与3'靶特异性反向引物连接的5'通用反向扩增序列。两种引物都含有修饰的核苷酸。在一些实施方案中，合成与核酸模板链的不连续区段互补并且可与其杂交的引物，包括：可与模板的5'区域杂交的引物，其包含与正向或反向扩增引物互补的序列。在一些实施方案中，正向引物、反向引物或两者不共享共同的核酸序列，使得它们与不同的核酸序列杂交。例如，可以制备靶标特异性正向和反向引物，其不与引物库内的其他引物对竞争以扩增相同的核酸序列。在该实例中，不与引物库中的其他引物对竞争的引物对有助于减少非特异性或假扩增产物。在一些实施方案中，每个引物对的正向和反向引物是独特的，因为每个引物的核苷酸序列是非互补的并且与引物对中的其他引物不同。在一些实施方案中，引物对的差异可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％的核苷酸同一性。在一些实施方案中，每个引物对中的正向和反向引物与引物库或多重反应中的其他引物对是非互补的或不相同的。例如，引物库或多重反应中的引物对可以与引物库或多重反应中的其他引物对相差至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、或至少70％的核苷酸同一性。引物设计用于最小化引物-二聚体、二聚体-二聚体或其他非特异性扩增产物的形成。通常，优化引物以在扩增反应期间降低gc偏差和低熔解温度(tm)。在一些实施方案中，引物被设计拥有约55℃至约72℃的tm。在一些实施方案中，引物库的引物可以具有约59℃至约70℃、60℃至约68℃、或60℃至约65℃的tm。在一些实施方案中，引物库可以具有偏差不超过5℃的tm。在一些实施方案中，靶特异性引物不含碳-间隔基或末端接头。在一些实施方案中，靶特异性引物或扩增的靶序列不含酶、磁、光或荧光标记。模板可以包括3'区域，其包含围绕特定基因或感兴趣区域的上游或下游区域的序列，使得感兴趣区域被正向扩增/上游基因特异性融合以及反向扩增/下游感兴趣区域融合引物括起来。在一些实施方案中，内部分离子序列可以分离可以与扩增和基因特异性引物杂交的模板区域，并且这可以充当后续下游应用(例如测序等)的密钥或条形码。在一些实施方案中，条形码或者密钥可以结合到每个扩增产物中以辅助数据分析和例如编目。在一些实施方案中，条形码可以是iontorrenttmdna条形码(lifetechnologies)。在一些实施方案中，引物包括足够数量的经修饰的核苷酸以允许通过切割处理在功能上完全降解引物，但不能在这种切割处理之前干扰引物的特异性或功能性太多，例如在扩增反应中。在一些实施方案中，引物包括至少一个修饰的核苷酸，但引物的不超过75％的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，包括至少一种修饰的核苷酸的多种不同引物可用于单一扩增反应。例如，可以将包含修饰的核苷酸的多重引物添加到扩增反应混合物中，其中每个引物(或引物组)选择性地与核酸群体内的不同靶核酸分子杂交并促进其扩增。在一些实施方案中，可以以至少约12重、24重、48重、74重、96重、120重、144重、168重、192重、216重、240重、264重、288重、312重、336重、360重、384重或398重的重数将不同的引物组合添加到扩增反应中。在一些实施方案中，修饰的引物在引物的末端附近或末端含有至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的引物在引物序列内含有两个或更多个修饰的核苷酸。在一个示例性实施方案中，引物序列在引物序列的末端附近或末端含有尿嘧啶。出于本公开的目的，引物序列的“附近”或“在末端”是指距引物序列的末端多达10个核苷酸。在一些实施方案中，引物序列含有位于引物序列的中心核苷酸位置处或附近的尿嘧啶。出于本公开的目的，“在引物序列的中心核苷酸位置处或附近”是指在引物序列的中心核苷酸处或在8个核苷酸内以3'或5'方向掺入尿嘧啶部分，在中心核苷酸侧翼。在一个实施方案中，靶特异性引物序列可以在中心核苷酸位置处或附近含有修饰的核碱基，并且在3'和/或5'末端含有修饰的核碱基。在一些实施方案中，正向或反向引物序列的长度可以是约15至约40个碱基的长度。在一些实施方案中，多重反应中使用的引物序列的tm可为约55℃至约72℃。在一些实施方案中，引物对被设计为扩增来自靶核酸分子或扩增子的序列，其长度为约100个碱基对至约500个碱基对。在一些实施方案中，扩增反应在单个反应阶段内并行进行(例如，在单个管内的相同扩增反应混合物内)。在一些情况下，扩增反应可以产生产物的混合物，包括预期的扩增子产物以及非预期的、不需要的非特异性扩增假象，例如引物-二聚体。扩增后，然后用任何合适的试剂处理反应，所述试剂将选择性地切割或以其他方式选择性破坏过量未掺入的引物和扩增假象内的修饰核苷酸的核苷酸键，而不切割或破坏规格扩增产物。例如，引物可包括含尿嘧啶的核碱基，其可使用ung/udg(任选地加热和/或碱)选择性裂解。在一些实施方案中，引物可包括含尿嘧啶的核苷酸，其可使用ung和fpg选择性裂解。在一些实施方案中，裂解处理包括暴露于氧化条件以选择性裂解二硫醇，用rnaseh处理以选择性裂解修饰的核苷酸，包括rna特异性部分(例如核糖等)等。该切割处理可以有效地将原始扩增引物和非特异性扩增产物分裂成小核酸片段，每个核酸片段包含相对较少的核苷酸。此类片段通常不能在升高的温度下促进进一步扩增。通过本领域已知的各种扩增后净化程序(例如，离心柱、naetoh沉淀等)，也可以相对容易地从反应池中除去这些片段。在一些实施方案中，任选地处理修饰核苷酸的核苷酸键的切割或其他选择性破坏后的扩增产物，以产生在5'末端具有磷酸的扩增产物。在一些实施方案中，磷酸化处理包括酶促操作以产生5'磷酸化的扩增产物。在一个实施方案中，酶如聚合酶可用于产生5'磷酸化的扩增产物。