本发明属于动物细胞工程
技术领域：
，具体涉及一种用于海洋软体动物体外细胞培养的培养基及其制备方法。本发明的培养基可用于海洋软体动物体外原代或继代细胞培养，应用于软体动物如贝类的生理和病理研究，以及病毒的分离、鉴定和增殖，对于贝类疾病的防治具有重要作用。
背景技术：
：动物细胞原代培养是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。分为肿瘤细胞原代培养与非肿瘤细胞原代培养(包括已分化的普通细胞培养和未分化的干细胞培养)。原代培养获取的细胞具有二倍体遗传性，接近和反映体内生长特性，可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，适用于药物敏感性试验、细胞分化、基因功能和调控机制等研究等方面提供指导，因此原代细胞培养作为一种研究手段在生命科学领域获得了广泛的应用。按照培养对象的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。在动物细胞培养过程中需要根据离体细胞的特点，需要提供适宜的温度、co2分压、ph、渗透压和营养条件以使其生长、繁殖。哺乳动物细胞培养的温度控制在37℃，鱼类的温度控制约在26℃。温度过高或过低时，均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。动物细胞最适宜ph一般控制在7.2～7.4，在此范围细胞生长活跃，增殖速度快，如果过低或过高性，细胞会因为细胞膜受损而死亡。细胞培养液中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质。能够提供细胞生长所需的能量物质(n源、c源)、代谢调节控制的物质(无机盐、维生素、激素)，以及所需要的ph和渗透压环境。因此细胞培养液的设计一直是细胞离体培养技术的关键，理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的ph、渗透压、营养物质、调节物质的全部需要。哺乳动物细胞培养开始于20世纪初，经过长期的发展，市场上目前已有多种不同的培养基，如：rpmi-1640、dmem、mem、m199、f-10、f-12k、tc2100和tc1992mk等适合于不同种类哺乳动物细胞培养和昆虫细胞体外培养。培养基的正确选择是提高细胞原代培养成功率的关键，m199、rpmi1640与dmem是细胞培养中常用的培养基，dmem培养基又分为高糖和低糖等品种，无糖、含有丙酮酸钠和不含丙酮酸钠等多种。现在市场上也有用添加细胞因子不用添加血清的培养基，以及培养干细胞专用的培养基等多种。如高糖培养基适合代谢比较旺盛，分裂速度快的细胞，含有丙酮酸钠的培养基具有促进细胞贴壁的效果，适合于细胞贴壁比较差的细胞。含有pipes的培养基适合对ph比较敏感的细胞。研究表明，大肠癌细胞原代培养中用rpmi1640培养基优于dmem培养基。mcdb/m199培养基与dmem培养基相比，mcdb/m199有利于维持原代上皮性卵巢肿瘤细胞形态并减缓纤维化，并且mcdb/m199不适于血液系统等细胞生长，利于上皮性卵巢肿瘤细胞培养过程中的纯化。rpmi1640比dmem更适合人牙周韧带细胞、成纤维样细胞的生长，而dmem则适合上皮样细胞的生长。因此，培养基的选择应该根据细胞的代谢、种类和文献报道等进行综合考虑，最终应该根据细胞的生长效果进行选择。海洋软体动物细胞体外培养成功的关键是培养基能够提供细胞生长的最适环境，包括营养、渗透压、ph和调节物质的需要，使海洋软体动物细胞在体外能够生长和繁殖。海洋软体动物生活在海水中，长期的进化使其细胞渗透压与生长环境海水的渗透压相适应。海洋软体动物体外细胞生长的最适温度显著低于哺乳动物细胞，对营养供给的需求也低于哺乳动物细胞。