本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种三七植物激素结合蛋白基因pnphbp1及应用。
背景技术：
植物病害是农业生产中一个非常棘手的问题，尤其是真菌病害，约占到植物总病害的80％，严重影响农作物的产量和品质。传统的病害防治方法取得了一定成效，一是依靠传统育种方法培育抗性品种，二是化学农药的使用，三是采取轮作等耕作制度。然而，这些方法都存在或多或少的弊端，如抗性品种培育的周期长、化学农药残留高且极易造成环境污染、耕作制度调整则费时费力，所以传统控制植物病害的方法均不能彻底解决问题。随着重组dna技术的建立和发展，利用基因工程技术来培育抗病植物新品种已取得初步成效，且有望从根本上解决真菌病害问题。
植物由抗病基因介导的防卫过程存在一系列生理生化和分子生物学反应，这些反应从病原菌侵染点开始的超敏反应(hypersensitiveresponse，hr)，并延伸到远处组织的系统抗性或获得性抗性(systemicacquiredresistance，sar)，受制于信号传导网络的调控。植物激素（phytohormones）广泛参与抗病防卫反应的信号系统，如水杨酸，茉莉酸、乙烯等，通过调控关键基因的表达及信号放大，最终诱导一系列防卫反应基因的表达和代谢的变化而产生抗性。植物激素是协调许多细胞功能的化学信使，包括（但不限于）十个主要的种类：植物生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸，油菜素类固醇，乙烯，茉莉酮酸酯，多肽激素，水杨酸和独脚金内酯(santnera,calderon-villalobosli,estellem.planthormonesareversatilechemicalregulatorsofplantgrowth.natchembiol.2009,5:301-307)。在植物激素介导的信号传导网络中，多种植物激素结合蛋白(phytohormone-bindingproteins，phbp)也起着重要作用。
赤霉素（如赤霉酸）是二萜四环或五环生长调节剂，诱导种子发育、萌发、器官伸长和开花(yamaguchis.gibberellinmetabolismanditsregulation.annurevplantbiol.2008,59:225-251)。赤霉素首先在赤霉（gibberellafujikuroi）中被发现，一种水稻的真菌病原体，引起茎的极度伸长并最终导致植株枯萎和死亡。植物产生内源性赤霉素，其胞内的水平受负反馈回路调节，此外，生长素和乙烯的浓度也调节细胞内赤霉素的水平（fleetcm,suntp.adellacatebalance:theroleofgibberellininplantmorphogenesis.curropinplantbiol.2005,8:77-85;yamaguchis.gibberellinmetabolismanditsregulation.annurevplantbiol.2008,59:225-251）。赤霉素受体被称为赤霉素不敏感矮秆1蛋白（gid1），gid1基因的功能缺失突变导致植株矮化(pengj,richardsde,hartleynm,murphygp,devoskm,flinthamje,bealesj,fishlj,worlandaj,pelicaf,sudhakard,christoup,snapejw,galemd,harberdnp.‘greenrevolution’genesencodemutantgibberellinsresponsemodulators.nature.1999,400:256-261)。murase等人对拟南芥（arabidopsisthaliana）gid1与赤霉素的复合物在结构上进行了研究(murasek,hiranoy,suntp,hakoshimat.gibberellin-induceddellarecognitionbythegibberellinreceptorgid1.nature.2008,456:459-463)。gid1受体可以结合具有保守的asp-glu-leu-leu-alan-末端序列的della蛋白，它们是赤霉素反应的负反馈调节剂（schwechheimerc.understandinggibberellicacidsignaling--arewethereyet.curropinplantbiol.2008,11:9-15;schwechheimerc,willigebc.sheddinglightongibberellicacidsignaling.curropinplantbiol.2009,12:57-62）。与gid1结合的赤霉素启动gid1-della复合物的形成，della蛋白不能再作为赤霉素依赖性基因的转录抑制因子，而是被泛素化并被降解。
病程相关蛋白10（pathogenesisrelatedprotein10）很小（最高仅19kda），通常是单体的、微酸性的胞质植物特异性蛋白(fernandesh,michalskak,sikorskim,jaskolskim.structuralandfunctionalaspectsofpr-10proteins.febsj.2013,280:1169-1199)。pr10蛋白的结构保守性已经得到很好的确立，具有典型的pr10折叠。pr10折叠的最突出特征是在螺旋α3和β-折叠之间形成大的疏水空腔，显然是pr-10配体的结合位点。晶体学研究证实了pr10蛋白与细胞分裂素结合的可能(fernandesh,bujacza,bujaczg,jelenf,jasinskim,kachlickip,otlewskij,sikorskimm,jaskolskim.cytokinin-inducedstructuraladaptabilityofalupinusluteuspr-10protein.febsj.2009,276:1596-1609)。一些序列相似性很低的pr10被鉴定为细胞分裂素特异性结合蛋白(cytokinin-specificbindingproteins，csbp)亚家族，此外，两个csbpmtcsbp以及vrcsbp被证实也与赤霉素结合（ruszkowskim,sliwiakj,ciesielskaa,barciszewskij,sikorskim,jaskolskim.specificbindingofgibberellicacidbycytokinin-specificbindingproteins:anewaspectofplanthormone-bindingproteinswiththepr-10fold.actacrystallographica.2014,70(pt7):2032-2041）。上述研究表明pr10并不是只与细胞分裂素特异结合，从而ruszkowski等人建议用phbp取代csbp这个术语。