例如，t4聚合酶可用于制备5'磷酸化扩增子产物。klenow可以与一种或多种其他酶一起使用以产生具有5'磷酸的扩增产物。在一些实施方案中，本领域已知的其他酶可用于制备具有5'磷酸基团的扩增产物。例如，含有尿嘧啶核苷酸的扩增产物与酶udg、fpg和t4聚合酶的孵育可用于产生在5'末端具有磷酸的扩增产物。对于本领域技术人员显而易见的是，除了本文具体描述的那些之外的其他技术可用于产生磷酸化的扩增子。应当理解，应用于实践本文公开的方法、系统、试剂盒、组合物和装置而不诉诸过度实验的这些变化和修改被认为在本公开的范围内。在一些实施方案中，掺入预期的(特异性)扩增产物中的引物，这些引物被类似地切割或破坏，导致在特定扩增产物内形成“粘性末端”(例如，5'或3'突出端)。这种“粘性末端”可以用几种方式解决。例如，如果要克隆特异性扩增产物，可以设计突出区域以补充引入克隆载体中的突出端，从而使得实现比平端连接更快速和有效的粘性末端连接。或者，可能需要修复突出端(与几种新一代测序方法一样)。这种修复可以通过仅使用仅由天然碱基组成的正向和反向扩增引物(例如，对应于a和p1引物)的二次扩增反应来完成。以这种方式，随后的几轮扩增重建双链模板，在引物破坏之前具有原始链的完整序列的扩增子的新生拷贝。或者，可以使用某些形式的填充和连接处理去除粘性末端，其中正向和反向引物与模板退火。然后可以使用聚合酶来延伸引物，然后可以使用连接酶，任选的热稳定连接酶来连接所得的核酸链。这显然也可以通过各种其他反应途径实现，例如循环延伸-连接等。在一些实施方案中，连接步骤可以使用一种或多种dna连接酶进行。在一些实施方案中，提供了用于单管多重pcr的方法。在一些实施方案中，用于单管多重pcr的方法可包括靶特异性或外显子特异性引物。在一些实施方案中，外显子特异性或靶特异性引物可包括至少一个尿嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，单管多重pcr可包括使用靶特异性或外显子特异性尿嘧啶基引物选择性扩增至少10、50、100、150、200、250、300、350、398或更多个靶核酸分子。在一些实施方案中，提供了用于产生靶特异性或外显子特异性扩增子文库的方法。在一些实施方案中，使用靶特异性或外显子特异性引物产生的扩增子文库可与人癌症中的异常表达相关。在一些实施方案中，使用靶特异性或外显子特异性引物产生的扩增子文库可与人癌症的突变相关。在一些实施方案中，扩增子文库可以由表达的rna或cdna或福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)组织产生。在一些实施方案中，使用本文公开的方法制备的扩增子文库的扩增子长度可为约100至约300个碱基对、长度为约100至约250个碱基对、长度为约120至约220个碱基对或约135至约205个碱基对。在一些实施方案中，可以使用靶向癌症特异性突变的引物对来制备扩增子文库。在一些实施方案中，引物对可用于产生一旦通过任何测序平台测序的扩增子，包括半导体测序技术可用于检测遗传突变，例如倒位、缺失、点突变和拷贝数的变化。在一些实施方案中，用于产生扩增子文库的引物对可导致具有以下一种或多种指标的靶特异性核酸分子的扩增：如果归一化至100x平均覆盖深度，则在20x下大于97％的靶覆盖率；平均值大于0.2倍下，大于97％的碱基；大于90％的碱基，而没有链偏差；大于95％的所有靶上读数；平均值大于0.01倍下，大于99％的碱基；和每个碱基精度超过99.5％。在一些实施方案中，扩增子文库可用于检测和/或鉴定样品中的已知突变或从头突变。在一些实施方案中，使用靶特异性引物对制备的扩增子文库可用于下游富集应用，例如乳液pcr或桥式pcr。在一些实施方案中，扩增子文库可用于富集应用和测序应用。例如，可以使用任何合适的dna测序平台对扩增子文库进行测序。在一些实施方案中，可以使用iontorrentpgm测序仪(lifetechnologies)对扩增子文库进行测序。在一些实施方案中，pgm测序仪可以与服务器耦合，所述服务器应用参数或软件以确定扩增的靶核酸分子的序列。在一些实施方案中，可以在不到24小时内制备、富集和测序扩增子文库。在一些实施方案中，扩增子文库可在约9小时内制备、富集和测序。在一些实施方案中，扩增子文库可以是配对文库，即包含来自肿瘤样品的扩增子和来自未患病样品的扩增子的文库。每对可以比对，以检测和/或鉴定靶核酸分子中存在的突变。在一些实施方案中，用于产生扩增子文库的方法可包括：使用外显子特异性或靶特异性引物扩增rna表达或cdna靶以产生扩增子；从输入的rna或cdna和引物中纯化扩增子；磷酸化扩增子；将衔接子连接到磷酸化的扩增子上；纯化连接的扩增子；对扩增的扩增子进行切口平移；并纯化切口平移的扩增子以产生扩增子文库。在一些实施方案中，可以在扩增rna表达靶标以产生扩增子的步骤之后进行另外的扩增子文库操作。在一些实施方案中，可以以任何顺序进行另外的反应的任何组合，并且可以包括：纯化；磷酸化；连接衔接子；缺口平移；扩增和/或测序。在一些实施方案中，可以省略或可以重复这些反应中的任何一种。对于本领域技术人员来说显而易见的是，该方法可以重复或省略任何一个或多个上述步骤。对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以修改步骤的顺序和组合以产生所需的扩增子文库，因此不限于所提供的示例性方法。磷酸化的扩增子可以与衔接子连接以进行切口平移反应，随后的下游扩增(例如，模板制备)，或用于附着到颗粒(例如珠子)或两者。例如，与磷酸化扩增子连接的衔接子可以与附着于颗粒的寡核苷酸捕获引物退火，并且可以进行引物延伸反应以产生附着于颗粒或表面的扩增子的互补拷贝，从而将扩增子连接到表面或颗粒上。衔接子可具有一个或多个扩增引物杂交位点、测序引物杂交位点、条形码序列及其组合。