一株蜡样芽孢杆菌噬菌体及其应用的制作方法

文档序号:15457422发布日期:2018-09-15 01:29
本发明属于生物工程领域,具体涉及一株新的可广谱裂解蜡样芽胞杆菌的噬菌体及其在防治病原蜡样芽胞杆菌中的应用。
背景技术
::蜡样芽胞杆菌是一种广泛存在于环境中的食源性条件致病微生物(DrobniewskiFA:Bacillus-CereusandRelatedSpecies.ClinMicrobiolRev1993,6(4):324-338)。据研究报道,蜡样芽胞杆菌由于能够产生肠毒素和呕吐毒素而导致人体食物中毒,并引起腹泻和呕吐等症状(BottoneEJ:Bacilluscereus,aVolatileHumanPathogen.ClinMicrobiolRev2010,23(2):382-398)。此外,蜡样芽胞杆菌还可在其生长期产生诸如磷脂酶、蛋白酶和溶血素等其他毒素而导致多种非肠道感染的人类疾病(DrobniewskiFA:BacillucereusandRelatedSpecies.ClinMicrobiolRev1993,6(4):324-338)。由于抗生素滥用问题的存在及抗生素抗性基因的广泛传播,越来越多的耐药蜡样芽胞杆菌菌株被发现,这使得寻求抗生素之外的新的蜡样芽胞杆菌防控手段变得极为迫切(SimmR,VorosA,EkmanJVetal:BC4707IsaMajorFacilitatorSuperfamilyMultidrugResistanceTransportProteinfromBacilluscereusImplicatedinFluoroquinoloneTolerance.PlosOne2012,7(5))。由于噬菌体可特异性裂解病原微生物的性质,被认为是一种新型的抗菌物质(CooperCJ,MirzaeiMK,NilssonAS:AdaptingDrugApprovalPathwaysforBacteriophage-BasedTherapeutics.FrontMicrobiol2016,7)。相较于传统抗生素而言,噬菌体是地球上丰度最高、最多样的生命体,它可实现与宿主共进化以克服细菌的噬菌体抗性产生的问题。然而,细菌仍有10-7的概率通过形成突变株而产生对噬菌体的抗性。通过发掘更多的噬菌体,以构建“噬菌体鸡尾酒”可更有效的降低细菌产生噬菌体抗性的概率。截止到目前为止,尽管许多可裂解蜡样芽胞杆菌的噬菌体已被发现并研究(GillisA,MahillonJ:PhagesPreyingonBacillusanthracis,Bacilluscereus,andBacillusthuringiensis:Past,PresentandFuture.Viruses-Basel2014,6(7):2623-2672;KongM,RyuS:BacteriophagePBC1andItsEndolysinasanAntimicrobialAgentagainstBacilluscereus.ApplEnvironMicrob2015,81(7):2274-2283),但新的蜡样芽胞杆菌噬菌体发现的速度正在放慢,这是由于大部分新分离的噬菌体表现出与前期已分离噬菌体的高度基因组相似性(BreitbartM,RohwerF:Hereavirus,thereavirus,everywherethesamevirus.Trendsinmicrobiology2005,13(6):278-284;YuanY,GaoM,PengQ,WuD,LiuP,WuY:GenomicanalysisofaphageandprophagefromaBacillusthuringiensisstrain.JGenVirol2014,95(Pt3):751-761.)。在遗传信息上相似性较低的噬菌体可能具有更多样的感染机制;同时,利用不同遗传背景的噬菌体构建“噬菌体鸡尾酒”可更有效减少噬菌体抗性的出现,并且可拓宽噬菌体制剂的裂解谱(BaiJ,KimYT,RyuS,LeeJH:BiocontrolandRapidDetectionofFood-BornePathogensUsingBacteriophagesandEndolysins.FrontMicrobiol2016,7.)。技术实现要素:本发明着眼于上述问题,从医院污水中分离到一株新的芽胞杆菌噬菌体vB_BceM-HSE3并研究了其生物学特性和遗传学特性。该噬菌体不仅可裂解人类食源性病原菌蜡样芽胞杆菌菌株6113,还可裂解其他蜡样芽胞杆菌菌群细菌,表现出了极其广泛的裂解活性、较高的pH及温度耐受性。基因组学研究发现该噬菌体与其他已测序噬菌体未显示出任何的相似性,因此在遗传学上该株噬菌体属于一株全新的噬菌体。本发明中噬菌体vB_BceM-HSE3的全基因组序列已由发明人提交到GenBank数据库,GenBank序列号为MF418016。