目前市场上的培养基是根据陆生哺乳动物细胞的培养需求研制的，其渗透压低于海洋软体动物细胞生长的最适渗透压，导致海洋软体动物细胞不容易存活和增殖，使体外细胞培养难以为继。为了进行海洋软体动物细胞的体外培养，许多研究者进行了大量的探索性研究。由于海洋软体动物的细胞培养是模仿哺乳动物的培养流程，培养基也是在哺乳动物细胞培养基的基础上进行改动。细胞的体外培养，需要在合成培养基中补充一定量的成分不明确的生物性液体或组织提取液才能支持细胞的生长增殖，其中血清因来源丰富且易于保存而成为被最广泛采用的培养基添加物，血清的主要作用在于给细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，最常用的为小牛血清。目前有报道在海洋软体动物贝类的细胞的培养基中还需要加入自制的贝类或鱼类血清，例如公开号为cn105602887a的中国专利申请，公开的一种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养基，需要在基础培养基中加入栉孔扇贝卵黄提取液和栉孔扇贝血清。由于自制的鱼类或贝类血清存在着诸如：分离纯化困难，批次与批次之间血清存在着质量的差异，会影响细胞生长，最终影响产品质量，易被支原体和杂质污染，来源有限导致鱼类或贝类血清非常昂贵等缺点，由于自制血清的应用存在上述问题，开发研制不含有鱼类或贝类血清培养基是现有技术中亟待解决的技术问题。海洋软体动物细胞生长对培养基的营养和渗透压需求是不同于哺乳动物细胞的，目前尚未见到一种针对海洋软体动物细胞体外培养的通用培养基，能够适用于大多数海洋软体动物细胞的体外培养。因此研制适合于海洋软体动物细胞生长的渗透压、营养成分和ph的培养基是进行海洋软体动物细胞体外成功的关键。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明公开了一种培养海洋软体动物细胞系的通用培养基，所述培养基包括以下组分：哺乳细胞基础培养基；无机盐；胎牛血清；复合抗生素；ph调节剂。本发明提供的培养基：其一，解决了目前哺乳细胞培养基的渗透压不适合海洋软体动物细胞培养的问题，并优化了无机盐的种类，使培养基中不同盐离子浓度适合于海洋软体动物细胞生长的需要；其二，简化了培养基的组成，使其不需要添加鱼类或贝类自制血清就能够满足海洋软体动物细胞的生长；其三，该培养基临用前添加复合抗生素溶液，具有广泛的抗菌谱，可以预防细胞培养过程中微生物的污染(细菌和霉菌)。优选的，所述哺乳动物培养基选自rpmi-1640、dmem、m199、f-10、f-12，优选为dmem。优选的，所述无机盐为nacl、kcl，mgcl2·6h2o、mgso4·7h2o和cacl2·2h2o；优选的，基于细胞生长对渗透压的需求和在生理条件下对不同离子具有一定耐受性的原理，在保持与软体动物细胞膜到张的条件下，在所述混合无机盐中进一步添加mgcl2·6h2o，mgso4·7h2o，cacl2·2h2o，na2edta，fecl3·6h2o，h3bo3，mncl2·4h2o，zncl2，cocl2·6h2o，nabr，srcl2，rbcl，licl，na2moo4，ki中的一种或几种的混合；或者添加mgcl2·6h2o，mgso4·7h2o，cacl2·2h2o，na2edta，fecl3·6h2o，h3bo3，mncl2·4h2o，zncl2，cocl2·6h2o，nabr，srcl2，rbcl，licl，na2moo4，ki中的一种或几种的混合对所述混合无机盐进行替换，但该替换不包括对nacl的替换。优选的，所述复合抗生素为青霉素和硫酸链霉素，或者还可以在所述的青霉素和硫酸链霉素复合抗生素中进一步添加两性霉素b和硫酸庆大霉素中的一种或两种的混合。