在一些实施方案中，通过本文公开的方法制备的扩增子可以与一个或多个iontorrenttm相容的衔接子连接以构建扩增子文库。通过这些方法产生的扩增子可以连接到一个或多个衔接子用于文库构建，以与下一代测序平台兼容。例如，通过本公开内容的教导产生的扩增子可以连接到ionfragmentlibrarykit(lifetechnologies，目录号4466464)中提供的衔接子上。在一些实施方案中，表达的rna靶标或ffpe样品的扩增可以使用2xampliseqhifimastermix进行。在一些实施方案中，ampliseqhifi预混合物可包括甘油、dntp和dna聚合酶，例如taqdna聚合酶高保真度。在一些实施方案中，2xampliseqhifimastermix可进一步包括以下中的至少一种：防腐剂、硫酸镁、三硫酸盐和/或硫酸铵。在一些实施方案中，表达的rna靶标或ffpe样品的扩增可以使用5xionampliseqhifimastermix进行。在一些实施方案中，5xionampliseqhifimastermix可包括甘油、dntp和dna聚合酶，例如taqdna聚合酶保真度。在一些实施方案中，5xionampliseqhifimastermix可进一步包括以下中的至少一种：防腐剂、氯化镁、硫酸镁、三硫酸盐和/或硫酸铵。在一些实施方案中，扩增子的磷酸化可以使用fupa试剂进行。在一些实施方案中，fupa试剂可包括dna聚合酶、dna连接酶、至少一种尿嘧啶裂解或修饰酶，和/或储存缓冲液。在一些实施方案中，fup试剂可进一步包括以下中的至少一种：防腐剂和/或去污剂。在一些实施方案中，扩增子的磷酸化可以使用fupa试剂进行。在一些实施方案中，fupa试剂可包括dna聚合酶、至少一种尿嘧啶裂解或修饰酶、抗体和/或储存缓冲液。在一些实施方案中，fupa试剂可进一步包括以下中的至少一种：防腐剂和/或去污剂。在一些实施方案中，提供抗体以在环境温度下抑制dna聚合酶和3'-5'核酸外切酶活性。在一些实施方案中，通过本公开内容的教导产生的扩增子文库的产率足以用于多种下游应用，包括使用iontorrenttmpgm系统的ionxpresstm模板试剂盒(例如，pcr介导的添加核酸片段文库扩增到ionspheretm颗粒上(lifetechnologies，部件号4467389)。例如，可以在ionxpress模板试剂盒用户指南(thermofisherscientific)中找到从扩增子文库制备模板文库的说明。在离子测序用户指南(thermofisherscientific)中描述了将后续模板库加载到iontorrenttm芯片上用于核酸测序的说明。在一些实施方案中，通过本公开内容的教导产生的扩增子文库可以用于配对末端测序(例如，iontorrenttmpgm系统(thermofisherscientific)上的配对末端测序)。对于本领域普通技术人员显而易见的是，用于克隆扩增的许多其他技术、平台或方法，例如野火pcr和桥扩增，可以与本公开的扩增的靶序列结合使用。还设想本领域普通技术人员在进一步改进或优化本文提供的条件时可以直接进行核酸测序(例如使用iontorrentpgmtm或protontm测序仪，lifetechnologies)而不进行克隆扩增步骤。在一些实施方案中，待克隆扩增的至少一个扩增的靶序列可以连接到载体或颗粒上。载体可由任何合适的材料构成，并具有任何合适的形状，包括例如平面、球状或颗粒。在一些实施方案中，载体是如美国公开申请20100304982中所述的支架聚合物颗粒，将其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，通过本公开内容的教导产生的扩增的靶序列的核酸测序包括从头测序或靶向重测序。在一些实施方案中，核酸测序还包括将扩增的靶序列的核酸测序结果与参考核酸样品进行比较。在一些实施方案中，参考样品可以是正常组织或充分记录的肿瘤样品。在一些实施方案中，扩增的靶序列的核酸测序还包括确定核酸序列内是否存在突变。在一些实施方案中，该方法还包括将突变的存在与药物敏感性、治疗预后和/或器官排斥相关联。在一些实施方案中，核酸测序包括鉴定与癌症相关的遗传标记。在一些实施方案中，核酸测序包括鉴定研究中的样品中的拷贝数变异。在一些实施方案中，提供了试剂盒，用于在单一反应中扩增来自核酸分子群的多种免疫应答靶表达序列。在一些实施方案中，试剂盒包括含有一个或多个可切割基团的多个靶特异性引物对、一个或多个dna聚合酶、dntp的混合物和至少一种切割试剂。在一个实施方案中，可裂解基团可以是8-氧代-脱氧鸟苷、脱氧尿苷或溴脱氧尿苷。在一些实施方案中，至少一种裂解试剂包括rnaseh、尿嘧啶dna糖基化酶、fpg或碱。在一个实施方案中，切割试剂可以是尿嘧啶dna糖基化酶。在一些实施方案中，提供试剂盒以在单个反应室或容器中进行多重pcr。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一种dna聚合酶，其可以是热稳定dna聚合酶。在一些实施方案中，与单个pcr反应相比，一种或多种dna聚合酶的浓度以3倍过量存在。在一些实施方案中，每种靶特异性引物对的最终浓度以约25nm至约50nm存在。在一个实施方案中，每种靶特异性引物对的最终浓度可以以比常规单重pcr反应低50％的浓度存在。在一些实施方案中，所述试剂盒在单个反应室中提供来自核酸分子群的至少100、150、200、250、300、350、398或更多个靶免疫应答表达序列的扩增。在特定实施方案中，本发明提供的试剂盒是测试试剂盒。。在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或多种衔接子、条形码和/或抗体。rna表达分析研究中的一个共同关注点是确定不同样品之间基因表达如何变化。