本发明涉及从大量复杂样品中回收活微生物(微生物细胞)的方法。具体而言，样品可以是临床样品或可以包括临床样品，尤其是血液，例如血培养瓶中的血样。本发明基于以下令人惊讶的发现：添加某些缓冲溶液，特别是包含蛋白酶的简单缓冲溶液，增强了复杂样品的过滤性。这允许从复杂样品中快速有效地回收活微生物细胞，用于随后的鉴定和生化测试。
背景技术：
：微生物感染代表了一类主要的人类和动物疾病，其具有重要的临床和经济意义。虽然各种种类和类型的抗微生物剂可用于治疗和/或预防微生物感染，但抗微生物抗性在现代医学中是一个巨大且日益严重的问题。在过去的20年中，各种微生物病原体的抗微生物抗性菌株的数量已经增加，并且微生物继续对越来越多的抗微生物类、特别是抗生素类产生抗性。随着抗性机制向更多生物传播，预计未来几年公众健康影响和与抗微生物抗性相关的成本将迅速增加。因此，在治疗微生物感染的背景下，可能需要并且确实重要的是获得关于感染微生物的性质及其抗微生物敏感性概况的信息，以便确保有效治疗并且还减少不必要的或无效的抗生素使用，从而有助于控制抗生素或更普遍的抗微生物抗性的传播。在严重或危及生命的感染的情况下尤其如此，其中快速有效的治疗是至关重要的。脓毒症是由严重感染引起的潜在致命的全身炎症，是美国最昂贵的病症和医院费用的驱动因素，占全国医院总费用的5％。如果治疗不当，严重脓毒症每小时死亡率增加7％，抗微生物抗性脓毒症导致菌株的流行率上升，使得预测脓毒症的正确治疗越来越困难。目前用于诊断引起败血症的微生物的金标准是基于表型和生物化学鉴定技术，其需要分离和培养感染微生物的纯培养物。可能需要数天才能进行微生物鉴定(id)和抗生素敏感性(ast)测试以鉴定感染并确定抗微生物抗性微生物的易感性特征。目前的临床实践需要在怀疑脓毒症的1小时内根据临床症状用广谱抗生素治疗。在6-8小时内需要第二剂，并且每6至8小时继续该给药，直至确定微生物并建立其抗生素敏感性(id/ast)。由于脓毒症的致死病症，如果患者经历临床反应直到确定微生物感染的性质并建立抗微生物敏感性，则医生不愿意改变最初来自广谱抗生素的治疗。这又导致广谱抗生素的不必要的高使用，进而促进微生物之间抗微生物抗性的增加。常规测试方法利用浊度测量或盘扩散来评估抗微生物剂对微生物生长的影响，以及传统的生物化学和微生物学技术以鉴定微生物。由于需要延长培养时间以允许微生物生长，这些技术可能需要数天才能鉴定和表征临床样品中的微生物。近年来已经开发了各种不同的技术来减少样品采集和诊断之间的时间。快速微生物鉴定的方法描述于us2010/0124763中，其中富集微生物培养物并通过光谱法鉴定微生物。已经开发出使用流式细胞仪的快速药敏测试技术(broeren等2013clinmicrobiolinfect19,286-291)和自动显微镜(price等2014jmm.9850-59)用于在确定易感性之前减少孵育所需的时间。由acceleratediagnostics开发的系统使用表面上单个细胞或集落生长的成像来监测在ast测试中在抗生素存在下的微生物生长(参见例如wo2014/040088、us2014/0278136和us8,460,887)。微生物dna的定量pcr也已用作微生物生长的量度以确定抗微生物敏感性，如us5,789,173中所述。还开发了组合的微生物鉴定和敏感性测试方法。us2005/0095665中描述了一种系统，其中选择的生长培养基和生色和荧光底物的组与自动微量滴定孔形式的微生物生长的浊度测量结合使用以鉴定微生物并确定抗微生物敏感性。还开发了自动显微镜方法(metzger等2014diagnosticmicrobiologyandinfectiousdisease79160-165)。bdphoenixtm系统还允许快速同时鉴定和表征微生物，并利用各种生色和荧光底物来鉴定样品中的微生物并监测微生物生长以确定样品中微生物的抗微生物敏感性。由于这些和其他进步，近年来从患者样品获得诊断所需的时间急剧下降。然而，尽管如此，还需要有助于进一步减少样品采集和诊断之间的时间的方法，以进一步改善患者的预后。微生物细胞可以以低至1cfu/ml的浓度存在于临床样品中，因此临床样品通常在测试之前培养一段时间，以获得足够量的微生物细胞用于测试发生。如上所讨论的，这可能导致诊断延迟。这个问题可以通过从培养物中回收微生物细胞来解决，所述培养物已经培养了一段时间(并且因此含有比培养更长时间的微生物细胞更少的微生物细胞)，或者实际上通过直接从临床样品中回收微生物细胞而没有事先培养步骤，从而有效地增加样品中存在的微生物细胞的有效浓度。然而，这确实意味着(为了获得足够数量的用于测试的微生物细胞)微生物细胞需要从更大量的样品中回收，例如，从几毫升样品中，并且在复杂样品的情况下，这会在微生物细胞的回收中、特别是在需要通过在自动化系统中是有利的过滤回收的情况下产生问题。临床样品或临床样品培养物中的微生物可以通过各种方式富集，从而绕过长期培养的需要。通过选择性裂解非微生物细胞例如来自测试中的受试者(从其中获得临床样品)的细胞，能够从临床样品中富集微生物细胞，然后通常通过过滤或离心从样品中回收微生物细胞。利用包含一系列裂解剂的裂解缓冲液从临床样品或临床样品培养物中富集微生物细胞的方法，所述裂解剂包括皂苷(us8481265)、非离子去污剂(ep2510123)、离子去污剂(ep2718713)、胆碱(us8603769)和离液剂(us2012/0231446)是本领域已知的，例如依赖于低渗裂解细胞例如血细胞的方法。利用苛刻碱性条件的其他方法也是本领域已知的(banada等2012.plosone7,e31126)，但是这些方法不能回收活的微生物细胞；已知微生物细胞的裂解发生在较高的ph值(例如ph11及以上)。与此相反，本发明提供了通过过滤从复杂样品(例如临床样品)中回收活微生物细胞的方法，其中不使用含有去污剂、离液剂和/或胆碱的裂解缓冲液或者在某些实施方案中的任何其他裂解剂。实际上，已经令人惊讶地发现，不需要样品中存在的非微生物细胞的完全或全部选择性裂解。尽管选择性非微生物细胞裂解可以在增加的ph下发生(例如在ph9.5或更高)，并且这包括在本发明的范围内，但已经令人惊讶地发现这不是本发明方法所必须的。换句话说，已经发现，即使在没有完全选择性裂解(或显著裂解)样品中存在的非微生物细胞的情况下，也可以令人惊讶地在不使过滤器堵塞的情况下过滤大量复杂样品以回收微生物。技术实现要素：本发明基于以下令人惊讶的发现：用含有蛋白酶但不含洗涤剂或离液剂的缓冲溶液处理临床样品足以增加可过滤的临床样品的体积(即，在整个体积的样品通过之前没有过滤器堵塞)，从而改善其中存在的微生物细胞的回收。特别地，本发明的方法基于以下发现：在某些ph范围内和在蛋白酶存在下，能够显著增加过滤性(即样品可被过滤的程度)而不显著损害样品中的微生物细胞活力。换句话说，本发明的方法允许每单位面积的过滤器过滤更大量的样品，从而增加能够过滤的临床样品的体积，以及能够从临床样品中回收的活微生物细胞的数量。因此，可以根据该方法进一步培养从临床样品中回收的微生物细胞和/或进行抗微生物敏感性测试。尽管在临床样品，特别是临床样品培养物中首次观察到这种令人惊讶的效果，但是显然增加样品的过滤性的方法可以更普遍地应用于任何复杂样品，特别是难以过滤和/或含有非微生物细胞的任何复杂的样品。因此，在第一方面，本发明提供从复杂样品中回收活微生物细胞的方法，所述方法包括：a)提供体积至少为1ml的复杂样品；b)使所述样品与缓冲溶液和一种或多种蛋白酶接触，其中所述缓冲溶液具有至少ph6且小于ph11的ph，其中所述缓冲溶液和所述一种或多种蛋白酶不包含洗涤剂或离液剂，并且其中缓冲溶液/蛋白酶/样品混合物是非低渗的；c)通过适于保留微生物细胞的过滤器过滤步骤(b)中获得的混合物；和d)回收步骤(c)中由过滤器保留的微生物细胞，其中回收的微生物细胞是活的。因此，本发明的方法提供从大量复杂样品中回收活微生物细胞的方法。“大量”在本文中定义为指至少1ml。更特别地，样品的体积可以大于1ml或等于(≥)2ml，或大于2、3、4、5、6、8或9ml。以另一种方式表示，样品体积可以为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10ml。