三七[panaxnotoginseng(burk)f.h.chen]为五加科(araliaceae)人参属(panax)草本植物，又称田七和金不换，是我国重要的传统名贵中药材，最早在我国西南部地区的少数民族（壮、苗、瑶、彝族）中应用，而后随着各民族间的交流和军旅、商贾的传播，才逐渐传入中原地区。三七中的有效活性成分主要是皂苷，具有消肿镇痛、抗炎、抗衰老的作用，能调节人体免疫功能，消除疲劳，延缓衰老，三七总皂苷还能够有效改善记忆力，是历史悠久的药食两用天然资源。尽管对三七药材的需求逐年上涨，但三七的产量却没有大幅上升，而三七生长周期长、病害多发是主要原因之一。三七的抗病遗传育种研究基础薄弱，已经成为三七产业健康发展的限制因素。深入研究三七的抗病分子机制，尤其是揭示抗病防卫反应的信号传导以及发掘抗病功能基因，将有助于三七抗病遗传育种工作的稳步提升。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种从三七中克隆获得编码植物激素结合蛋白的全长基因pnphbp1，植物激素结合蛋白基因pnphbp1核苷酸序列如seqidno：1所示，该基因cdna全长序列为623bp，包含一个465bp的开放阅读框、56bp的5’非翻译区、102bp的3’非翻译区，编码如seqidno：2所示氨基酸序列的蛋白质。
本发明中pnphbp1基因的编码区是序列表seqidno：1中第57-521位所示的核苷酸序列。
本发明分离克隆三七的一个抗真菌相关基因的完整cdna片段，利用根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌能力，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为pnphbp1。
本发明涉及分离包含pnphbp1的dna片段并鉴定其功能，其中所述dna片段如序列表seqidno：1所示，对该基因进行序列分析，发现pnphbp1全长cdna为623bp，包含一个465bp的开放阅读框(orf)、56bp的5’非翻译区(untranslatedregion，utr)、102bp的3’utr，其中orf编码一个具有154个氨基酸的蛋白质。pnphbp1编码的蛋白质具有pr10蛋白的保守基序glycine-richloop，blastp检索结果表明pnphbp1与胡萝卜(daucuscarota)、桃(prunuspersica)、博落回(macleayacordata)和蓖麻(ricinuscommunis)的植物激素结合蛋白的相似性分别为76%、66%、62%和61%，表明其属于三七中的植物激素结合蛋白。超表达序列表seqidno：1所示的蛋白质可以增强烟草对灰葡萄孢(botrytiscinerea)、茄腐镰刀菌(fusariumsolani)、胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)的抗性。
本发明将三七植物激素结合蛋白基因pnphbp1应用在提高烟草对灰葡萄孢、茄腐镰刀菌、胶孢炭疽菌抗性中，具体操作如下：
（1）采用扩增pnphbp1的特异引物，从三七根中提取总rna，通过逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，rt-pcr)扩增出pnphbp1的编码区，然后将其连接到pmd-18t载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；
（2）用限制性内切酶psti和ecori酶切pmd-18t-pnphbp1载体，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pcambia2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得pnphbp1基因片段与pcambia2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；
（3）以重组载体t-dna上具有的抗性标记筛选转化子，并通过pcr以及rt-pcr检测得到真正的转基因植株，分析转基因植物蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。
本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明来自三七的pnphbp1基因能增强植物对真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、花卉等提供方便，大量减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减小环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1是本发明pnphbp1转基因烟草基因组dna的pcr检测结果示意图，图中：marker为dl2000dnamarker(大连宝生物)；正对照为质粒pmd-18t-pnphbp1为模板的pcr结产物；wt为非转基因烟草(野生型)总dna为模板pcr的产物；
图2是本发明阳性pnphbp1转基因烟草中pnphbp1转录水平的表达分析结果图；图中：marker是dl2000dnamarker(大连宝生物)；wt是非转基因烟草总rna逆转录cdna为模板的pcr产物；正对照是质粒pmd-18t-pnphbp1为模板的pcr产物；
图3是本发明pnphbp1转基因烟草体外抑菌活性效果图；图中a、b、c分别是灰葡萄孢、胶孢炭疽菌、茄腐镰刀菌；wt为野生型烟草的总蛋白；buffer为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：pnphbp1全长基因克隆以及序列分析
用茄腐镰刀菌接种三七，用接种24h后的根提取总rna，用液氮将接种后的三七根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总rna，采用逆转录酶m-mlv(promega)以总rna为模板合成cdna第一链，反应体系和操作过程为：取5μg总rna，依次加入50ngoligo（dt）、2μldntp（2.5mmeach）、depc水至反应体积为14.5μl；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4μl5×first-standbuffer、0.5μlrnasin（200u）、1μlm-mlv（200u），混匀并短时离心，42℃温浴1.5h，取出后70℃加热10min，终止反应。cdna第一链合成后置于-20℃保存备用。
以合成的第一链cdna为模板，扩增目的基因pnphbp1，所用上下游引物序列分别为