优选的，所述ph调节剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)。优选的，所述培养基中各组分配比：进一步优选，所述培养基中各组分配比：进一步优选，所述培养基中各组分配比：利用2mol/lnaoh溶液调节ph7.4。另一方面本发明提供了一种培养海洋软体动物细胞的培养基制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)制备抗生素的贮备液，过滤除菌，低温保存。所述贮备液包括组分硫酸链霉素和青霉素，或进一步的包括硫酸庆大霉素和/或两性霉素b混合液，(2)哺乳动物细胞液体培养基，在搅拌的条件下，加入无机盐，溶解后再加入ph调节剂，然后在无菌条件下进行过滤除菌，滤液备用；或哺乳动物细胞干粉培养基加规定量体积80％的无菌注射用水溶解后，分别加入各种无机盐搅拌溶解，再加入ph调节剂，添加无菌注射用水至规定量，然后在无菌条件下进行过滤除菌，滤液备用。(3)在步骤(2)所述的滤液中加入规定量的胎牛血清得到培养液。(4)从低温环境中取出步骤(1)制备的抗生素贮备液，室温放置，融化后与步骤(3)得到的培养液混匀后，即得到所述的培养海洋软体动物细胞的培养基。其中步骤(2)中，所述哺乳动物细胞(液体或干粉)培养基成分在已配置的培养海洋软体动物细胞培养基中的含量变化为50％-100％。优选的，步骤(1)中，所述低温保存温度为-20℃。优选的，各抗生素配比：优选的，所述方法包括以下步骤：(1)分别制备抗生素的贮备液a、贮备液b和贮备液c，过滤除菌，低温保存。所述贮备液a包括组分硫酸链霉素、青霉素和硫酸庆大霉素；所述贮备液b包括组分两性霉素b；所述贮备液c包括组分硫酸链霉素、青霉素和硫酸庆大霉素和两性霉素b。(2)哺乳动物细胞液体培养基，在搅拌的条件下，分别加入各种无机盐溶解后再加入ph调节剂，然后在无菌条件下进行过滤除菌，滤液备用；或哺乳动物细胞干粉培养基加规定量体积80％的无菌注射用水溶解后，分别加入各种无机盐搅拌溶解，再加入ph调节剂，添加无菌注射用水至规定量，然后在无菌条件下进行过滤除菌，滤液备用。(3)在步骤(2)所述的滤液中加入规定量的胎牛血清得到培养液。(4)从低温环境中取出步骤(1)制备的抗生素贮备液a、贮备液b或贮备液c，室温放置，融化后与步骤(3)得到的培养液混匀后，即得到所述的培养海洋软体动物细胞的培养基。其中步骤(2)中，所述哺乳动物细胞(液体或干粉)培养基成分在已配置的培养海洋软体动物细胞培养基中的含量变化为20％-100％。所述步骤(2)、(3)和(4)操作在超净台内完成。所述步骤(4)每500毫升培养液里分别加入5毫升抗生素贮备液a(100倍稀释)和贮备液b(1000倍稀释)、或贮备液c(100倍稀释)。优选的，步骤(1)中两性霉素b利用二甲基亚砜溶解，制备1000x的贮备液，-20℃冰箱保存。优选的，各抗生素配比：优选的，步骤(1)中两性霉素b利用去氧胆酸钠增溶，在加入硫酸链霉素、青霉素和硫酸庆大霉素溶解后制备100x的贮备液，过滤除菌后分装，低温保存。进一步优选的，步骤(1)中，青霉素的含量为10ku/ml、硫酸链霉素的含量为10mg/ml、硫酸庆大霉素的含量为8mg/ml、两性霉素b的含量为0.25mg/ml(去氧胆酸钠增溶)，按照100倍稀释即可使用。在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100u/ml，硫酸链霉素的工作浓度为0.1mg/ml，硫酸庆大霉素的工作浓度为80μg/ml、两性霉素b的工作浓度为0.2μg/ml-2.5μg/ml。所述青霉素、硫酸链霉素和硫酸庆大霉素用于预防细胞培养的细菌污染，特别是革兰氏阳性和阴性细菌的污染；所述两性霉素b主要用于预防细胞培养的霉菌污染。