样品体积也可以为至少15ml、20ml、30ml、40ml或50ml或更多。例如，样品体积可以为至少2ml、至少5ml或至少10ml。应当理解，步骤(b)可以包括将缓冲溶液和蛋白酶添加到样品中(例如添加到含有样品的器皿(vessel)或容器(container)中)，或者将样品添加到缓冲溶液和/或蛋白酶中(例如添加到含有缓冲溶液和/或蛋白酶的器皿或容器中)。可以将缓冲溶液和一种或多种蛋白酶预混合并添加到样品中(或者反之亦然)。这可以包括缓冲溶液和蛋白酶作为混合物提供(例如制备和储存)，或者缓冲溶液和蛋白酶分开提供(例如制备和储存)并在使用中例如在与样品接触之前预混合。或者，可以以任何顺序同一时间(同时)或顺序地将缓冲溶液和一种或多种蛋白酶分开加入样品中。因此，在一个实施方案中，缓冲溶液和蛋白酶可在使用期间混合。或者，缓冲溶液、样品和蛋白酶可在使用期间混合。可以以不同的形式提供(例如储存)缓冲溶液和蛋白酶(一种或多种)。例如，蛋白酶可以固体或粉末形式提供(例如冻干或冷冻干燥)。如下面更详细描述的，这种粉末蛋白酶制剂可以在使用前或使用过程中重构，例如，使用缓冲溶液，或使用样品，或两者兼而有之。或者，蛋白酶制剂可以作为与样品接触的溶液提供，例如，在缓冲溶液或其它水溶液中，例如在与步骤(b)的缓冲溶液相同的缓冲液中。步骤(b)可包括使样品与缓冲溶液和蛋白酶接触并孵育(得到的)缓冲溶液/蛋白酶/样品混合物。术语“孵育”在本文中广泛用于表示使缓冲溶液和蛋白酶与样品接触。因此，该术语包括简单地允许缓冲溶液/蛋白酶/样品混合物在步骤(c)中过滤之前静置一段时间。可以例如在将缓冲溶液和蛋白酶添加到样品中之后和/或在孵育期间混合样品/缓冲溶液/蛋白酶混合物。因此孵育时间可能不同，例如从一分钟，或几分钟或更短时间到更长时间段，例如5分钟或10分钟或更长时间。因此，通过代表性实例，可以将缓冲溶液添加到样品中并且可以将混合物孵育至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15分钟或更长时间。更长的孵育时间、例如20或30分钟或更长时间是可能的，但可能不是必需的或不可取的。在这方面将理解，步骤(c)中的过滤过程可能需要一些时间，因此在过滤步骤期间可以进行孵育。例如，可以使样品与缓冲溶液和蛋白酶接触，并且可以立即或几乎立即(例如在一分钟或更短时间后)开始过滤过程。可以在过滤步骤开始时使用缓冲溶液和蛋白酶孵育样品或者可以在过滤步骤期间继续孵育样品。在一些实施方案中，可以在室温进行孵育，在另一些实施方案中，可以增加温度。因此，可以在例如15至37℃、例如在15、18、20、22或25℃中任一温度至30、35或37℃中任一温度进行孵育。从上文可以理解，样品/缓冲溶液/蛋白酶混合物可以各种方式获得，这取决于添加顺序以及缓冲溶液和蛋白酶是否在与样品接触之前预先混合。因此，在一个实施方案中，缓冲溶液可含有一种或多种蛋白酶。在接触步骤(b)之后，这种含蛋白酶的缓冲溶液在本文中也称为缓冲溶液。术语“缓冲溶液/蛋白酶/样品”混合物”可以与任何顺序呈现的混合物的组分一起使用，并且在含义上是同义的，并且可与术语“缓冲溶液/样品混合物”互换使用。当将缓冲溶液和蛋白酶添加到样品中时，所得混合物是非低渗的。如下面将更详细描述的，具体而言，缓冲溶液/蛋白酶/样品混合物对于复杂样品是非低渗的(即相对于起始样品，或者在进行该方法之前，或者在加入缓冲溶液/蛋白酶之前的样品)，更特别地，对于可以包含在样品中的任何非微生物细胞(例如来自测试受试者的临床样品中存在的测试受试者的细胞)是非低渗的。因此，缓冲溶液的组成使得缓冲溶液/蛋白酶/样品混合物(即通过将缓冲溶液和蛋白酶添加到样品中形成的混合物)是非低渗的。同样地，以这样的方式提供或制备蛋白酶，使得所得混合物是非低渗的。如上所述，情况可能是在本发明的方法期间并非样品中存在的所有非微生物细胞都被裂解，因此也可以在本方法的步骤(c)中的过滤器上保留复杂样品中存在的一部分非微生物细胞。因此，虽然样品中存在的至少一部分非微生物细胞可以通过本文所述的方法裂解，但可能是裂解程度不足以除去样品中存在的全部或大部分非微生物细胞的情况。非微生物细胞的裂解程度或量可以根据样品、从中获取样品(对于临床样品)的受试者、缓冲溶液的精确性质(包括例如ph)、蛋白酶的精确性质而变化。因此，不是提供一种依赖于或要求完全或基本上完全裂解非微生物细胞用于相对于样品中存在的非微生物细胞从样品中选择性富集或分离微生物细胞的方法(即选择性裂解方法)，相反，本方法可以被视为相反提供一种通过使样品更容易过滤以除去其液体组分而从样品中回收细胞组分(特别是微生物细胞)的廉价、简单和有效的方法。术语“裂解”意指分解细胞，特别是分解细胞以释放细胞内容物，尤其包括核酸(例如破坏细胞膜)。裂解通常可以通过本领域已知的大量方法实现，例如病毒、酶、机械、电学、化学、热、冷或渗透机制，其损害细胞完整性，导致细胞成分的部分或完全释放进入周围溶液。术语“选择性裂解”或“选择性的裂解”意指裂解样品中存在的特定细胞亚群。因此，选择性裂解条件是设计用于裂解(即，哪个靶标)仅存在于样品中的特定细胞亚群的条件。例如，如上所述，选择性裂解可以是非微生物细胞，或更具体地是基本上不裂解存在于临床样品中的微生物细胞的来自临床样品中存在的测试中的受试者的细胞(例如哺乳动物细胞)的选择性裂解。或者表述为，本发明可被视为提供通过增强其过滤性从样品中回收活微生物细胞的改进方法。通过过滤除去样品的液体组分和不需要的较小组分(例如细胞或其他碎片、不需要的分子和复合物等)(滤液)，同时将细胞材料(包括微生物细胞)(渗余物)保留在滤膜上。随后可以回收过滤后保留的微生物细胞。换句话说，本发明可被视为提供用于从样品的细胞组分中去除样品的液体组分(包括可溶和悬浮组分)的改进方法。收集的样品(例如来自受试者或患者，即临床样品)可能含有可能干扰或抑制可能对样品中获得的微生物细胞进行的测试(例如鉴定或ast测试)的成分(例如抗生素化合物，例如抗生素)。因此，过滤样品以除去液体组分可以提高后续测试方法的准确性和/或灵敏度。本发明的方法可用于从样品中回收任何微生物细胞。术语微生物细胞和微生物在本文中可互换使用，并且可以用于包括可属于“微生物”类别的任何生物。虽然不一定如此，但微生物可以是单细胞的，或者可以具有单细胞生命阶段。微生物可以是原核的或真核的，通常包括细菌、古细菌、真菌、藻类和原生生物，尤其包括原生动物。特别感兴趣的是细菌(其可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性或革兰氏不确定性或无革兰氏反应性)和真菌。特别地，临床相关的细菌属包括葡萄球菌(包括凝固酶阴性葡萄球菌)、梭菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、丙酸杆菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、军团菌属、分枝杆菌属、微球菌属、梭杆菌属、莫拉氏菌属、变形杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、不动杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、肠球菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、嗜血菌属、奈瑟氏菌属、沙雷氏菌属、链球菌属(包括α-溶血和和β-溶血性链球菌)、拟杆菌属、耶尔森菌属和寡养单胞菌属，以及确实是任何其他肠道或大肠杆菌。β-溶血性链球菌会包括a群、b群、c群、d群、e群、f群、g群和h群链球菌。非限制性的革兰氏阳性细菌的实例包括金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、路邓葡萄球菌、staphylococcusschleiferei、山羊葡萄球菌、肺炎葡萄球菌、无乳葡萄球菌、酿脓葡萄球菌、唾液葡萄球菌、血统葡萄球菌、咽峡炎葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、缓症链球菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、马肠链球菌、牛链球菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌和屎肠球菌。