所得到pcr产物只有一条dna带，故直接对pcr产物进行ta克隆，使用的试剂盒为pmd18-tvectorkit（大连宝生物），反应体系和操作过程为：取1.5μlpcr产物，依次加入1μlpmd18-tvector（50ng/μl）和2.5μl2×ligationsolutioni，混匀后置于16℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中。使用含有氨苄青霉素（ampicillin，amp）的lb固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增pnphbp1的特异引物鉴定出多克隆位点插入pnphbp1的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的pnphbp1全长cdna为623bp，通过ncbiorffinder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析发现其包含一个465bp的开放读码框（见序列表），pnphbp1编码一个含154个氨基酸的蛋白质pnphbp1，其分子量约为16.99kda，等电点约为5.08，含有1个半胱氨酸残基。借助生物信息学软件signalp4.1分析pnphbp1编码的蛋白序列，检测其是否具有n端信号肽。结果显示在pnphbp1中没有检测到信号肽的存在，表明pnphbp1是一种非分泌蛋白。
实施例2：植物超表达载体构建
采用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒（上海生工）提取插入pnphbp1的大肠杆菌质粒pmd-18t-pnphbp1以及植物表达载体pcambia2300s的质粒，取1μl用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶psti（takara）和ecori（takara）分别对质粒pmd-18t-pnphbp1和pcambia2300s进行双酶切（100μl体系），反应体系和操作过程为：取20μlpmd-18t-pnphbp1和pcambia2300s质粒、依次加入10μl10×kbuffer、4μlpsti、6μlecori、60μlddh2o，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对pnphbp1片段和pcambia2300s载体大片段分别进行胶回收；取1μl回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。
利用t4dnaligase（takara），将回收的pnphbp1dna片段和pcambia2300s载体片段连接起来，反应体系（20μl）和操作过程为：取10μlpnphbp1dna片段依次加入2μlpcambia2300s载体dna、2μl10×t4dnaligasebuffer、1μlt4dnaligase、5μlddh2o，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中，用含有50mg/l卡那霉素（kanamycin，km）的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增pnphbp1的特异引物进行pcr，挑选出pnphbp1与pcambia2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于-80℃保存备用。
提取并纯化上述大肠杆菌中的pcambia2300s-pnphbp1质粒，随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pcambia2300s-pnphbp1转入根癌农杆菌lba4404感受态细胞中。操作步骤为：取2μgpcambia2300s-pnphbp1质粒加入含有200μl感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800μllb液体培养基于28℃振荡培养4h。将活化后的农杆菌涂于含有50mg/lkm的lb固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增pnphbp1的特异性引物进行pcr，检测pcambia2300s-pnphbp1是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。
实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选
本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1%的hgcl2浸泡8min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2ms培养基上，28℃暗培养6d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16h/d光照），以后每月用1/2ms培养基继代一次。
从-80℃冰箱中取出保存的含有pcambia2300s-pnphbp1质粒的农杆菌lba4404菌种，接种于5ml含有50mg/lkm和20mg/l利福平的lb液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1ml浑浊的菌液至含有50mg/lkm的lb固体培养基上，28℃培养48h；随后将lb固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20mg/l的乙酰丁香酮的mgl液体培养基中，28℃振荡培养2-3h以活化农杆菌。
取烟草无菌苗叶子切成1cm2左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的mgl液体培养基中，浸染时间为15min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为ms+0.02mg/l6-ba+2.1mg/lnaa+30g/lsucrose+6g/l琼脂，22℃无光条件下共培养2天。
将共培养后的叶盘转到加有抗生素的ms筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g/lsucrose+6g/l琼脂+50mg/lkm+200mg/l头孢霉素（cefotaximesodiumsalt，cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16h/d光照，8h/d黑暗），待烟草长出芽后用含有50mg/lkm和200mg/lcef的ms培养基继代培养，因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选，将烟草再生苗移至含有50mg/lkm的ms培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗做进一步的检测。