上述产品经过滤除菌处理，可以直接添加到细胞培养液内。所述低温保存温度优选为-20℃保存。步骤(2)中，所述的哺乳动物细胞液体培养基均可以是商品化的。所述步骤(4)操作在超净台内完成。所述步骤(4)每500毫升培养液里分别加入5毫升抗生素贮备液(100倍稀释)。所述培养基可以对海洋软体动物进行细胞原代培养和继代培养，本发明培养基可有效地提高细胞的存活，可使细胞持续增殖，并且该方法对其它海洋动物细胞系的建立具有指导意义，有广泛的应用价值。附图说明图1为本发明实施例3培养的青蚶组织细胞第17天的显微镜照片；图2为本发明实施例4培养的青蚶组织细胞第17天的显微镜照片；图3为本发明实施例5培养的青蚶组织细胞第33天的显微镜照片；图4为本发明实施例6培养的泥蚶组织细胞第6天的显微镜照片；图5为本发明实施例7培养的泥蚶组织细胞第17天的显微镜照片；图6为本发明实施例8培养的泥蚶组织细胞第33天的显微镜照片；图7为本发明对比例1培养的泥蚶组织细胞第6天的显微镜照片；图8为本发明对比例2青蚶腹足组织体外培养细胞第6天的显微镜照片；图9为本发明对比例3青蚶腹足组织体外培养细胞第6天的显微镜照片；图10为本发明对比例4青蚶腹足组织体外培养细胞第17天的显微镜照片。具体实施方式为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体的实施方式对本发明的内容做进一步的说明，但是具体的实施方式并不是对本
发明内容的限制。实施例1：抗生素贮备液的制备抗生素贮备液配比表抗生素青霉素硫酸链霉素硫酸庆大霉素两性霉素b终浓度100u/ml100μg/m80μg/ml2.5μg/ml1贮备液a制备精密称取100000u青霉素、0.1g硫酸链霉素和0.08g硫酸庆大霉素加pbs缓冲液10ml，制备100x的贮备液，0.22um的无菌微孔滤膜过滤除菌后分装，-20℃避光冷冻保存。2贮备液b制备精密称取规定量两性霉素b25mg，加10ml二甲基亚砜溶解，制备1000x的贮备液，分装后-20℃避光冷冻保存。3贮备液c制备精密称取两性霉素b25mg，加去氧胆酸钠20.5mg，加灭菌注射用水10ml，用0.1mol/l氢氧化钠溶液2.0ml滴加至溶解(ph值约11.5)，再加0.1mol/l盐酸溶液1.8ml(氢氧化钠用量的90％)为溶液1。称取1000000u青霉素、1g硫酸链霉素和0.8g硫酸庆大霉素加pbs缓冲液80ml溶解为溶液2。将溶液1与溶液2进行混合后用pbs缓冲液定容到100ml，用0.22um的无菌微孔滤膜过滤除菌，然后5ml分装西林瓶中，-20℃避光冷冻保存。上述抗生素贮备液为100倍储备液，临用前用培养基或相应缓冲液稀释。实施例2：海洋软体动物消毒缓冲液的配制1按照下表精密称取药品，加无菌蒸馏水搅拌溶解后备用。海洋软体动物消毒缓冲液配比表药品naclna2so4hepes终浓度25.5g/l0.8g/l2.86g/l2临用前加抗生素贮备液后冰浴备用。实施例3：青蚶腹足组织细胞体外原代培养1将dmem干粉培养基加入规定量的无菌双蒸水进行溶解，或直接用液体dmem培养基按照下表配制海洋软体动物细胞培养基。培养基配比表药品naclkclmgcl2.6h2omg2so4.7h20hepescacl2.2h2o终浓度18.05g/l0.29g/l5.48g/l4.28g/l2.86g/l1.2g/l抗生素青霉素硫酸链霉素硫酸庆大霉素两性霉素b血清ph终浓度100u/ml100μg/ml80μg/ml2.5μg/ml15％7.4分别称量上述各种药品于dmem培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，最后加入血清。