革兰氏阴性菌的非限制性实例包括大肠杆菌、salmonellabongori、肠沙门氏菌、克氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、粘质沙雷氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、摩氏摩根菌、脆弱类杆菌、鲍曼不动杆菌和奇异变形杆菌。临床相关真菌可包括酵母，特别是念珠菌属的酵母，以及曲霉属、镰刀菌属、青霉属、肺孢子虫属、隐球菌属、球虫科、马拉色菌属、毛孢子菌属、枝顶孢霉属、根霉属、毛霉属和犁头霉属的真菌。特别感兴趣的是念珠菌和曲霉菌。真菌的非限制性实例包括烟曲霉、白色念珠菌、热带假丝酵母、光滑念珠菌、杜氏假丝酵母、近平滑念珠菌和克鲁氏假丝酵母。因此，“非微生物细胞”是可以存在于临床样品中的不是微生物细胞的任何细胞。特别地，在临床样品的情况下，这样的细胞可以来自测试中的受试者(即，从中获取临床样品的受试者)。换句话说，非微生物细胞可以是来自宿主或测试受试者的细胞。非微生物细胞可以是非微生物真核细胞，特别是动物(即人或非人动物)细胞，例如哺乳动物细胞。该方法的一个特征是回收的微生物细胞是活的，即缓冲溶液/蛋白酶基本上不损害或破坏复杂样品中存在的微生物细胞和/或防止或阻止微生物细胞的后续生长。术语“活的”定义了能够生长和/或繁殖的微生物细胞。术语“活力”是指微生物细胞生长和/或繁殖的能力。因此，根据本发明，由于用于从样品中回收微生物细胞的方法，样品中存在的微生物细胞的活力基本上没有降低。当然，应该理解，在任何生物系统中都不能保证绝对效果，并且不可避免地会存在一些变化。因此，不要求样品中存在的绝对所有微生物细胞都以活的状态回收，而是要求基本上所有(即显著多数)或基本或显著比例的回收细胞是活的。活力可以量化为能够生长和/或繁殖的细胞百分比的量度。优选地，从样品中回收的所有(即100％)或基本上所有的微生物细胞在根据本发明的处理后可以是活的，并且优选从样品中回收的至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％或80％的微生物细胞在过滤后是活的。然而，如果回收的微生物细胞的至少75％、70％、60％或50％是活的，则本文所述的回收方法仍然可以使用。尽管不太理想，但在本发明的某些实施方案中，从样品中回收的活细胞仅代表样品中微生物细胞的一部分就足够了，并且如果回收的总微生物细胞的至少40％、30％、20％或10％是活的可以进行本方法。或者，可以通过缓冲溶液/蛋白酶/样品混合物中的活细胞数(即在步骤(d)中从过滤器中回收微生物细胞之前或不回收微生物细胞)评估活力。因此，可以基于缓冲溶液和蛋白酶对样品的影响来测定活力。在某些实施方案中，缓冲溶液/样品混合物中存在的所有(即100％)或基本上所有的微生物细胞在与本方法的步骤(b)中的缓冲溶液接触后可以是活的，并且优选缓冲溶液/样品混合物中存在的至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％或80％的微生物细胞在孵育后是活的。然而，如上所述的活力水平可能更低，例如，缓冲溶液/样品混合物中存在的微生物细胞的至少75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％可能是活的。尽管用本发明的缓冲溶液和蛋白酶处理样品可以导致缓冲溶液/蛋白酶/样品混合物中微生物细胞的高或非常高的存活率，在步骤(d)中从过滤器中回收活的微生物细胞当然可以更少，例如由于过滤期间和/或从过滤器回收过程中微生物细胞的损失。因此，来自过滤器的活细胞回收率的较低百分比(例如，从过滤器回收的cfu与起始样品中的cfu相比)本身并不表示缓冲溶液和蛋白酶(即在接触/孵育步骤中)对活力有害。因此，在某些实施方案中，如上所述，回收的活微生物细胞的百分比可替代地是回收的活微生物细胞相对于回收的微生物细胞的总数或量的百分比，或者表述为，在一些实施方案中，回收的活细胞占起始复合物样品中存在的微生物细胞总数(或活微生物细胞)总数的至少90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。可以通过测量已经根据本方法处理的微生物培养物的生长速率并且与未处理的微生物培养物进行比较来评估活力。处理样品以回收微生物细胞可能对微生物生长速率有影响，但优选这对微生物生长速率没有任何显著影响。然而，具有以这种方式未经处理的培养物的生长速率的至少90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的微生物培养物可能仍然用作微生物培养制剂，用于测定微生物的抗生素敏感性。复杂样品可以是含有或怀疑含有微生物细胞的任何样品，并且包含可能需要从样品中除去的其他组分(该组分可能妨碍对样品中存在的微生物细胞的精确测试)。复杂样品通常可以是生物样品或可以包含生物样品，或者可选地表述为，复杂样品可以包含生物材料。具体而言，样品可包含生物衍生的非微生物(例如细胞)材料。因此，样品可以是环境样品，例如水样品(例如废水)、污水排出物、土壤样品或悬浮液、食品样品(例如水果或蔬菜汁、肉、水果、蔬菜或乳制品)或其匀浆，或医学或临床样品。可以在进行本发明的方法之前处理或加工复杂样品。具体而言，可以将介质添加到收集的样品中(其包括可以将收集的样品添加到介质中)。这种介质可以是例如载体或稀释介质。因此，在本发明的某些实施方案中，收集的样品可以稀释或收集在液体或溶液中，例如水或缓冲液或其他水溶液。在某些实施方案中，培养基不包含离液剂或洗涤剂(或如下文进一步讨论的任何裂解剂)。在其他实施方案中，如果包含洗涤剂或离液剂，或者如果培养基是低渗的，则将对样品进行处理，使得在步骤(b)中当将缓冲溶液和蛋白酶添加到样品中时，在缓冲溶液/蛋白酶/样品混合物中不存在离液剂或去污剂，并且混合物不是低渗的。在另一个优选的实施方案中，介质可以是培养基(即允许可能存在于样品中的微生物生长的培养基)。因此，在某个特定的实施方案中，样品例如临床样品可以收集在含有适于培养微生物细胞的培养基的容器中。在本发明的优选实施方案中，样品是临床样品或包含临床样品，其可以从测试受试者获得。受试者(或测试中的受试者)通常是人类患者但可以是任何人或动物，通常是哺乳动物受试者。因此，它可以是包含非微生物细胞(即来自测试受试者的细胞)和微生物细胞的混合物的任何临床样品，并且可以是身体组织、细胞或液体的任何样品，或源自身体的任何样品，例如拭子、洗涤液、抽吸物或冲洗液等。合适的临床样品包括但不限于血液、血清、血浆、血液成分、关节液、尿液、精液、唾液、粪便、脑脊髓液、胃内容物、阴道分泌物、粘液、组织活检样品、组织匀浆、骨髓抽吸物、骨匀浆、痰液、抽吸物、伤口渗出液、拭子和拭子冲洗液，例如鼻咽拭子、其他体液等。在特别优选的实施方案中，临床样品是血液或血液衍生的样品，例如血清或血浆或血液成分。微生物可以是任何病原微生物或引起体内感染的任何微生物，因此该方法可以用于检测或诊断受试者身体的任何部分中或其上的微生物感染(即任何微生物)，可以相应地确定样品(即临床样品)的性质，例如根据感染症状或疑似感染的呈现，或受试者的一般临床状况。尽管包括任何微生物感染，但本发明的方法特别适用于脓毒症的检测或诊断(或更一般地，脓毒症的管理)，或怀疑脓毒症的情况。因此，在本发明的特定方面，样品是临床样品或包含临床样品，其可以来自患有或怀疑患有脓毒症或具有脓毒症风险的受试者。在这种情况下，样品通常是血液或血液衍生的样品。通常，样品会是血液。在本发明的一个方面，可以将临床样品(例如血液样品)收集在含有培养基的培养瓶中，并任选在回收微生物细胞之前培养。在一些实施方案中，可能需要将临床样品引入培养瓶中并立即或仅在短时间培养后从培养瓶中取出等分试样的临床样品/培养基混合物用于测试(例如用于微生物id)，同时在进一步测试(例如ast测试)之前对培养瓶进行连续培养。在我们的共同未决申请pct/ep2015/063173中描述了这种方法。