用于rna测序的当前方法通常需要扩增步骤，然后对选择的扩增产物(例如转录物)进行序列分析至固定数量的读数。特别地，利用本发明提供的方法，可以通过扩增代表转录物的扩增子(例如，扩增子穿过选定的外显子/外显子连接)来推断每个基因的表达。由于选择的扩增，在与特定基因转录物相关的读数数量与所有其他基因产生的读数数量之间存在依赖性。这种相互依赖性意味着可以通过两种不同的生物学过程诱导明显相同的倍数变化：特定基因表达比率的增加，或所测量的所有其他基因的表达比率的降低。为准确测量两种情况中的哪一种，在进行样品的交叉比较之前，应在每个样品中正确归一化读数。归一化已经进行了全转录组rna测序分析的研究。在这些研究中，logrpm(每百万读取计数)已被广泛接受以提供可解释的基因表达测量，其强有力地反映样品之间表达的差异。然而，该测量的准确性取决于所测量的大多数基因不是差异表达的基本假设。这种假设倾向于适用于转录组学研究，其中相同组织的超过20,000个基因通常被分析。然而，对于较小的基因组，对于包含极低表达基因的组，或对于关注相似生物过程的组，例如本文提供的方法和组合物，这种假设不太可能总是适用。作为一个简单的例子，考虑一个由2个功能类别组成的20个基因的目标小组，一个有16个，另一个有4个基因，其中一个功能的每个基因与其他基因完全相关。在该实例中，样品1和样品2中的rna分子的实际数量是已知的，并且可以精确比例读取序列。当应用标准rpm计算来测量每个基因的表达并使用我们的估计表达式计算倍数变化时，较小类别增加2倍，倍数变化估计保持对真实倍数变化的相当准确的估计(图8，左图)。然而，如果更大类别的16个基因中的分子数量增加2倍，基于rpm的估计倍数变化表明，我们减少了4个基因，而不是增加了16个基因(图8，中图)。因此，在具有少量总基因和大多数基因的强相关结构的靶向组中，标准rpm归一化提供了不准确的倍数变化估计。然而，如果我们假设一个较小的类别是一组标准的内源性对照，例如管家(hk)基因，并且在样品间具有可比性，那么这组基因作为参考点准确测量16个基因的目标功能集的表达。使用后一种策略可以提供准确的倍数变化结果(图8，右图)。了解基因之间的相互关系，为标准表达测量是否会偏向于小型靶向rna-seq组提供了一些指导。因此，结合本发明的组合物和方法，提供的组合物包括用于测定一组持家基因表达的引物对和方法，用于一种或多种作为内源对照，以及用于表达水平归一化和确定样品上的表达变化的有效手段。各种示例性实施方案的以下描述仅是示例性和说明性的，不应以任何方式解释为限制或限制性的。根据说明书和附图以及权利要求，本教导的其他实施方案、特征、目的和优点将显而易见。尽管本说明书详细描述了某些示例性实施方案，但是其他实施方案也是可能的并且在本发明的范围内。考虑到说明书和附图以及权利要求书、说明书和附图中描述的教导的实践，变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。例证说明材料和方法提供的免疫应答测定组合物包括针对395个免疫应答标记物的试剂，所述免疫应答标记物设计用于表达的靶序列的文库制备技术。通常，从样品中提取的rna(例如各种类型肿瘤样品，例如新鲜、冷冻、ffpe，例如肺肿瘤、nsclc)被逆转录；产生文库，制备模板，例如使用ioncheftm或iononetouchtm2系统，然后使用下一代测序技术例如ions5tm、ionpgmtm系统对制备的样品进行测序。从样品中提取总rna，首先将10ng总rna逆转录并用作模板以扩增靶(例如，表1中的靶表达序列)，其中免疫应答测定包含表2中的引物对。使用ionampliseqtmlibrarykit2.0进行手动文库制备，然后使用iononetouchtm2系统或ioncheftm仪器进行模板化。使用适用于chefdl8和ioncheftm仪器的ionampliseqtm试剂盒进行自动化文库制备和模板化。测序在ions5tm系统或ionpgmtm系统上进行。使用iontorrentsuitetm软件量化基因表达。hl-60和人正常肺(am7968)分别购自atcc和ambion。去识别的黑素瘤和nsclcffpe样品分别从asterand和researchdx获得。表1：免疫应答测定的基因和扩增子插入序列表2：免疫应答测定的引物对序列rna和cdna制备根据制造商的说明，使用recoveralltm总核酸分离试剂盒(ambion,inc.)从样品提取总rna，并且例如使用qubittmrnahs测定试剂盒(thermofisher)qubittmrnahs测定试剂盒(thermofisher)进行量化，以量化rna。根据制造商的说明，使用vilotmcdna合成试剂盒(thermofisher,目录号11754050)，将总计10ng的总rna逆转录至cdna。使用包含表2中的引物对的免疫应答测定法将制备的模板用于扩增靶标。pcr扩增rna靶标进行多重聚合酶链式反应以在rna表达样品上扩增398个单独的扩增子。表1中提供了基因列表和产生的扩增子序列。引物对列于表2中。向96孔pcr板的单个孔中加入4微升免疫应答引物库，其含有398个引物对，浓度为te中15μm，10微升制备的cdna和4微升的扩增反应混合物(5xampliseqhifimastermix)，其可以包括甘油、dntp和taq高保真dna聚合酶(invitrogen，目录号11304)，用dnase/rnase游离水(lifetechnologies，ca，部件号600004)达到最终体积为20微升。将pcr板密封并装入热循环仪(pcr系统9700双96-孔热循环仪(lifetechnologies，ca，部件号n8050200和4314445))并在以下温度曲线下运行以产生预扩增的扩增子文库。初始保持阶段在99℃下进行2分钟，然后进行19个循环，在99℃下变性15秒，并在60℃下退火和延伸阶段4分钟。