2取2龄的青蚶若干个，用粗毛刷刷洗青蚶外表面，在添加有抗生素(青霉素200u/ml+200ug/ml硫酸链霉素)的过滤海水中暂养24h用于减少青蚶自身携带的细菌数量。3按照实施例1配制消毒缓冲液，在加入规定量的抗生素贮备液混合均匀后冰浴备用。4实验时将青蚶体表用70％酒精棉擦拭干净，打开壳，用灭菌海水(生理盐水)冲洗青蚶组织，置于无菌操作台上。5用解剖器具剪取腹足组织，置于冰浴无菌培养皿中用无菌脱脂棉球沾取70％乙醇溶液对腹足进行擦拭消毒，以擦去粘性液体。6投入包含10ml预冷消毒液的培养皿中在冰浴条件下进行消毒，20min后更换消毒液，期间缓慢摇晃培养皿，重复消毒3次。7除去消毒液，用未加血清的含复合抗生素的培养基溶液冲洗10次，无菌眼科剪把组织块剪成1mm3小块后，用无菌巴氏吸管将组织块转移到用血清表面预处理的24孔培养板中，密度6-10块/孔。在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养4-14h(根据细胞贴壁情况决定)后,正置每孔加入1ml培养基,恒温静置培养6d、12d后观察细胞生长状况。6、17d显微镜下拍照，实验结果见图1。实施例4：青蚶腹足组织细胞体外原代培养1将dmem干粉培养基加入规定量的无菌双蒸水进行溶解，或直接用液体dmem培养基按照下表配制海洋软体动物细胞培养基。培养基配比表药品naclkclmgcl2.6h2omg2so4.7h20hepescacl2.2h2o终浓度9.025g/l0.145g/l2.74g/l2.14g/l2.86g/l0.6g/l抗生素青霉素硫酸链霉素硫酸庆大霉素两性霉素b血清ph终浓度100u/ml100μg/ml80μg/ml2.5μg/ml15％7.4分别称量上述各种药品于dmem培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，最后加入血清。2取2龄的青蚶若干个，用粗毛刷刷洗青蚶外表面，在添加有抗生素(青霉素200u/ml+200ug/ml硫酸链霉素)的过滤海水中暂养24h用于减少青蚶自身携带的细菌数量。3按照实施例1配制消毒缓冲液，在加入规定量的抗生素贮备液混合均匀后冰浴备用。4实验时将青蚶体表用70％酒精棉擦拭干净，打开壳，用灭菌海水(生理盐水)冲洗青蚶组织，置于无菌操作台上。5用解剖器具剪取腹足组织，置于冰浴无菌培养皿中用无菌脱脂棉球沾取70％乙醇溶液对腹足进行擦拭消毒，以擦去粘性液体。6投入包含10ml预冷消毒液的培养皿中在冰浴条件下进行消毒，20min后更换消毒液，期间缓慢摇晃培养皿，重复消毒3次。7除去消毒液，用未加血清的含复合抗生素的培养基溶液冲洗10次，无菌眼科剪把组织块剪成1mm3小块后，用无菌巴氏吸管将组织块转移到用血清表面预处理的24孔培养板中，密度6-10块/孔。在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养4-14h(根据细胞贴壁情况决定)后,正置每孔加入1ml培养基，恒温静置培养6d、12d后观察细胞生长状况。817d显微镜下拍照，实验结果见图2。实施例5：青蚶腹足组织细胞体外原代培养1将dmem液体培养基加等体积无菌双蒸水进行稀释，或将干粉培养基加入规定量2倍的无菌双蒸水进行溶解备用，按照下表配制软体动物细胞培养基。培养基配比表药品naclkclmgcl2.6h2omg2so4.7h20hepescacl2.2h2o终浓度18.05g/l0.29g/l5.48g/l4.28g/l2.86g/l1.2g/l抗生素青霉素硫酸链霉素硫酸庆大霉素两性霉素b血清ph终浓度100u/ml100μg/ml80μg/ml2.5μg/ml15％7.4分别称量上述各种药品加入上述dmem培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，最后加入规定量血清。