本发明的微生物细胞回收方法可用于从培养期之前、期间或之后从这种临床样品/培养基混合物中取出的等分试样中回收微生物细胞。培养瓶中提供的培养基可含有中和抗微生物化合物作用的组分，例如通过吸附降低其在样品中的功效和/或浓度，和/或诸如聚萘磺酸钠(sps)的化合物，其抑制可能在样品中存在的受试者的先天免疫系统的组分(例如补体或其他因子)的抗微生物活性(palarasah,y.等jclinmicrobiol.2010年3月；48(3):908–914)。因此，在随后测试微生物细胞之前，可能需要从含有这些化合物的培养基中分离微生物细胞。在本发明的特定方面，临床样品是血液或血液衍生的样品，并收集在血培养瓶(bcf)中。血培养瓶的实例包括bact/alert(biomerieux)血培养瓶，bactec血培养瓶(bectondickinson)或versatrek血培养瓶(thermofisher)，或实际上任何已知用于血液取样特别是用于检测微生物的培养目的的管、培养瓶或瓶。因此，根据本发明的复杂样品可以包含培养基中的临床样品。此外，复杂样品可以是临床样品培养物(即已经培养一段时间的临床样品)。在这方面可以看出，经受本发明方法的复杂样品可以是收集或制备的复杂样品的一部分。因此，在一个实施方案中，本发明方法的复杂样品可以是从复杂样品中取出或取出的等分试样(例如测试等分试样)，例如来自含有临床或其他样品的培养容器(培养瓶)的内容物，无论是在培养(即孵育)期间之前、期间还是之后。因此，在一个具体实施方案中，本发明提供了从血培养瓶中回收微生物细胞的方法，优选其中临床样品已在血培养瓶中培养一段时间。向某些市售培养容器(例如血培养瓶)提供树脂珠，该树脂中和临床样品中存在的任何抗微生物剂的效果(即已经施用于受试者的任何抗微生物剂)以促进培养中微生物细胞的生长。在优选的实施方案中，可以过滤复杂样品以除去可能存在于复杂样品中的任何树脂(例如，当除去测试等分试样时可能已经从培养容器中除去的树脂)。因此，可以在添加缓冲溶液之前对复杂样品进行预过滤。或者，可以在添加缓冲溶液之后，并且在过滤样品之前对其进行预过滤。在替代实施方案中，在从过滤器中回收微生物细胞后，可以通过过滤除去树脂。换句话说，可以在从过滤器中回收微生物细胞后除去树脂。优选地，过滤或预过滤以除去树脂的步骤将使用具有孔径的过滤器，该过滤器基本上不从测试等分试样中除去任何细胞物质，但是能够除去树脂颗粒，例如至少100、200或300μm，但可达1000μm。缓冲溶液与一种或多种蛋白酶一起用于本发明的方法中，这改善了样品的过滤性。术语“蛋白酶”在本文中广泛用于包括任何蛋白酶、肽酶或蛋白酶，并且是指能够催化多肽(即蛋白质或肽)中两个l-α氨基酸之间的肽键水解的任何酶。蛋白酶可以切割多肽内的肽键，即内部肽键(内肽酶)，或者可以从多肽的c-末端(羧肽酶)的n-末端(氨肽酶)降解末端或倒数第二个氨基酸(外肽酶)。在本发明方法中使用的ph范围内具有蛋白水解活性的任何蛋白酶均可用于本发明的方法中。在一个实施方案中，蛋白酶可以在本发明的ph范围内具有其最高活性(即100％活性)。然而，在该范围之外具有其最佳ph(即它们具有最大活性水平的ph)的蛋白酶也可以用于本发明的方法中，条件是它们在该ph范围内保持至少一定程度的蛋白水解活性。因此，可用于本发明方法的蛋白酶可具有本文所述缓冲液的ph范围内的活性的至少90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％或5％，只要保留一定程度的蛋白水解活性即可。可用于实施本发明的蛋白酶包括丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸或金属蛋白酶类的蛋白酶。因此，可以在本发明的方法中特别有用的蛋白酶的非限制性列表包括蛋白酶k、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胱天蛋白酶、tev蛋白酶、胃蛋白酶、早老素、碱性蛋白酶、纳加拉酶或蛋白酶xv。在代表性实例中，蛋白酶可以是蛋白酶k或可以包括蛋白酶k。待添加到样品中的缓冲溶液的体积将根据样品的性质和/或样品是否在介质(例如培养基)中稀释，以及缓冲液的各种组分的浓度而变化。然而，在某些方面，可以使用缓冲溶液:复杂样品的高达10:1、5:1、2:1或1:1的比例。或者可以使用较小体积的缓冲溶液，因此可以使用缓冲溶液:复杂样品的比例可以高达1:2、1:5或1:10。缓冲溶液:复杂样品的比例也可以落在一定范围内，例如10:1-1:10、5:1-1:5或2:1-1:2。然而，在特别优选的方面，缓冲溶液:复杂样品的比例是2:1。这里提到的缓冲溶液可以是含有一种或多种蛋白酶的缓冲溶液，或者所述的体积和比例可以适用于缓冲溶液和蛋白酶的总体积。用于本发明方法的缓冲溶液的ph至少为ph6.0，更特别是至少ph6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0，并且ph小于11.0。在某些实施方案中，ph可以小于ph10.7，或小于或等于ph10.6，例如小于ph10.6。在具体实施方案中，ph可以是至少ph6.0且至多ph10.5。因此，缓冲溶液的ph可以是至少ph6.5、ph7.0、7.5、ph8.0、ph8.5或ph9.0，并且至多ph10.5或10.6。在另一个实施方案中，缓冲溶液的ph可以至多ph10，至多ph9.5或至多ph9。因此，在本发明的某些方面，可以使用缓冲溶液的ph范围为ph6.0-ph10.6、ph6.0-ph10.5、ph6.5-ph10.5、ph7.0-ph10.5、ph7.5-ph10.5、ph8.0-ph10.5、ph8.5-ph10.5或ph9.0至ph10.5。发现尽管在上述范围内的ph值下观察到良好的过滤性，但在ph值高于ph9时，样品更容易过滤(样品更快速地过滤并且具有更低的背压)。不希望受理论束缚，假设在较高的ph值(即高于ph9)下，可能发生更大程度的非微生物细胞裂解，从而使样品更容易过滤。上面讨论的ph范围涉及在步骤(b)中使用的缓冲溶液的ph，即在将缓冲溶液加入样品之前的ph。这可以是含有蛋白酶的缓冲溶液。或者，上述ph范围可以应用于通过将缓冲溶液与一种或多种蛋白酶混合而获得的混合物(例如通过预混合缓冲溶液和蛋白酶溶液或通过重构蛋白酶制剂)。此外，在缓冲溶液和蛋白酶与样品接触后，上述ph范围可替代地应用于缓冲溶液/蛋白酶/样品混合物。换句话说，步骤(b)中产生的所得混合物的ph可以在上述范围内。此外，该方法可包括在步骤(b)期间将ph调节至一次或多次或一个阶段或多个阶段。例如，可以调节步骤(b)中产生的混合物的ph，例如，使其落在上述任何范围内。可以在添加所有组分(缓冲溶液、样品、蛋白酶)之后调节ph，或者可以在添加(接触)一种或多种组分之后或之后(例如在其期间)调节ph。ph调节可以相应于本领域熟知的方法进行，例如通过加入酸或碱。缓冲溶液优选含有足够量或浓度的合适(例如生物)缓冲液，其在加入样品时保持ph，即使得样品和缓冲溶液的混合物保持在所需ph范围内以允许有效过滤样品。缓冲溶液中缓冲液的浓度可以是至少10mm、20mm、50mm、100mm、200mm、500mm、1m、2m、5m或10m。应理解，缓冲溶液是水性缓冲溶液。通常，pka在7和11之间的缓冲液可用于将溶液缓冲至上述ph范围内的ph，因此在一个实施方案中，缓冲液的pka在该范围内。然而，其他缓冲液也可适用于维持合适的ph。还需要考虑诸如缓冲液的溶解度(更可溶的缓冲液可用于制备浓缩的储备溶液)、生物膜对缓冲液的渗透性(可渗透缓冲液在某些情况下可破坏水在生物膜上的转运，这能够导致裂解)和缓冲液的离子强度等因素。最初用作缓冲剂(例如磷酸盐)的许多无机物质不是生物惰性的，并且可能影响生物系统(例如通过抑制酶活性)。所谓的“良好”缓冲液(n-取代牛磺酸或甘氨酸缓冲液)通常是生物学惰性的，因此被认为是更好的生物缓冲液(biologicalbuffers，applichem，2008，通过引用整体并入本文)。因此，在一个方面，缓冲液可以是“良好”缓冲液或生物缓冲液。