循环后，将预扩增的扩增子文库保持在10℃直至进行。部分消化扩增子在进行之前，将样品短暂离心以收集内容物。向预扩增的扩增子文库(～20微升)中加入2微升fupa试剂。将反应混合物密封，充分混合以确保均匀性和在50℃温育10分钟，55℃下10分钟，60℃下20分钟，然后在10℃保持达1小时。在进行之前，将样品短暂离心以收集内容物。连接衔接子至扩增子并且纯化温育后，反应混合物直接进行连接步骤。这里，将现在含有磷酸化扩增子文库的反应混合物与2微升a/p1衔接子(作为ionfragmentlibrarykit的组分出售，thermofisher)、4微升switch溶液(作为fragmentlibrarykit的组分出售，thermofisher)和2微升的最后加入的dna连接酶(作为ionfragmentlibrarykit的组分出售，thermofisher)组合，然后按下面温育：22℃下30分钟，72℃下10分钟，然后在10℃保持达1小时。在进行之前，将样品短暂离心以收集内容物。在温育步骤后，将45微升(1.5x样品体积)的室温试剂(beckmancoulter，ca)加入到连接的dna中。彻底吸移混合物以使珠悬浮液与连接的dna混合。将混合物脉冲旋转并在室温下温育5分钟。样品经历另一次脉冲旋转并放置在磁架例如dynamagtm-2旋转磁体(lifetechnologies，ca，部件号123-21d)上两分钟。溶液澄清后，弃去上清液。在不从磁架移除管的情况下，将150微升新鲜制备的70％乙醇引入样品中，并在轻轻旋转磁架上的管的同时孵育。溶液澄清后，弃去上清液而不干扰沉淀。进行第二次乙醇洗涤，弃去上清液。通过脉冲旋转管除去任何剩余的乙醇并小心地除去残留的乙醇，同时不干扰沉淀。将沉淀在室温下风干约5分钟。将沉淀重悬于20微升dnase/rnase游离水(lifetechnologies，ca，部件号600004)中并涡旋以确保样品充分混合。将样品脉冲旋转并置于磁架上两分钟。在溶液澄清后，将含有连接的dna的上清液转移到新的eppendorflobindtm管中以进行长期储存。定量后，确定导致浓度为～100pm的稀释因子，这适用于使用ion模板试剂盒制备模板。量化文库根据制造商的说明，使用qubittm2.0或3.0荧光计和/或通过使用ionlibrary定量试剂盒(目录号4468802)的qpcr，量化连接的文库。扩增和纯化文库将连接的预扩增文库(～20微升)与50微升pcrsupermixhighfidelity(thermofisher，以ionfragmentlibrarykit的组分出售)和2微升libraryamplificationprimermix(以ionfragmentlibrarykit的组分出售)组合。将溶液应用于96孔pcr板的单个孔中并密封。将板加载到热循环仪(pcr系统9700双96-孔热循环仪(lifetechnologies，ca，部件号n8050200和4314445))中，并在以下温度曲线上运行以产生最终的扩增子文库：保持在在98℃下2分钟，然后进行5个循环，在98℃下变性15秒，并在64℃下退火和延伸阶段1分钟。循环后，将最终的扩增子文库保持在4℃直至进行下面概述的最终纯化步骤。进行最终文库的两轮纯化。将25μl(0.5x样品体积)的agencourttmampuretmxp试剂加入到含有～50μl样品的每个板孔中。上下吸移珠子悬浮液以使珠子悬浮液与最终扩增子文库彻底混合。然后将样品脉冲旋转并在室温下温育5分钟。将含有最终扩增子文库的平板置于磁架例如dynamagtm-侧磁体(thermofisher)上5分钟以捕获珠子。一旦溶液澄清，小心转移上清液而不干扰珠粒。进行第二轮纯化，向每个含有样品的板孔中加入60微升(1.2x样品体积)的agencourttmampuretmxp试剂。将珠子悬浮液上下吸移以彻底混合珠子悬浮液并在室温下温育5分钟。将含有最终扩增子文库的平板置于磁架上3分钟以捕获珠子。在不从磁架上取下板的情况下，将150微升新制备的70％乙醇引入含有珠子的样品中。将样品温育30秒，同时在磁架上轻轻旋转管。溶液澄清后，弃去上清液而不干扰沉淀。进行第二次乙醇洗涤，弃去上清液。通过脉冲旋转管除去任何剩余的乙醇并小心地除去残留的乙醇，同时不干扰沉淀。将沉淀在室温下风干约5分钟。一旦管干燥，将管从磁架上取下并加入50微升lowte(thermofisher)，移液并涡旋以确保样品充分混合。将样品脉冲旋转并置于磁架上两分钟。在溶液澄清后，使用qubittm荧光计和qubittmdsdnahs测定试剂盒根据制造商的说明分析含有最终扩增子文库的上清液，以定量文库并计算模板制备和测序的稀释因子。将文库稀释至约50pm用于模板制备或储存在1.5-mleppendorflobindtm管中用于长期储存。模板制备和测序根据制造商的说明，使用iononetouchtm2系统或ioncheftm仪器将等分试样的最终文库用于模板制备。测序在ions5tm系统或ionpgmtm系统上进行。根据制造商的说明，使用iontorrentsuitetm软件对基因表达进行定量，根据制造商的说明进行分析和测序。自动化过程或者，可以使用如上所述制备的cdna，与用于chefdl8的ionampliseqtm试剂盒和ioncheftm仪器一起进行自动化文库制备和模板化，这根据制造商说明并在ionchefsystem上的ionampliseq文库制备(thermofisherscientific出版号man0013432)中进行描述，在此引入作为参考。多文库制备对多个文库进行排序时，将为每个文库连接不同的条形码。来自相同样品的dna和rna文库也需要不同的条形码。ioncode衔接子以适当的浓度提供，并在单个孔中包含正向和反向衔接子。