2取2龄的青蚶若干个，用粗毛刷刷洗青蚶外表面，在添加有抗生素(青霉素200u/ml+200ug/ml硫酸链霉素)的过滤海水中暂养24h用于减少青蚶自身携带的细菌数量。3按照实施例1配制消毒缓冲液，在加入规定量的抗生素贮备液混合均匀后冰浴备用。4实验时将青蚶体表用70％酒精棉擦拭干净，打开壳，用灭菌海水(生理盐水)冲洗青蚶组织，置于无菌操作台上。5用解剖器具剪取腹足组织，置于冰浴无菌培养皿中用无菌脱脂棉球沾取70％乙醇溶液对腹足进行擦拭消毒，以擦去粘性液体。6投入包含10ml预冷消毒液的培养皿中在冰浴条件下进行消毒，20min后更换消毒液，期间缓慢摇晃培养皿，重复消毒3次。7除去消毒液，用未加血清的含复合抗生素的培养基溶液冲洗10次，无菌眼科剪把组织块剪成1mm3小块后，用无菌巴氏吸管将组织块转移到用血清表面预处理的24孔培养板中，密度6-10块/孔。在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养4-14h(根据细胞贴壁情况决定)后,正置每孔加入1ml培养基,恒温静置培养6d、12d后观察细胞生长状况。8图3为生长33d显微镜拍照照片。实施例6：泥蚶腹足组织细胞体外原代培养1将rpmi-1640干粉培养基加入规定量的无菌双蒸水进行溶解，或直接用液体rpmi-1640培养基按照下表配制海洋软体动物细胞培养基。培养基配比表药品naclkclmgcl2.6h2omg2so4.7h20hepescacl2.2h2o终浓度18.05g/l0.29g/l5.48g/l4.28g/l2.86g/l1.2g/l抗生素青霉素硫酸链霉素硫酸庆大霉素两性霉素b血清ph终浓度100u/ml100μg/ml80μg/ml2.5μg/ml15％7.4分别称量上述各种药品于rpmi-1640培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，最后加入血清。2取3龄的泥蚶若干个，用粗毛刷刷洗青蚶外表面，在添加有抗生素(青霉素200u/ml+200ug/ml硫酸链霉素)的过滤海水中暂养24h用于减少青蚶自身携带的细菌数量。3按照实施例1配制消毒缓冲液，在加入规定量的抗生素贮备液混合均匀后冰浴备用。4实验时将泥蚶体表用70％酒精棉擦拭干净，打开壳，用灭菌海水(生理盐水)冲洗青蚶组织，置于无菌操作台上。5用解剖器具剪取腹足组织，置于冰浴无菌培养皿中用无菌脱脂棉球沾取70％乙醇溶液对腹足进行擦拭消毒，以擦去粘性液体。6投入包含10ml预冷消毒液的培养皿中在冰浴条件下进行消毒，20min后更换消毒液，期间缓慢摇晃培养皿，重复消毒3次。7除去消毒液，用未加血清的含复合抗生素的培养基溶液冲洗10次，无菌眼科剪把组织块剪成1mm3小块后，用无菌巴氏吸管将组织块转移到用血清表面预处理的24孔培养板中，密度6-10块/孔。在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养4-14h(根据细胞贴壁情况决定)后,正置每孔加入1ml培养基,恒温静置培养6d、12d后观察细胞生长状况。86d后显微镜下拍照，实验结果见图4。实施例7：泥蚶腹足组织细胞体外原代培养1将rpmi-1640干粉培养基加入规定量的无菌双蒸水进行溶解，或直接用液体rpmi-1640培养基按照下表配制海洋软体动物细胞培养。培养基配比表药品naclkclmgcl2.6h2omg2so4.7h20hepescacl2.2h2o终浓度9.025g/l0.145g/l2.74g/l2.14g/l2.86g/l0.6g/l抗生素青霉素硫酸链霉素硫酸庆大霉素两性霉素b血清ph终浓度100u/ml100μg/ml80μg/ml2.5μg/ml15％7.4分别称量上述各种药品于rpmi-1640培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，最后加入血清。