在本发明的方法中可以使用许多不同的缓冲液，包括(但不限于)以下缓冲液：aces、ada、氨、amp、ampd、ampso、bes、bicine、bis-tris、bis-tris-丙烷、硼酸、cacodylate、cabs、caps、capso、碳酸氢盐/碳酸盐、ches、柠檬酸盐、dipso、甘氨酸、甘油基甘氨酸、hepes、hepps、heppso、咪唑、mops、mopso、磷酸盐、pipes、popso、taps、tapso、牛磺酸、tea、tes、tricine或tris。但是，在本发明的优选方面，缓冲液是caps。任选地，一种或多种核酸酶可以进一步用于本发明的方法中。特别地，步骤(b)可任选地进一步包括使样品与一种或多种核酸酶接触。例如，缓冲溶液可任选地进一步包含一种或多种核酸酶。或者，核酸酶可以包含在蛋白酶制剂中，或者它们可以与样品分开接触，例如，分别用缓冲溶液或其他水溶液重建，并与样品接触或可以使用单独的核酸酶溶液。术语“核酸酶”是指能够催化两个相邻核苷酸碱基之间的磷酸二酯键水解的任何酶，并且包括脱氧核糖核酸酶(dnase)和/或核糖核酸酶rnase酶。酶可以切割寡核苷酸分子(内切核酸酶)内的磷酸二酯键，或者可以从核苷酸分子的末端降解3'末端核苷酸。核酸酶可用于分解从复杂样品中存在的非微生物细胞的裂解中释放的任何核酸。然而，在其他实施方案中，不包括或使用核酸酶，既不是缓冲溶液也不是蛋白酶制剂，也不是与样品接触的任何其他制剂或试剂包含核酸酶，特别是dnase。换句话说，在一些实施方案中，样品不与核酸酶接触，或更具体地，与dna酶接触，或甚至更具体地与dnasei接触。在某些实施方案中，缓冲溶液不包含dnase酶，例如，外切核酸酶和/或内切核酸酶如dnasei。可以使用的其他组分或成分，例如，添加到缓冲溶液中或包含在缓冲溶液中包括一种或多种助滤剂。用作助滤剂的各种材料是本领域已知的(参见例如us7,547,526(purdueresearchfoundation)和ep1527172(molzym))，并且可以使用任何这些材料，包括例如硅藻土或珍珠岩。添加的助滤剂的量根据样品类型等能够进行优化。在某些实施方案中，本发明步骤(b)中使用的缓冲溶液不含任何添加的裂解剂或促进复杂样品中存在的非微生物细胞的选择性裂解的任何其他成分或组分。也就是说，缓冲溶液不含任何其他此类裂解剂，或除缓冲溶液本身之外的任何此类裂解剂。(如上所述，缓冲溶液本身在一些实施方案中可具有裂解性质，或能够裂解(更特别地选择性裂解)非微生物细胞)，即使不是全部或完全。因此，在某些实施方案中，本发明的方法不利用除缓冲溶液之外的任何其他裂解剂，或超出上文讨论的缓冲溶液和蛋白酶和任选的核酸酶，因此，步骤(b)中的缓冲溶液不含任何洗涤剂，包括阴离子、阳离子、非离子或两性离子洗涤剂。更一般地，该方法在步骤(b)中不使用或不包括使用洗涤剂。洗涤剂可包括一种或多种非变性裂解洗涤剂，例如tritonx100-r、tritonx-114、np-40、genapolc-100、genapolx-100、igepalca630、aslasolve200、brij96/97、chaps、辛基β-d-吡喃葡萄糖苷、皂苷和非乙二醇单十二烷基醚(c12e9，聚多烯醇)。从缓冲溶液中排除的其它洗涤剂包括十二烷基硫酸钠(sds)、n-十二烷基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆汁盐、十六烷基三甲基溴化铵、sb3-10、sb3-12、氨基磺基甜菜碱-14和c7bzo。缓冲液还不包含增溶剂，例如brij98、brij58、brij35、吐温80、吐温20,pluronicl64、pluronicp84、非洗涤剂磺基甜菜碱(ndsb201)、aphipols(pmal-c8)和甲基-β-环糊精或聚氧乙烯洗涤剂如聚氧乙烯洗涤剂(其可包含结构c12-18/e9-10，其中c12-18表示碳链长度为12-18个碳原子，e9-10表示9-10个氧乙烯亲水头基。例如，聚氧乙烯洗涤剂能够选自brij97、brij96v、genapolc-100、genapolx-100、非乙二醇单十二烷基醚(聚多卡醇)或其组合和乙二胺四乙酸(edta)。诸如皂苷和胆碱的分子、或破坏、分散或溶解非微生物细胞的磷脂双层的任何其他小有机分子也可以被认为是用于本发明目的的洗涤剂，并且在某些实施方案中是，在本文公开的方法中，步骤(b)中使用的缓冲溶液不含任何这些化合物。此外，缓冲溶液还不含离液剂或离液剂(或更一般地，该方法的步骤(b)不使用或不包括使用离液剂(chaotrope或chaotropicagent))。离液剂是可以破坏溶液中水分子之间的氢键网络的分子，从而降低溶液中的疏水效应。离液剂包括丁醇、乙醇、苯酚、丙醇、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、氯化胍、硫脲和尿素等化合物。在某些实施方案中，缓冲溶液还不含离子液体。离子液体已用于从复杂样品或介质中分离微生物细胞(如wo2010/145754中所述)，优选范围为0.5-20％w/w。离子液体或液体盐是离子物质，其由有机阳离子和一般无机阴离子组成(即它们不含任何中性分子)，并且通常具有低于373k的熔点(优选为在室温下为离子的液体-约25℃。通常，离子液体具有式k+a-。离子液体的阳离子k+可以是例如铵、鏻、脲、硫脲、咪唑鎓、吗啉鎓或胍鎓，或杂环阳离子。阴离子a-可以是例如卤离子、四氟硼酸根、六氟磷酸根、氰胺、硫氰酸根或通式[nrf)2]-或通式n(xrf)2]-的酰亚胺，其中rf表示具有1至8个c原子的部分或完全氟取代的烷基，x表示so2或co。特别地，缓冲溶液既不含离子液体也不含mgcl2(尽管可以理解，可以存在例如来自蛋白酶的存储介质和/或作为用于制备缓冲溶液的水中的杂质存在的最小浓度的mgcl2)。换句话说，制备缓冲溶液而不添加mgcl2。因此，mgcl2的浓度低，例如，小于10mm、50mm、100mm或200mm。本方法还需要的是当将缓冲溶液和蛋白酶添加到样品中时，所得混合物是非低渗的。因此，可以在将缓冲溶液添加到样品之前选择或调节缓冲溶液的张力，使得向复杂样品中添加缓冲溶液不会导致复杂样品中非微生物细胞的低渗裂解。换句话说，将制备缓冲溶液，使得复杂样品和缓冲溶液的混合物相对于样品中非微生物细胞的细胞内张力的张力在不导致非微生物细胞低渗裂解的范围内。这同样适用于任何含蛋白酶和/或核酸酶的溶液。举例来说，血浆中nacl的渗透压约为290mosm/l(相当于约154mm，或9g/lnacl)。已经报道了人红细胞的低渗裂解，其中nacl浓度低于60mm(arias,m.等biochimicaetbiophysicaacta(bba)–biomembranesvolume1798,issue6,2010年6月,第1189–1196页)。在本发明的一个实施方案中，缓冲溶液含有至少60mmnacl或等效浓度的其他盐或溶质，其产生类似或等同张力的溶液。可以使用以下公式计算溶液的渗透压：其中是渗透系数(根据溶质的解离程度而变化)，n是分子解离的颗粒数(例如nacl，n＝2)，c是溶质的摩尔浓度。在本发明的一个实施方案中，缓冲溶液本身相对于样品中非微生物细胞的张力可以是低渗的，即其张力可以低于290mosm/l。然而，取决于缓冲溶液和样品的相对体积，样品的张力可足以避免由于添加缓冲溶液而导致的非微生物细胞的低渗裂解。例如，在本发明的某些实施方案中，临床样品可以在含有适于微生物生长的培养基的血培养瓶中提供；这种培养基具有高盐含量，因此向这样的样品中加入低渗缓冲溶液可能不一定得到能够裂解样品中存在的非微生物细胞的低渗溶液。类似的评论适用于任何含蛋白酶和/或核酸酶的溶液。然而，在本发明的另一个实施方案中，缓冲溶液本身不是低渗的。因此，缓冲溶液可以进一步包含合适浓度的无机盐、糖和/或其它非低渗的小有机分子(例如氨基酸、羧酸或甘油等)，即它可以具有至少120mosm/l、优选至少150mosm/l、200mosm/l或250mosm/l的渗透压浓度。例如，缓冲溶液可以是等渗的，即其渗透压可以在150-400mosm/l、200-350mosm/l或250-300mosm/l的范围。或者，缓冲溶液可以是高渗的，即其渗透压可以是至少300mosm/l、350mosm/l、400mosm/l或450mosm/l。