对于选择的每个条形码，制备一个ionp1衔接子和ionxpress条形码x(thermofisher)的混合物，每个衔接子的最终稀释度为1：4。在上述连接反应中，将2ul的条形码接头混合物替换为ionampliseq衔接子；并根据需要扩大规模。通过在模板制备之前组合相同体积的每个文库，可以在单个芯片上对多个条形码文库进行测序。制造商建议最多8个库用于以下芯片：ion318芯片v2(最多4个)、ion520芯片(最多4个)、ion530芯片(最多8个)。通过将所有单个文库稀释至50pm浓度来制备组合文库；将10ul的每个文库组合在单个管中(优选eppendorflobind管)。合并最后文库后，通过上下吸移5次彻底混合，然后短暂离心以收集在管底部。根据需要进行模板化和测序。数据分析使用torrentsuitetmrna插件进行基因表达水平定量，该插件从序列读数数据产生基因转录物定量。该插件利用靶区域.bed文件和相关的参考库.fasta文件，并可选地接受secont.bed文件，该文件指定允许样品聚类的靶基因子集。得出的报告包括基因表达计数(给定靶序列的比对读数)、数据分析总结和qc图。可以使用affymetrix转录组分析控制台(tac)3.1软件(thermofisherscientific)确定归一化的基因水平计数数据。从torrentsuitetm插件生成的chp文件可以直接与transcriptome分析控制台(用于差异基因表达分析的tac3软件)一起使用。转录组分析控制台(tac)软件免费提供，http：//www.affymetrix.com/。表达的归一化为了观察所选靶标免疫应答基因之间的表达谱如何在大量样品中变化，在18个癌症研究中我们从icgc数据库[zhang等，2011]中下载并处理了超过9,600个患者样品。为了确保高质量的rna谱，我们排除了所有样品，其文库大小小于2000万个读数，映射到转录组，最终得到9,148个完整的转录组数据集。对于该研究，我们使用每个基因的log2cpm全转录组(ft)表达作为‘真实’表达值和映射到基因的读数总数作为群组中每个样品的‘真实’归一化常数。结果从例如nsclcffpe样品的样品中提取的总rna被逆转录。在ioncheftm或iononetouchtm2系统上生成文库，并在ions5tm或ionpgmtm系统上测序。由于输入要求低至10ng总rna，我们能够测量稳健表达，包括来自样品的低表达转录物(例如，ifn、il2、il21、il10、il23)，例如nsclcffpe样品、crc样品。结果显示灵敏度高、特异性强、动态范围宽、重复性好。技术重复是高度可重复的(参见图1)，在各种样品类型中是一致的(参见图4)，并且测定结果是高度特异性的，当用gdna和水对照样品平行测试时具有可忽略的背景。确定测定的动态范围，例如，分别测量hl-60和人肺总rna的表达谱，并以4种不同的比例混合以评估动态范围(参见图2)。将纯样品和混合样品之间的倍数变化相关联，并比较纯样品和混合样品之间倍数变化相关性的等级顺序。从纯样品计算预期的倍数变化，并且通过将线拟合至混合样品得到观察到的倍数变化(参见表3)。在自动和手动工作流程中进行的重复实验中证实了能够可靠地检测到该组的低表达标志物，即使对于非常低表达的基因(例如，il2、il21、il2b、il13、il23a、il10)和更高表达白细胞介素(例如，il1a、il12a、il15、il6、il7、il2rb)，也证明了一致的结果。数据未显示。来自所提供的免疫应答测定的测序数据也显示出与使用定量实时pcr评估的平行样品的结果高度一致(参见图3)。使用参考rna检查超过50个基因的结果的更大的一致性研究产生了类似的一致性。数据未显示。表3.对2倍和4倍差异表达的敏感性和特异性分析报告文件包括，例如，样品摘要报告(列出每个样品的表、总读数、对齐读数、对齐百分比)；绝对读数计数数据(每个样品的基因的绝对读数)，rpm数据(通过每个样品的总读数计数归一化)，平均持家标度log2rpm数据(对于每个样品)，通过rpm归一化的chp文件，通过平均持家基因归一化的chp文件，以及基因组dna和水样的表达数据。参见图5和图6。分析输出产生的数据证明基因的分布，显示具有相似和差异读数的基因的频率。参见图5a。曲线绘制在相同的轴刻度上；并使用默认的r‘密度'函数将计数数据拟合到高斯核。持家基因在样品中的表达证明了与样品类型无关的相似表达水平。参见图5b。r值的热图相关性比较log2rpm读取对相关样品，证明了样品中整个表达测定的相关性。样品读数显示样品的每个靶标的相关性。参见图5c和图6(上图显示回归线的pearson相关r值；对角线图显示每个样品的单个log(rpm+1)值的频率密度图；下图显示对个整个图的每个条形码对作图的log2rpm+1值，其中报告了重叠的线性最小二乘回归线和线斜率)。通过读数计数测量的表达水平也可以描绘为热图，描绘了条形码上表示的最大变化，如通过具有至少一个具有至少100rpm读数的样品的基因的归一化读数计数的系数变化所测量的。对于该图，如果样品总共少于105个读数，则将其消除。图7显示了在整个组中显示高和低表达基因的示例性热图分析。因此，我们验证了在细胞系滴定实验的混合浓度下我们的测定中的倍数变化的线性和无偏估计。图2.通过实现技术重复的高相关性(r>.99)，以及即使在低输入量(10ngrna)下的稳健表达估计，我们的测定为癌症免疫疗法中的生物标志物研究提供了有价值的解决方案。使用内源性对照准确估计倍数变化。当大多数基因在样品之间不变化时，倍数变化估计具有可忽略的误差。当大多数基因发生变化时，倍数变化估计非常不准确。参看图8。因此，当使用内源性对照时，我们准确地测量倍数变化。对癌症类型的9148个样品的基因表达进行计算机分析评估。见表4。应用标准cpm归一化来测量每个基因的表达并计算所得的倍数变化。