为了实现上述的目的,本发明的大概方案如下:利用临床分离的人类病原菌蜡样芽胞杆菌菌株6113(CCTCCM2017799,GenBank序列号NJNO00000000)作为指示菌,利用双层琼脂平板法从污水环境中分离纯化得到一株噬菌体vB_BceM-HSE3(方法参考YuanYH,PengQ,WuDD,KouZ,WuY,LiuPM,GaoMY:EffectsofActin-LikeProteinsEncodedbyTwoBacilluspumilusPhagesonUnstableLysogeny,RevealedbyGenomicAnalysis.ApplEnvironMicrob2015,81(1):339-350)。本发明的噬菌体vB_BceM-HSE3已经在中国典型培养物保藏中心保藏,地址:中国湖北武汉,武汉大学,保藏日期:2017年12月15日,保藏编号:CCTCCM2017798,分类命名为BacilluscereusphagevB_BceM-HSE3。其特征在于该噬菌体为肌尾噬菌体,电镜观察结果显示该噬菌体由一个直径118nm的正二十面体头部和一个长度171nm的尾部构成,噬菌体尾管的宽度6.5nm和尾鞘的宽度为27nm(图1)。对该噬菌体的生物学特性进行了进一步的研究,采用双层琼脂平板法测定了噬菌体vB_BceM-HSE3的裂解谱,结果显示该噬菌体可侵染包括蜡样芽胞杆菌、炭疽芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌等几个菌种的细菌菌株。该噬菌体会在蜡样芽孢杆菌6113的琼脂培养基表面形成透明的0.5mm大小的噬菌斑(图2)。同时探究了该噬菌体侵染其宿主菌蜡样芽胞杆菌6113的一步生长曲线(图3),在噬菌体感染宿主菌的初始期60min为潜伏期,而到180min后进入裂解稳定期,噬菌体的终浓度可达到1012PFU/mL,该噬菌体侵染细菌6113的释放量约为95PFU/细胞。一步生长曲线测定结果显示该噬菌体侵染宿主细菌后,可显著抑制宿主菌的生长,并且导致宿主菌浓度在150min左右发生显著下降。该噬菌体也显示出了较高的pH耐受性和温度耐受性。在低于37°C以下的不同温度处理30min后,vB_BceM-HSE3极为稳定;在50°C的条件下处理30min,该噬菌体只能保留其初始裂解活性的1.2%(图4)。当在pH范围3.0到11.0的不同缓冲液中处理该噬菌体后,该噬菌体均具有较高的裂解活性,其中在pH5.0到pH7.0之间该噬菌体的裂解活性不会发生显著的改变(图5)。为了了解噬菌体vB_BceM-HSE3的遗传背景,采用IlluminaHiseq2500测序仪对该噬菌体进行了基因组测序,测序结果显示该噬菌体基因组大小为124.002kb,GC含量为36.21%,包含144个编码序列(CDSs),编码序列的平均长度为791.01bp,两个编码序列平均间隔距离70.6bp。在该噬菌体编码的144个CDS中,共有92个CDS在NCBI的NR数据库中有同源序列(E-value£10-3)。其中,48个CDS只显示出与蜡样芽胞杆菌噬菌体phageSP-15的序列相似性,其他44个CDS显示出与其他蜡样芽胞杆菌噬菌体的相似性。除了这92个CDS外,其余52个CDS为噬菌体vB_BceM-HSE3的特异基因,这些特异基因可能赋予了噬菌体vB_BceM-HSE3某些独特的性状。在该噬菌体编码的144个基因中,共有55个CDS有预测的功能,其中18个CDS编码噬菌体结构蛋白,29个CDS编码噬菌体复制和核酸代谢相关蛋白,2个CDS编码噬菌体宿主裂解系统蛋白,其他CDS编码基因表达调控相关蛋白,这些CDS呈模块化存在于基因组中(图6)。将预测的基因与virulencefactor(VFDB)数据库进行比对,结果发现该噬菌体基因组上不存在毒力因子相关基因,这意味着在该噬菌体实际的应用中有着较高的安全性。通过将噬菌体的基因组与NCBINR数据库进行比对,结果在数据库中未发现任何与噬菌体vB_BceM-HSE3具有较高相似性的基因组序列,仅芽胞杆菌噬菌体SP-15与vB_BceM-HSE3的部分区域显示出较高的相似性。因此在分类学上,该株噬菌体vB_BceM-HSE3为一株全新的噬菌体。附图说明图1为噬菌体vB_BceM-HSE3的透射电镜显微形态观察。图2为噬菌体vB_BceM-HSE3裂解蜡样芽孢杆菌6113的噬菌斑形态。图3为噬菌体vB_BceM-HSE3的一步生长曲线。图4为噬菌体vB_BceM-HSE3的温度稳定性研究。图5为噬菌体vB_BceM-HSE3的pH稳定性研究。图6为噬菌体vB_BceM-HSE3的基因组组成。具体实施方式为了便于对本发明的进一步理解,下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则,本发明的实施方式不限于以下内容。实施例1:噬菌体分离和制备蜡样芽孢杆菌6113分离自湖北武汉梨园医院病人呕吐物,利用16srDNA对该菌进行生物学鉴定。以该菌作为噬菌体分离指示菌,取梨园医院污水样品于12,000×g离心10min,弃固体沉淀。