采用ctab法提取转基因烟草植株叶片的基因组dna，将提取的基因组dna取1μl通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组dna为模板用扩增pnphbp1的特异引物进行pcr，pcr结束后，取8μl产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，pnphbp1转基因烟草共筛选到53株阳性转基因植株。
实施例4：转基因烟草中pnphbp1的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析
取阳性转基因单株以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总rna，逆转录生成cdna第一链，并以此为模板用扩增pnphbp1的特异引物进行pcr，根据pcr结果分析各转基因单株中pnphbp1转录水平的表达，总rna提取以及rt-pcr的方法与实施例1中相同，pcr结束之后，取5μl用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到36个转基因单株中pnphbp1在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～36。
将实验室保存的几种真菌接种于pda固体培养基（200g/l马铃薯，15g/l琼脂，20g/l葡萄糖）上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作，首先取1g转基因烟草单株（编号分别为7、12、28、35）及野生型叶片放入研钵中，加入1ml蛋白提取液（1mnacl，0.1m乙酸钠，1%pvp，ph6），充分研磨；转入1.5ml离心管中，混匀后4℃静置过夜，4℃离心30min（12,000g/min），取上清于新的1.5ml离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.5μg/μl，然后分别取20μl滴于各真菌培养基的无菌滤纸上，在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照（提取蛋白所用的溶液），28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价pnphbp1转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，pnphbp1转基因烟草蛋白对灰葡萄孢、茄腐镰刀菌、胶孢炭疽菌的生长具有很强的抑制作用。
序列表
<110>昆明理工大学
<120>一种三七植物激素结合蛋白基因pnphbp1及应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>623
<212>dna
<213>三七(panaxnotoginseng)
<400>1
agtaaatgtacctgaacttgtactactaattatctttagggattgcatcaagaggtatga60
caaaagaactaaaaacccaaacaaaggttagtgttgggattgaagtcttgtggggggctc120
tagctaaggatataaacattgtgcttccaagaattattccaaatttggttaaagatgcag180
aagtgcttgaaggacatggcggccttggtactgtttttctcttcaagtttggctctgatg240
tatcaacatttggggatcagaaggaaaagattgtcgaacttgatgagtccctgcatctaa300
ttgggcttcaagtaatagaaggcggtcatctgaatcatggctttacttcatacaaaacgg360
tttttcaactaacagcaataacagagttggagacactagttgatatgaaggtggtgtatg420
agattgaagcagaagaaactcatatgccagtggagactacaaagtccgcacttgctttta480
taaaatgtgtagaaacatatctgttaaacaaaggatcctagacgaatcttgtctaaattc540
attcctgaatttaggttctcacagtcctttgctgtgatcaaattcatttttcaaaaaaaa600
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa623
<210>2
<211>154
<212>prt
<213>三七(panaxnotoginseng)
<400>2
metthrlysgluleulysthrglnthrlysvalservalglyileglu
151015
valleutrpglyalaleualalysaspileasnilevalleuproarg
202530
ileileproasnleuvallysaspalagluvalleugluglyhisgly
354045
glyleuglythrvalpheleuphelyspheglyseraspvalserthr
505560
pheglyaspglnlysglulysilevalgluleuaspgluserleuhis
65707580
leuileglyleuglnvalilegluglyglyhisleuasnhisglyphe
859095
thrsertyrlysthrvalpheglnleuthralailethrgluleuglu
100105110
thrleuvalaspmetlysvalvaltyrgluileglualaglugluthr
115120125
hismetprovalgluthrthrlysseralaleualapheilelyscys
130135140
valgluthrtyrleuleuasnlysglyser
145150
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>3
tatctttagggattgcatcaagagg25
<210>4
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>4
acagcaaaggactgtgagaacctaa25