完整的转录组分析提供了对表达的真实估计，可能是因为在总数上，预计仅有少数20,000+基因差异表达。我们评估了完整的转录组表达数据以及免疫应答测定表达数据。虽然免疫应答测定子类别中基因的相对数量不同，但在整个测定中没有一个类别使用大多数基因，并且多个基因类别必须改变以支配测定基因的比例。尽管免疫应答测定不如完整转录组那么大，但是不相关基因类别的相对多样性需要样品之间的差异表达以偏向表达估计。因此，在不相关基因类别在样品之间差异表达的情况下，持家基因归一化提供了有效估计靶向表达倍数变化估计的有效优化方法。首先要了解如何仅测定来自共同功能的基因可以影响表达的估计，进行了仅包含与白细胞迁移类别(itgal、itgam、itgb7、sell、vcam1)相关的5个基因的测定。仅测定那些基因不能提供准确的表达估计。通过2个白细胞抑制和19个tcr共表达基因(ccr7、cd247、cd3d、cd3e、cd3g、cd6、cd8a、cd8b、crtam、gpr18、grap2、ikzf3、il2rb、il7r、itk、lamp3、lck、ptprcap、tigit)扩展测定不会增加相关性。然而，从无关的肿瘤标志物类别(akt1、brca1、brca2、cdkn2a、efna4、egfr、egr3、irs1、krt5、krt7、mapk1、mmp2、mmp9、myc、notch3、pgf、ptgs2、ptk7、rb1、rps6、snai1、snai2、tcf7、tp63、trim29、twist1、zeb1)或11个管家(hk)基因(abcf1、g6pd、gusb、hmbs、lmna、lrp1、polr2a、sdha、tbp、tfrc、tubb)测定27个基因改善了与真实的表达值的关系。参见图9a。hk基因彼此不相关，然而，与肿瘤标志物(彼此也不相关)不同，hk基因提供低方差并且能够以高精度测量。例如，当我们比较各种指标的性能和稳健性以获得准确的倍数变化估计时，我们发现持家基因的几何平均值提供了比标准cpm计算(有或没有持家基因)更准确的倍数变化估计。参见图9b。单独的持家基因可以仅在小组测定中校正表达估计。使用不相关的基因类别也具有与归一化相似的效果。此外，使用仅hk基因之和的倒数作为归一化因子提供了比使用小组中所有基因的总和更强的相关性。表4：跨癌症类型的样品分布研究id癌症类型样品量blca-us膀胱尿路上皮癌318brca-us乳腺癌1195cesc-us宫颈鳞状细胞癌264coad-us结肠癌516hnsc-us头颈部鳞状细胞癌524kirc-us肾脏肾透明细胞癌598kirp-us肾脏肾乳头状细胞癌254lihc-us肝脏肝细胞癌345luad-us肺腺癌543lusc-us肺鳞癌473ov-us卵巢浆液性囊腺癌530paad-us胰腺癌145prad-us前列腺肿瘤870read-us直肠腺癌163skcm-us皮肤皮肤黑色素瘤868stad-us胃腺癌900thca-us头颈部甲状腺癌566ucec-us子宫内膜癌541因此，我们还发现使用内源对照(持家基因)的归一化为具有高度相关基因的小组测定提供了准确的倍数变化估计。不相关的基因类别可以与持家基因在归一化方面具有相同的效果，然而，不相关的基因类别在样品之间差异表达的紧密情况将在不使用持家基因时偏向表达估计。本文提供的持家基因归一化方法可以改善与表达测定的真实值的相关性。特别地，持家基因归一化可以改善所提供的免疫应答测定的亚组中的表达评估，并且可以与本文提供的相对大的免疫应答测定结合使用。从先前的分析，清楚的是使用持家基因结合本发明的组合物和方法进行归一化对于准确估计倍数变化表达是必需的。同样清楚的是，仅使用持家基因来计算归一化常数是估计基因表达以进行准确倍数变化估计的优选方式。使用持家基因计算归一化常数的一个重要因素是确定哪个基因计数的度量提供最准确的倍数变化估计。因此，我们在18项癌症研究中比较了6个指标；对于每项研究，我们计算并确定与以下指标的相关性：持家计数的总和的log10(类似于rpm归一化)，持家计数的几何平均值的log10，持家计数的log10的中位数，持家计数的log10的第75分位数，以及修正的平均值(hk计数的log10的15％和25％)。有趣的是，持家计数的总和不提供最佳相关值，而是几何平均值提供最高的平均相关性和r平方大于0.5的癌症数量(数据未显示)。在更强大的措施中，15％的修正均值提供了最高的平均r平方。为了进一步估计哪个度量标准最稳健，我们通过将每个样品的随机持家基因设置为0读数来模拟每个样品的随机持家基因的丢失。然后，我们重现相同的分析，以使用丢失样品比较各种指标。有趣的是，即使在丢失样品中，几何平均值仍然提供与完整转录组归一化常数的最高相关性，而15％修正平均值也显示出高性能(数据未显示)。这表明几何平均值是一个最佳度量，因为它与真正的归一化常数值高度相关，并且对丢失具有鲁棒性。另外，我们对各种感兴趣的癌症类型之间的归一化常数、相关性和丢失相关性进行了分析，并且甚至在各种样品类型中确认了本组合物和在感兴趣的群体中一致地进行的方法中提供的持家基因组。持家基因(hk)常数：让x是对免疫应答测定每一个基因的计数的矢量，让hkgenes是一组持家基因；添加假计数1到矢量x的每个条目，创建新的矢量y。查找持家基因的计数的几何平均值，计算为10^平均值(log10(y_hkgenes))，其中y_hkgenes是y矢量的子集以仅包括与持家基因相关的计数。这种几何平均值将被标注为hknorm。将每个y条目乘以(10^6hknorm)的每个条目，创建新的矢量z。最后在z取各条目的的log2值并添加，创建最终持家基因归一化表达估计。一旦建立，通过采用我们的11个持家基因的几何平均值并使用所提供的免疫应答测定的398个基因将我们的归一化策略与标准rna-seqrpm测量值进行比较来计算hknorm常数。由于该测定由相对大量平均彼此不相关的基因组成，因此可以提出有效的论据，即持家基因对于测定是不必要的并且不提供额外的信息。