将上清加入Luria-Bertani(LB)肉汤培养基于30°C震摇过夜以富集样品中的噬菌体。随后,混悬液于12,000×g离心10min收集上清,使用0.22-mm微孔滤膜(Millipore,Massachusetts)将上清过滤除菌。按5%的比例将滤液加入指数生长期的蜡样芽孢杆菌6113液体培养基中培养8h。接着,将上述溶液离心收集上清,再以0.22-mm微孔滤膜过滤,噬菌体存在于滤液中,收集滤液于4°C保存备用。噬菌体的分离、纯化、繁殖、裂解量测定均是通过双层琼脂覆盖法来完成的,参照YuanYH等方法(YuanYH,PengQ,WuDD,KouZ,WuY,LiuPM,GaoMY:EffectsofActin-LikeProteinsEncodedbyTwoBacilluspumilusPhagesonUnstableLysogeny,RevealedbyGenomicAnalysis.ApplEnvironMicrob2015,81(1):339-350),所纯化的噬菌体命名为BacilluscereusphagevB_BceM-HSE3。实施例2:噬菌体生物学特性研究1)噬菌体形态观察首先将纯化的噬菌体vB_BceM-HSE3悬液滴加于镀有碳膜的铜网上,接着以2%的磷钨酸钾溶液(pH7.2)进行染色,自然干燥后利用透射电镜(H-7000FA;Hitachi,Tokyo,Japan)在加速电压100kV的条件下观察(方法参考YuanYH,PengQ,WuDD,KouZ,WuY,LiuPM,GaoMY:EffectsofActin-LikeProteinsEncodedbyTwoBacilluspumilusPhagesonUnstableLysogeny,RevealedbyGenomicAnalysis.ApplEnvironMicrob2015,81(1):339-350)。噬菌体裂解谱测定用于宿主谱测定所用的菌株见表1,测试菌株包括蜡样芽胞杆菌、炭疽芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、假结核耶尔森菌、鲍曼不动杆菌,其中芽孢杆菌培养条件为条件下于LB肉汤培养基培养。宿主谱的测定方法采用改良的双层琼脂覆盖法(方法参考KongM,RyuS:BacteriophagePBC1andItsEndolysinasanAntimicrobialAgentagainstBacilluscereus.ApplEnvironMicrob2015,81(7):2274-2283)。方法如下:指数生长期的测试菌株加入45°C的LB半固体培养基混匀,迅速倾倒平板,稍干后,将108PFU/mL浓度的纯化噬菌体vB_BceM-HSE3点接于平板上,在30°C培养过夜,观察其噬菌斑的形成情况。噬菌体生长曲线测定噬菌体vB_BceM-HSE3以1.0的感染复数(MOI)加入指数生长期的蜡样芽孢杆菌6113(OD600=0.8)中吸附5min。吸附完毕后于10,000×g离心1min除去未吸附的噬菌体。所得沉淀重悬于50mLLB肉汤培养基并继续培养,每隔30min取样检测噬菌体滴度。记录单独细菌培养物和加入噬菌体后的细菌培养物的生长曲线。检测噬菌体的释放量,方法参照CatalaoMJ等描述的方法(CatalaoMJ,GilF,Moniz-PereiraJ,PimentelM:ThemycobacteriophageMs6encodesachaperone-likeproteininvolvedintheendolysindeliverytothepeptidoglycan.MolMicrobiol2010,77(3):672-686),所有实验均重复三次。噬菌体稳定性测定噬菌体稳定性测定实验包括温度稳定性和pH稳定性。噬菌体悬液分别在4°C、28°C、37°C、50°C、60°C和70°C不同温度下处理30min,随后缓慢冷却,检测每份样品噬菌体的滴度,计算不同温度处理下其存活率。将噬菌体悬液分别加入不同pH条件的缓冲液于4°C处理30min,包括pH1缓冲液(50mMNa2HPO4-Cl,300mMNaCl,10%甘油)、pH3缓冲液(50mMNa2HPO4-Citricacid,300mMNaCl,10%甘油)、pH5缓冲液(50mMNa2HPO4-Citricacid,300mMNaCl,10%甘油)、pH7缓冲液(50mMTris-Cl,300mMNaCl,10%甘油)、pH9缓冲液(50mMTris-Cl,300mMNaCl,10%甘油)、pH11缓冲液(50mMNa2CO3-NaHCO3,300mMNaCl,10%甘油),处理完毕后,立即检测每份样品噬菌体的滴度,计算不同酸碱条件处理下其存活率。噬菌体存活率(viability)的计算方法为处理后存活的噬菌体数与原始噬菌体计数的比值,每组实验重复三次。