2取3龄的泥蚶若干个，用粗毛刷刷洗青蚶外表面，在添加有抗生素(青霉素200u/ml+200ug/ml硫酸链霉素)的过滤海水中暂养24h用于减少青蚶自身携带的细菌数量。3按照实施例1配制消毒缓冲液，在加入规定量的抗生素贮备液混合均匀后冰浴备用。4实验时将泥蚶体表用70％酒精棉擦拭干净，打开壳，用灭菌海水(生理盐水)冲洗青蚶组织，置于无菌操作台上。5用解剖器具剪取腹足组织，置于冰浴无菌培养皿中用无菌脱脂棉球沾取70％乙醇溶液对腹足进行擦拭消毒，以擦去粘性液体。6投入包含10ml预冷消毒液的培养皿中在冰浴条件下进行消毒，20min后更换消毒液，期间缓慢摇晃培养皿，重复消毒3次。7除去消毒液，用未加血清的含复合抗生素的培养基溶液冲洗10次，无菌眼科剪把组织块剪成1mm3小块后，用无菌巴氏吸管将组织块转移到用血清表面预处理的24孔培养板中，密度6-10块/孔。在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养4-14h(根据细胞贴壁情况决定)后,正置每孔加入1ml培养基,恒温静置培养6d、12d后观察细胞生长状况。817d显微镜拍照实验结果见图5。实施例8：泥蚶腹足组织细胞体外原代培养1将rpmi-1640液体培养基加等体积无菌双蒸水进行稀释，或将干粉培养基加入规定量2倍的无菌双蒸水进行溶解备用，按照下表配制软体动物细胞培养基。2按照下表配制软体动物细胞培养基培养基配比表药品naclkclmgcl2.6h2omg2so4.7h20hepescacl2.2h2o终浓度18.05g/l0.29g/l5.48g/l4.28g/l2.86g/l1.2g/l抗生素青霉素硫酸链霉素硫酸庆大霉素两性霉素b血清ph终浓度100u/ml100μg/ml80μg/ml2.5μg/ml15％7.4分别称量上述各种药品加入上述rpmi-1640培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，最后加入规定量血清。3取3龄的泥若干个，用粗毛刷刷洗青蚶外表面，在添加有抗生素(青霉素200u/ml+200ug/ml硫酸链霉素)的过滤海水中暂养24h用于减少青蚶自身携带的细菌数量。4按照实施例1配制消毒缓冲液，在加入规定量的抗生素贮备液混合均匀后冰浴备用。5实验时将泥蚶体表用70％酒精棉擦拭干净，打开壳，用灭菌海水(生理盐水)冲洗青蚶组织，置于无菌操作台上。6用解剖器具剪取腹足组织，置于冰浴无菌培养皿中用无菌脱脂棉球沾取70％乙醇溶液对腹足进行擦拭消毒，以擦去粘性液体。7投入包含10ml预冷消毒液的培养皿中在冰浴条件下进行消毒，20min后更换消毒液，期间缓慢摇晃培养皿，重复消毒3次。8除去消毒液，用未加血清的含复合抗生素的培养基溶液冲洗10次，无菌眼科剪把组织块剪成1mm3小块后，用无菌巴氏吸管将组织块转移到用血清表面预处理的24孔培养板中，密度6-10块/孔。在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养4-14h(根据细胞贴壁情况决定)后,正置每孔加入1ml培养基,恒温静置培养6d、12d后观察细胞生长状况。9图6为细胞生长33d后显微镜拍照照片。对比例1：泥蚶腹足组织细胞体外原代培养1按照下表配制软体动物细胞培养基培养基配比表药品nacl青霉素硫酸链霉素硫酸庆大霉素两性霉素b血清ph终浓度3.5g/l100u/ml100μg/ml80μg/ml2.5μg/ml15％7.4分别称量上述各种药品于rpmi-1640培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，最后加入血清。