为了解决这个问题，我们比较了hknorm常数与标准rpm常数和当从测定中移除持家基因时的rpm常数。我们首先评估了这些归一化策略与所有样品中的完整转录组常数的比较，其中我们发现去除持家基因导致rpm常数与标准rpm计算相关性降低，但是，即使是标准rpm计算与hknorm相比，表现逊色。(数据未显示)。然后，我们检查了哪种归一化策略对于我们评估的每项癌症研究都是最佳的，并且发现除了lihc-us之外，hknorm在所有研究中都大大优于rpm策略，其中没有归一化策略特别好并且所有策略产生相同的结果。当在本发明的免疫应答测定中观察跨靶基因的每种策略的性能时，我们看到hknorm如所预期的那样优于所有基因中的rpm策略。有趣的是，方差较小的基因与ft值的相关性小于方差较大的基因。参见图9b。此外，具有低表达的基因和具有高平均表达的基因也具有比接近平均表达值的平均值的那些更小的相关值(数据未显示)。参考文献schalperka等人，objectivemeasurementandclinicalsignificanceoftilsinnon-smallcelllungcancer.jnatlcancerinst.2015feb3；107(3)。padmanees等人，immunecheckpointtargetingincancertherapy:towardcombinationstrategieswithcurativepotential.cell2015april161(2):205-214。lovem,huberw,anderss.moderatedestimationoffoldchangeanddispersionforrna-seqdatawithdeseq2.genomebiology,2014。lawc,cheny,shiw,smythg.voom:precisionweightsunlocklinearmodelanalysistoolsforrna-seqreadcounts.genomebiology,2014。hansenk,irizarryr.removingtechnicalvariabilityinrna-seqdatausingconditionalquantilenormalization.biostatistics,2011。rissod,schwartzk,sherlockg和dudoits.gc-contentnormalizationforrna-seqdata.bmcbioinformatics,2011。zhang,j.,baran,j.,cros,a.,guberman,j.m.,haider,s.,hsu,j.kasprzyk,a.(2011).internationalcancergenomeconsortiumdataportal—aone-stopshopforcancergenomicsdata.database:thejournalofbiologicaldatabasesandcuration,2011。序列表<110>生命技术公司<120>用于评估免疫应答的组合物和方法<130>lt01193pct<140>一起提交pct/us<141>2017-09-22<150>us临时申请62/398,756<151>2016-09-23<150>us临时申请62/419,091<151>2016-11-08<160>1194<170>patentinversion3.5<210>1<211>108<212>dna<213>合成序列<400>1cccgactcctgctgcattaatgttactgtgggctgtgggattaatttcaacgagaaggcg60atccataaggagggctgtgtggagaagattgggggctggctgaggaaa108<210>2<211>108<212>dna<213>合成序列<400>2gttcctgtcctgtgtgctgtaatgaatgtggtcttcatcaccattttaatcatagctctc60attgccttatcagtgggccaatacaattgtccaggccaatacacattc108<210>3<211>102<212>dna<213>合成序列<400>3taagaaaatcatcgaaaagatgctgaacagtgacaaatccaactgaccagaagggaggag60gaagctcactggtggctgttcctgaaggaggccctgccctta102<210>4<211>104<212>dna<213>合成序列<400>4cggcatctctgtgcttctcagaaatccagcctgcttcagcttcaaaacacagatgaactg60gattttatgagctccagtcaacaattttactggattggactctc104<210>5<211>108<212>dna<213>合成序列<400>5ctccagaagattttgtgattcaggcaaaggctgactgttacttcaccaacgggacagaaa60aggtgcagtttgtggtcagattcatctttaacttggaggagtatgtac108<210>6<211>99<212>dna<213>合成序列<400>6ggtgactcacagccggcacagccatgaactacccgctaacgctggaaatggacctcgaga60acctggaggacctgttctgggaactggacagattggaca99<210>7<211>108<212>dna<213>合成序列<400>7caaaggaggcgaggttct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