同样在本发明的实施方案中，含有蛋白酶和/或核酸酶的溶液同样不是低渗的。缓冲溶液本身的渗透压将取决于复杂样品的性质，以及缓冲液和复杂样品的相对体积。因此，在某些实施方案中，缓冲溶液本身不会是低渗的。因此，可以根据复杂样品的性质选择缓冲溶液的渗透压(和任选的任何蛋白酶和/或核酸酶溶液的渗透压)。有利地，本发明提供了改善临床样品的过滤性的方法，即在过滤器变得“堵塞”之前能够过滤的临床样品的体积，即在不增加过滤膜破裂风险的情况下对任何进一步过滤不可渗透。如前所述，可以过滤的样品体积越大，可以回收的微生物细胞的数量越多用于进一步分析。因此，可以过滤的临床样品的体积可以是至少1ml，并且在本发明的某些实施方案中，至少2ml、5ml、10ml、15ml、20ml、30ml、40ml或50ml。适用于保留微生物细胞的任何过滤材料均可用于本发明的方法中。过滤器可以是由纤维网构成的网状过滤器，或者可以包括限定的孔，例如通过蚀刻产生。具体而言，可以使用膜过滤器。过滤器可以是网状过滤器或深度过滤器，其具有曲折路径。网状或深度过滤器通常由尼龙、pvdf或纤维素制成。深度过滤器中的孔结构是堆叠多孔材料层的结果。通过设计，这些类型的膜过滤器的互连孔结构通过包埋保留包括细胞(例如微生物细胞)的材料。这可能使得从这些类型的过滤器中回收微生物细胞更加困难，但不排除它们的使用。实际上，如下面的实施例所示，深度或网状过滤器可以成功地用于本发明的方法中。筛网过滤器(例如聚碳酸酯膜过滤器)具有更均匀的孔径分布和穿过膜的直通路径。这种类型的过滤器可能不太可能捕获大于平均孔径的细胞。具有限定孔(例如通过蚀刻产生)的过滤器在本领域中是已知的，以具有增加的过滤更大体积的可能性。然而，还已知这种过滤器在过滤期间承受更低的压力。能够承受更高压力的过滤器可能是更理想的。因此，过滤材料的选择可以基于几个竞争因素，这取决于样品的性质和/或其中存在的微生物细胞。然而，可选择用于本发明方法的示例性过滤材料包括聚碳酸酯轨道蚀刻(pcte)、醋酸纤维素(ca)、再生醋酸纤维素(rc)、聚酰胺/尼龙(pa/ny)、聚醚砜(pes)、不对称聚醚砜(pes)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚四氟乙烯(ptfehp)、聚酯轨道蚀刻(pete)、聚丙烯(pp)、硝化纤维素混合酯(mce/cme)和硝酸纤维素(cn)。在本发明的优选实施方案中，过滤器是聚酰胺或尼龙过滤器。在具体实施方案中，过滤器不是中空纤维过滤器。在又一方面，在过滤样品之前，过滤器未经预处理或涂覆有对微生物细胞具有亲和力的亲和结合剂或部分。因此，在这样的实施方案中，过滤器不是通过使用用于微生物细胞的亲和结合剂来设计或配置用于选择性捕获微生物细胞。过滤器的孔径适合于从溶液中回收微生物细胞。优选地，过滤器的孔径小于或等于0.6μm，更优选小于或等于0.5μm、0.4μm或0.3μm。在本发明的具体方面，过滤器的孔径是0.2或0.22μm或小于0.2或0.22μm。在通过过滤器(即在过滤器上和/或过滤器中)保留细胞之后，可以在进一步回收或分析微生物细胞之前对细胞进行一个或多个其他步骤以去除非微生物细胞和/或细胞碎片。因此，例如，过滤器保留的材料(即细胞或含有微生物细胞的材料)可以经受选择性裂解非微生物细胞的步骤，或者当细胞在过滤器上或过滤器中时(例如，在如下所述的洗涤步骤期间)或在回收期间，或者从过滤器回收的细胞/材料可以经受进一步的步骤，包括例如在从过滤器中回收之后，但在分析或测试微生物细胞之前，选择性裂解非微生物细胞。然而，在某些实施方案中并且对于一些下游测试(例如分子测试)，可能不需要对保留或回收的细胞进行任何进一步处理，例如非微生物选择性细胞裂解的进一步步骤，并且可能直接使用回收的细胞而没有这样的步骤。因此，在通过过滤器保留细胞和/或从过滤器中回收细胞后，可以对细胞进行选择性裂解步骤以裂解可以与微生物细胞一起保留或回收的非微生物细胞。取决于在本发明的步骤(b)期间非微生物细胞的裂解程度，这样的步骤可以被视为选择性裂解步骤(例如，如果非微生物细胞的实质性选择性裂解不发生在步骤(b))，或可以被视为进一步的选择性裂解步骤(例如，如果在步骤(b)中裂解了大部分细胞)。通过本发明的方法获得的微生物细胞可以用于测试以确定它们的身份和/或抗微生物敏感性。这些测试可以根据本领域已知的和文献中广泛描述的任何测试技术进行，包括常规或传统的微生物鉴定和ast测试，或任何其他鉴定、微生物分析或表征或ast测试。可以提及微生物鉴定方法，例如光谱学或质谱法(farina等2014.newmicrobiologica,38,245-250)。可以在进行或不进一步处理从样品中回收的细胞的情况下对微生物细胞进行这种分析或测试方法。这种下游处理可以包括例如从微生物细胞中除去非微生物细胞和/或分离核酸用于遗传测试，如下文更详细描述的。非微生物细胞的选择性裂解通常会释放非微生物核酸。因此，这种下游加工还可以包括去除或降解这种非微生物核酸，例如，使用核酸酶。本发明的方法特别适用于pct/ep2015/063173和gb1511129.7中描述的微生物检测和测试方案。因此可以任选地培养回收的微生物细胞并进行抗微生物敏感性测试测定或常规生化微生物鉴定测试，和/或可以分离来自微生物细胞的遗传物质(例如dna)并进行一个或多个分子测试以鉴定微生物和/或微生物可能具有的任何抗微生物抗性标记。从样品获得的微生物细胞的后续测试可以在有或没有介入选择性裂解步骤(或进一步选择性裂解步骤)的情况下进行，以裂解从复杂样品中回收的非微生物细胞。如上所述，在某些条件下，复杂样品中存在的大部分非微生物细胞可以在复杂样品与本发明方法的步骤(b)的缓冲溶液接触时裂解。因此，取决于要进行的测试的性质和在本发明的步骤(b)中发生的选择性裂解的程度，可能需要选择性裂解在过滤和回收后保留的非微生物细胞。从样品中获得的微生物细胞可以进行一种或多种基于分子的遗传测试。在一个实施方案中，在过滤步骤之后，或在过滤器渗余物(其包括微生物细胞)的回收期间或之后，可以选择性地裂解样品中存在的非微生物细胞(并因此在渗余物/回收的微生物细胞中)并且可以降解或去除非微生物遗传物质(核酸)。用于此的方法是本领域熟知的并且实际上可商购获得(例如来自qiagen或molzym)。在一个实施方案中，选择性裂解可以使用一种或多种离液剂进行，特别是离液盐，例如氯化胍、硫氰酸胍和/或碘化钠。此外，可以使用一种或多种表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠、brij40、tritonx100和/或吐温-20。一种或多种耐离体剂的核酸酶可用于降解裂解后从非微生物细胞获得的遗传物质。可以在过滤器上或在从过滤器中回收保留的细胞(材料)之后进行这种非微生物核酸的选择性裂解和降解。然而，可以不需要这样的步骤，并且可以在不进行这种选择性裂解步骤的情况下进行从微生物细胞直接回收核酸。我们已经确定某些商业上可获得的dna分离方法(例如那些利用离液剂试剂)不能直接用于血培养瓶(即从bcf中的微生物细胞中回收dna)。本发明有利地允许使用本发明的方法对bcf样品中回收的细胞使用这种基于离液剂的dna分离方法。从过滤器中回收后，可回收微生物细胞并裂解，以获得(释放)微生物核酸用于后续测试。如上所述，在释放微生物核酸用于后续测试之前，可以或可以不进行选择性裂解步骤以除去在过滤后保留的任何非微生物细胞。虽然可以理解的是，为此目的回收微生物细胞不需要活的微生物细胞，但是同样的微生物回收过程可用于遗传和其他测试如ast或需要活细胞的常规生化id测试的微生物细胞的回收可能是有利的(例如在自动化系统中)(或分子测试)。实际上，可以将回收的微生物细胞分成等分试样用于不同的测试。用于裂解微生物细胞和从中回收核酸的方法是本领域熟知的，因此可以使用本领域已知的任何技术进行这些步骤)。由此获得的微生物核酸可以进行一种或多种分子测试，以再次使用本领域熟知的技术鉴定其中存在的微生物和/或任何抗微生物抗性标记。从样品中获得的回收的微生物细胞可以进行抗菌素敏感性测试。可以使用回收的微生物细胞建立培养物，并且可以在两种或更多种不同条件下监测生长(例如包含一种或多种不同的抗微生物剂和一种或多种不同浓度)。