实施例3:噬菌体基因组的抽提、纯化及测序提取上述制备噬菌体vB_BceM-HSE3的DNA,方法参照Santos等的提取方法并加以改进(YuanYH,PengQ,WuDD,KouZ,WuY,LiuPM,GaoMY:EffectsofActin-LikeProteinsEncodedbyTwoBacilluspumilusPhagesonUnstableLysogeny,RevealedbyGenomicAnalysis.ApplEnvironMicrob2015,81(1):339-350)。方法如下:每毫升噬菌体悬液分别加入DNase(终浓度6units/ml)和RNase(终浓度20µg/ml)于37°C处理30min,接着向处理后的噬菌体悬液加入20µlZnCl2溶液(终浓度2M)于37°C孵育5min。随后将上述处理液于10,000×g离心1min,除去上清,将沉淀重悬于500µlTES缓冲液(0.1MTris/HCl,pH8.0;0.1MEDTA;0.3%SDS)中并于60°C孵育15min。然后,向上述溶液中加入20µl蛋白酶K(20mg/ml)并于37°C处理90min,而后加入60µl醋酸钾溶液(3M,pH5.2),混匀后冰浴15min。向上述混悬液加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1,v/v/v)抽提两次,再以氯仿/异戊醇(24:1,v/v)抽提1次,吸取水相并加入等体积的异戊醇混匀,离心得沉淀,将沉淀用70%乙醇洗涤两次后溶解于10µl的无菌水中,完成噬菌体vB_BceM-HSE3基因组DNA样品的抽提,抽提所得DNA经采用Qubit2.0和0.8%琼脂糖凝胶电泳进行质检。质检合格的DNA可进行后续测序实验。首先,对基因组DNA进行片段化,末端修复、3’末端加A、连接接头、富集等步骤,完成测序样本文库构建。所建文库使用Qubit®2.0Fluorometer检测浓度,Agilent2100检测文库的大小。按照cBotUserGuide所示相应流程,在IlluminaHiSeq测序仪配套的cBot上完成Cluster生成和第一向测序引物杂交。按照IlluminaUserGuide准备测序试剂,将携有cluster的flowcell上机。选用paired-end程序,进行双端测序。测序过程由Illumina提供的datacollectionsoftware进行控制,并进行实时数据分析。噬菌体基因组分析所得测序数据除去总体质量较低、含有接头序列、末端质量偏低等不合格的Reads,利用Veletv1.2.07拼接软件对预处理后的Illumina数据拼接,并使用primewalking设计引物补齐序列缺口得到完整序列。运用GeneMarks软件对完整序列进行基因预测(BesemerJ,LomsadzeA,BorodovskyM:GeneMarkS:aself-trainingmethodforpredictionofgenestartsinmicrobialgenomes.Implicationsforfindingsequencemotifsinregulatoryregions.NucleicAcidsRes2001,29(12):2607-2618),将预测的基因的蛋白序列分别与non-redundant(NR)和CDD数据库进行Blastp比对(BLAST2.2.28+)(Marchler-BauerA,PanchenkoAR,ShoemakerBA,ThiessenPA,GeerLY,BryantSH:CDD:adatabaseofconserveddomainalignmentswithlinkstodomainthree-dimensionalstructure.NucleicAcidsRes2002,30(1):281-283.),使用HHpred(SodingJ:ProteinhomologydetectionbyHMM-HMMcomparison.Bioinformatics2005,21(7):951-960)和Pfam(PuntaM,CoggillPC,EberhardtRY,MistryJ,TateJ,BoursnellC,PangN,ForslundK,CericG,ClementsJetal:ThePfamproteinfamiliesdatabase.NucleicAcidsRes2012,40(D1):D290-D301)软件进行蛋白质的功能域和结构组成的分析。采用CGview软件将噬菌体vB_BceM-HSE3的基因注释结果进行可视化作图分析。通过Gepard软件将该噬菌体与其相似性最高的噬菌体分别进行基因组和蛋白组点杂交比对研究。表1噬菌体vB_BceM-HSE3的裂解谱aATCC,AmericanTypeCultureCollection;BGSC,BacillusGeneticStoreCenter。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3 
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