在优选的实施方案中，ast测试中的微生物生长可以通过成像监测，因此在一个实施方案中，可能需要除去样品中存在的非微生物细胞和/或细胞碎片，其与微生物细胞一起回收，因为这些可能会干扰成像。可以如上所述进行选择性非微生物细胞裂解。在某些实施方案中，可能希望避免使用离液剂来回收ast的细胞，或者，这可以通过低渗细胞裂解，例如使用相对于在过滤器上保留细胞或含有溶解/洗涤剂的溶液后存在的非微生物细胞的张力的低渗缓冲液来方便地进行。然而，在另一个实施方案中，可能不需要这种选择性裂解步骤(或进一步的选择性裂解步骤)，并且可以使用从过滤器中回收的细胞直接建立培养物。在本发明的一个实施方案中，在过滤之后和回收微生物细胞之前，可以对过滤器进行一个或多个任选的洗涤步骤，其中用洗涤缓冲液洗涤由膜保留的细胞。这可以促进随后从过滤器中回收微生物细胞，去除杂质(例如非微生物细胞碎片和/或核酸)，和/或选择性裂解在步骤(b)期间未裂解并因此过滤后保留在过滤器上的非微生物细胞。因此，选择性非微生物细胞裂解(或进一步选择性非微生物细胞裂解)的步骤可以作为洗涤步骤的一部分或在洗涤步骤中进行。相对于非微生物细胞的细胞内张力，洗涤缓冲液可以是低渗的、等渗的或高渗的，并且可以任选地包含一种或多种如本文先前所述的洗涤剂、离液剂、核酸酶和/或蛋白酶，或任何其他裂解剂。可以进行多次或重复(即多于一次，例如两次、三次、四次或更多次)洗涤步骤，例如，以迭代的方式。可以通过将洗涤缓冲液以相同的流动方向添加通过过滤器作为样品和缓冲溶液或样品/缓冲溶液混合物来进行渗余物的洗涤，或者可以通过反冲洗通过过滤器然后通过过滤器过滤来添加。在从临床样品中除去液体部分(滤液)后，回收由过滤器保留的细胞(即渗余物)。回收可以通过回流(即，在与过滤相反的方向上流动)液体或含水介质例如缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)、tris缓冲盐水(tbs)或hepes缓冲盐水(hbs)或微生物生长培养基(例如muellerhinton培养基)通过过滤器来实现。或者，可以从过滤器表面或从过滤器内部机械地除去细胞，例如通过涡旋或刮擦，或通过洗涤例如通过反复移液吹吸将细胞从过滤器上分离。或者，可以将过滤器从过滤装置中取出并置于合适的缓冲液或生长培养基中，以使细胞从过滤器中解吸。可以看出，上述一个或多个进一步的纯化步骤可以直接在由过滤器保留的细胞上进行，即作为洗涤步骤的一部分或在洗涤步骤过程中进行。因此，在一个实施方案中，洗涤缓冲液可以是选择性裂解缓冲液，如上所述。然而，在进行这种进一步纯化步骤的替代实施方案中，这些可以在从过滤器中回收细胞后进行，即对从过滤器重悬或回收的微生物细胞进行。可以看出，除步骤(b)的缓冲溶液外，其他缓冲液也可用于本发明的方法，例如，洗涤缓冲液或回收缓冲液(例如用于反冲洗或用于重悬浮回收的细胞)或用于蛋白酶和/或核酸酶制剂。因此，步骤(b)的缓冲溶液可视为本发明方法的第一缓冲溶液。可以在任何方便的时间将蛋白酶添加到(第一)缓冲溶液中。在一个实施方案中，将蛋白酶添加到缓冲溶液中并在添加到样品之前预混合。或者，在另一个实施方案中，可以将缓冲溶液和蛋白酶分别加入样品中，例如，同时或顺序地，例如，一个紧接另一个。可以紧接使用前或就在使用前将蛋白酶加入缓冲溶液中。它可以作为蛋白酶溶液或粉末加入。类似地，可以在使用前添加核酸酶(如果使用的话)。例如，可以制备不含任何酶(即蛋白酶和任选的核酸酶)的缓冲溶液，并且可以将其加入冷冻干燥(或冻干)的蛋白酶(和任选的核酸酶)制剂中以在添加到样品之前重构酶。或者，蛋白酶和/或核酸酶可以单独重构(用样品缓冲溶液或用不同的缓冲溶液或水溶液)并分别与样品接触。在另一个实施方案中，蛋白酶和/或核酸酶可以通过与样品接触或与缓冲溶液/样品混合物接触而构成。因此，混合物组分即样品、缓冲溶液和蛋白酶(和任选的核酸酶)可以以任何顺序彼此接触。可以在任何阶段进行ph调节。可以类似地制备洗涤和回收缓冲液。方便地，本发明的方法可以是自动化的。上述方法的各个步骤很适合于自动化，例如向复杂样品中加入缓冲溶液和随后过滤样品以保留微生物细胞。过滤后细胞从过滤器中重悬也可以有利地自动化。复杂样品在某些情况下可能代表对用户的生物危害，因此以自动方式执行诸如这些的过程或步骤(即，没有用户重复暴露于样品)可被视为降低与处理潜在危险的样品相关的风险的手段。因此，从复杂样品中自动回收微生物细胞具有潜在的时间、成本和安全益处。因此，可以看出本发明提供了一种用于从复杂样品中回收活微生物细胞的微生物回收装置，所述装置设置成接收大于1ml的复杂样品，该装置包括：包含含有一种或多种蛋白酶的缓冲溶液的储库，或含有缓冲溶液的储库和含有一种或多种蛋白酶的储库，其中所述缓冲溶液的ph至少为ph6且低于ph11，其中所述缓冲液和所述蛋白酶不包含洗涤剂或离液剂，并且其中微生物回收装置设置成用于将样品与缓冲溶液和蛋白酶混合以产生混合物；适用于保留微生物细胞并设置成接收和过滤混合物的过滤器；和包含用于从过滤器中回收活微生物细胞的液体的储库，储库连接到过滤器，微生物回收装置设置成将液体输送到过滤器以除去保留的微生物细胞。缓冲溶液和蛋白酶制剂的组成使得缓冲溶液/蛋白酶/样品混合物(即通过使缓冲溶液和蛋白酶与样品接触而形成的混合物)是非低渗的，例如，对于复杂样品(特别是样品中存在的任何非微生物细胞)是非低渗的。微生物回收装置可以优选地设置成进行上述任何或所有方法步骤和优选/可选步骤。该装置可包括用于接收复杂样品的样品室。在这种情况下，微生物回收装置可以布置成在将混合物输送到过滤器之前将缓冲溶液和蛋白酶添加到样品中。或者，该装置可以配置成使得样品直接提供到包含含有一种或多种蛋白酶的缓冲溶液的储库中。或者，该装置可以配置成使得样品直接提供到包含缓冲溶液的储库或含有一种或多种蛋白酶的储库中。换句话说，含有缓冲溶液和/或一种或多种蛋白酶的储库也可以是样品室。在这样的实施方案中，含有缓冲溶液的储库可以直接连接到过滤器。在装置包含含有缓冲溶液和一种或多种蛋白酶的分开的储库的情况下，可以将装置布置成使得在与样品混合之前将缓冲溶液和一种或多种蛋白酶组合，得到含有一种或多种蛋白酶的缓冲溶液，然后将其与样品接触。或者，可以将装置布置成使得缓冲溶液和一种或多种蛋白酶可以分别与样品接触，例如，首先可以使缓冲溶液与样品接触，然后与一种或多种蛋白酶接触，可以使缓冲溶液和一种或多种蛋白酶同时或基本上同时与样品接触，或者可以首先使一种或多种蛋白酶与样品接触，然后是缓冲溶液。在具体实施方案中，其中所述装置包含含有缓冲溶液的储库和含有一种或多种蛋白酶的储库，所述一种或多种蛋白酶可以冷冻干燥或冻干形式提供(例如以固体或粉末形式)。所述冷冻干燥的至少一种蛋白酶可以在水溶液中重构。在优选的实施方案中，水溶液是缓冲溶液。然而，在另一个实施方案中，水溶液可以是复杂样品，即复杂样品可以直接添加到冷冻干燥的一种或多种蛋白酶中。在另一个实施方案中，可以使缓冲溶液与复杂样品接触，并且该混合物可以用于重构冷冻干燥的至少一种蛋白酶。优选地，该装置可以进一步包括或能够连接到流体输送装置以驱动样品的过滤。这可以是例如泵、注射器主体或真空歧管，但可以是适于驱动样品通过过滤器过滤的任何流体输送装置。该流体输送装置可根据需要连接到样品室或过滤器，以驱动样品的过滤。含有用于回收微生物细胞的液体的储库连接至过滤器。储库可以连接至过滤器的与样品室相对的一侧，即，使得来自储存器的液体沿与样品相反的方向穿过过滤器。由此可以通过将液体反冲洗通过过滤器来回收保留在过滤器上的微生物细胞。然而，在替代实施方案中，储库与样品室连接在过滤器的同一侧，并且通过使过滤器的渗余物侧与没有液体向后通过过滤器的液体接触，可以实现保留在过滤器上的微生物细胞的回收。用于回收活微生物细胞的液体可以是如上所述的缓冲液或培养基。然而，在本发明的具体实施方案中，液体是适于培养微生物细胞的培养基，即该装置可以包括含有适于培养微生物细胞的培养基的储库，用于从过滤器中回收活的微生物细胞。该装置可任选地进一步包括含有一种或多种核酸酶(该核酸酶可任选地冷冻干燥和在使用前重构)的储库。所述储库可以连接到样品室或含有缓冲溶液和/或至少一种蛋白酶的储库。该装置还可任选地包括连接到过滤器的含有洗涤缓冲液的储库，用于在过滤后洗涤过滤器。在一个实施方案中，含有洗涤缓冲液的储库可以与样品室连接到过滤器的同一侧，使得洗涤缓冲液可以与渗余物接触过滤器的同一侧。但是，在替代实施方案中，含有洗涤缓冲液的储库可以连接到过滤器的相对侧，使得洗涤缓冲液与样品相反的方向通过过滤器，从而洗涤过滤器。洗涤后，可以通过过滤将洗涤缓冲液与样品分离。洗涤缓冲液可以是如上所述的任何组合物。在具体实施方案中，洗涤缓冲液可以是选择性裂解缓冲液，其适于选择性裂解过滤后保留在过滤器上的非微生物细胞(特别是来自测试中的受试者的细胞)。在某些实施方案中，并且如上所述，洗涤缓冲液因此可以包含一种或多种蛋白酶、核酸酶、洗涤剂和/或离液剂，和/或相对于复杂样品中的非微生物细胞可以是低渗的。因此，所述装置可任选地进一步包括一个或多个另外的储库，所述储库包含一种或多种蛋白酶、核酸酶、洗涤剂和/或离液剂，所述储库可连接到含有洗涤缓冲液的储库和/或样品室。由此可以在本发明的装置内直接制备合适的洗涤缓冲液。在一个实施方案中，用于回收微生物细胞的装置可以是用于从复杂样品中回收微生物细胞的一次性消耗品。因此，该装置可以配置成结合到更大的装置中，该装置包括用于培养和/或测试微生物细胞的装置。然而，在另一方面，该装置可以是更大的装置的集成部分，并且仅是所述装置的某些组成部件，例如，过滤器，可能是一次性消耗品。参考以下实施例可以更好地理解本发明。具体实施方式实施例将掺有细菌(大肠杆菌或s.pyogenes)(约106cfu/ml)的bdbactecbcf培养基和edta血液(25％)组成的样品加入不含洗涤剂的含有蛋白酶的0.3mcaps缓冲液中。将5ml血液/培养基混合物加入10ml缓冲液中并孵育，然后使用直径25mm的0.2μm过滤器手动过滤。过滤后，如果整个体积通过过滤器，则用2体积的mh培养基或pbs洗涤过滤器。通过用5mlmh-培养基或pbs反冲过滤器，将样品重新悬浮以回收细胞。测量每个样品的过滤时间和可过滤的样品体积。从膜上回收的微生物细胞的活力在tsa平板上进行，并在过夜孵育后记录为cfu。基于输入的细菌数量和针对不同体积的进出样品校正的细菌输出数量来计算回收率。缓冲液的ph如下面的实施例中所述。实施例1-将含有蛋白酶的缓冲液添加到样品中增强其过滤性进行初始实验以确定添加含有蛋白酶的缓冲液对样品的过滤性的影响。如上所述使用大肠杆菌制备样品，并与含有蛋白酶k的缓冲溶液一起在一系列不同的ph值下孵育。作为比较，将另外的样品与ph10.5的不含蛋白酶k的缓冲溶液一起孵育。结果表明用各缓冲液处理后各样品的过滤性如表1所示。表1.样品ph9ph9.5ph10ph10.5ph11ph11.5仅缓冲液---<1ml--缓冲液+蛋白酶k15ml15ml15ml15ml15ml15ml反冲洗后回收活细胞5％5％20％5％0％0％孵育后细胞的活力(不过滤)n.d100％n.d>90％n.d<1％与在不含蛋白酶的样品相比，在每个测试的ph值下用含有蛋白酶k的缓冲溶液孵育的样品显示出增强的过滤性。这表明蛋白酶可用于增加样品的过滤性进行进一步的实验以证实蛋白酶k在增强临床样品的过滤性方面的重要性。使用如上所述的大肠杆菌制备样品，并使用caps0.3m缓冲液ph10.5+蛋白酶k评估添加具有或不具有蛋白酶k的缓冲液对样品的过滤性的影响。结果如表2所示。表2.体积通过过滤器了吗？到过滤器的大致时间样品1(+蛋白酶k)均通过1分45秒样品2(-蛋白酶k)4.5ml1分22秒样品3(+蛋白酶k)均通过1分46秒样品4(-蛋白酶k)4.5.ml59秒实施例2-微生物细胞的活力如上所述，使用大肠杆菌(革兰氏阴性细菌)和s.pyogenes(革兰氏阳性细菌)制备样品。使样品与含有蛋白酶k的ph10.0的缓冲液接触，然后用pbs洗涤，随后用dnasei处理5分钟，并如上所述重悬浮过滤器上的细胞。随后测试从样品中回收的微生物细胞的活力，结果显示在表3中。表3.大肠杆菌s.pyogenes实验113-20％31-32％实验230-34％47-56％实验325-27％28-39％实验432-36％平均27％(n＝12)39％(n＝9)发现革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性s.pyogenes在ph10.0下都是活的，其中s.pyogenes在这些条件下似乎具有更高的活力。使用来自molzym(molzymgmbh，bremen，germany)的dna试剂盒将回收的细胞用于制备细菌dna，并用实时pcr定量结果，以确定细菌以及残留的人dna的存在。对于大肠杆菌，从添加细菌的测量的cfu到洗脱液中存在的细菌dna的测量的基因组拷贝的大致总预效率约为7％，而对于s.pyogenes约为14％。发现人类dna减少了99.9％以上。实施例3-滤料对过滤性的影响测试并与标准乙酸纤维素(ca)比较了四种滤料：再生乙酸纤维素(regca)聚酰胺(pa)聚醚砜(pes)聚乙二烯(pvd)所有过滤器的孔径均为0.2μm。使用ph10.5并含有蛋白酶k的缓冲液，如上所述制备样品。结果显示在表4中。表4.体积通过过滤器了吗？到过滤器的大致时间pes6.5ml3分40秒pvd均通过3分26秒ca均通过4分42秒regca均通过6分17秒聚酰胺均通过2分这表明尽管可以在本发明的方法中使用一系列不同的滤料。选择聚酰胺和乙酸纤维素滤膜用于进一步测试以确定保留在滤器上的微生物细胞的效率或回收率。从不同过滤器中回收细菌如表5所示。表5.体积通过过滤器了吗到过滤器的大致时间回收的cfu回收效率ca(1)均通过2分6秒1e+0669.1％pa(1)均通过1分50秒1e+0653.1％ca(2)均通过3分1e+0679.1％pa(2)均通过1分44秒8e+0545.6％对于聚酰胺和乙酸纤维素过滤器，观察到良好的大肠杆菌细胞回收效率。实施例4-ph对过滤性和活力的影响制备均为0.3m的多个caps缓冲液并调节至ph7、8、9、9.5、10、10.5和11。将样品加入每种caps缓冲液中，然后与蛋白酶k一起孵育。然后使用聚酰胺过滤器过滤样品，并使用磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液重悬浮。基于集落形成计算恢复(即仅计数活细胞)。表6中显示了在不同ph值下过滤和回收微生物细胞。表6.在ph11-11.5的缓冲液处理中观察到过滤性的改善，然而，在这些高ph值下的微生物活力受损。在发现ph值至少为ph9的缓冲液可用于增强临床样品的过滤性之后，测试具有更宽ph值范围的缓冲液对增强临床样品的过滤性的影响。该结果如表7所示。表7.这些数据表明，使用含有广泛ph值的蛋白酶k的缓冲溶液可以提高临床样品的过滤性。因此，证明了使用蛋白酶在ph7至ph11之间的任何ph下过滤大量复杂基质(例如血液和血液+培养基)以促进过滤的方法，并且我们相信任何ph值从ph6到低于ph11的缓冲液可以用于这样的方法。如用caps和蛋白酶k缓冲液和直接平板孵育以计数活菌数所评估的，发现ph7和ph10.5之间的微生物细胞的活力接近100％。在ph7，在蛋白酶k处理5至15分钟后记录存活率为92至120％。在ph10.5，在蛋白酶k处理10分钟后记录存活率为95至120％。超过100％的存活率可以解释在这些实验中手动完成的铺板过程中的不精确性。因此，尽管在上表7的数据中活菌的回收率在ph8.5和9.5之间降低，但这可以通过优化每个ph下的特定反应条件来解决，例如，反应时间、蛋白酶浓度等。实施例5-用于过滤的条件对微生物细胞的危害小于现有技术中使用的条件。进行进一步的实验以证实本文鉴定的过滤条件的ph对微生物细胞的危害小于现有技术中的那些过滤条件。已经表明，在非常高的ph值下，非微生物细胞的选择性裂解是可能的，然而，在这种条件下微生物细胞的活力很差。将掺有大肠杆菌的edta-血液样品与ph10.5的缓冲溶液或含有8％naoh的溶液一起孵育。表8中提供了这些条件与本文所述的过滤条件的比较。表8.用含有8％naoh的溶液孵育样品导致没有从样品中回收活的微生物细胞。相反，在ph10.5下添加缓冲溶液基本上不影响样品中微生物细胞的活力。由于活力实验仅一式两份进行，因此对于用ph10.5的缓冲液孵育的样品观察到超过100％的回收率。当前第1页12