2取3龄的泥蚶若干个，用粗毛刷刷洗泥蚶外表面，在添加有抗生素(青霉素200u/ml，+100ug/ml硫酸链霉素)的过滤海水中暂养24h用于减少泥蚶自身携带的细菌数量。3按照实施例1配制消毒缓冲液，在加入规定量的抗生素贮备液混合均匀后冰浴备用。4实验时将泥蚶体表用70％酒精棉擦拭干净，打开壳，用灭菌海水(生理盐水)冲洗青蚶组织，置于无菌操作台上。5用解剖器具剪取腹足组织，置于冰浴无菌培养皿中用无菌脱脂棉球沾取70％乙醇溶液对腹足进行擦拭消毒，以擦去粘性液体。6投入包含10ml预冷消毒液的培养皿中在冰浴条件下进行消毒，20min后更换消毒液，期间缓慢摇晃培养皿，重复消毒3次。7除去消毒液，用未加血清的含复合抗生素的培养基溶液冲洗10次，无菌眼科剪把组织块剪成1mm3小块后，用无菌巴氏吸管将组织块转移到用血清预处理的24孔培养板中，密度6-10块/孔。在26℃的生化培养箱中倒置贴壁培养4-14h(根据细胞贴壁情况决定)后,正置每孔加入1ml培养基,恒温静置培养6d，12d后观察细胞生长状况。86d后显微镜拍照结果见图7，由于培养基渗透压和离子成分单一，泥蚶腹足组织块在体外未见正常生长。对比例2：青蚶腹足组织细胞体外原代培养1按照下表配制软体动物细胞培养基培养基配比表药品naclkclmgcl2.6h2omg2so4.7h20血清终浓度18.05g/l0.29g/l5.48g/l4.28g/l15％药品青霉素硫酸链霉素hepescacl2.2h2oph终浓度100u/ml100μg/ml2.86g/l1.2g/l7.4分别称量上述各种药品于dmem培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，最后加入血清。2取2龄的青蚶若干个，用粗毛刷刷洗青蚶外表面，在添加有抗生素(青霉素200u/ml+200ug/ml硫酸链霉素)的过滤海水中暂养24h用于减少青蚶自身携带的细菌数量。3按照实施例1配制消毒缓冲液，按照下表加入规定量的抗生素贮备液混合均匀后冰浴备用。抗生素贮备液配比表抗生素青霉素硫酸链霉素终浓度100u/ml100μg/m4实验时将青蚶体表用70％酒精棉擦拭干净，打开壳，用灭菌海水(生理盐水)冲洗青蚶组织，置于无菌操作台上。5用解剖器具剪取腹足组织，置于冰浴无菌培养皿中用无菌脱脂棉球沾取70％乙醇溶液对腹足进行擦拭消毒，以擦去粘性液体。6投入包含10ml预冷消毒液的培养皿中在冰浴条件下进行消毒，20min后更换消毒液，期间缓慢摇晃培养皿，重复消毒3次。7除去消毒液，用未加血清的含复合抗生素的培养基溶液冲洗10次，无菌眼科剪把组织块剪成1mm3小块后，用无菌巴氏吸管将组织块转移到用血清表面预处理的24孔培养板中，密度6-10块/孔。在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养4-14h(根据细胞贴壁情况决定)后,正置每孔加入1ml培养基,恒温静置培养6d、12d后观察细胞生长状况。86d后显微镜拍照实验结果见图8，青蚶腹足组织外植体在体外未见细胞正常生长，显微镜下显示发生了微生物污染。对比例3：青蚶腹足组织细胞体外原代培养1按照下表配制软体动物细胞培养基培养基配比表药品naclkclmgcl2.6h2omg2so4.7h20血清终浓度18.05g/l0.29g/l5.48g/l4.28g/l15％药品硫酸庆大霉素两性霉素bhepescacl2.2h2oph终浓度80μg/ml2.5μg/ml2.86g/l1.2g/l7.4分别称量上述各种药品于dmem培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，最后加入血清。2取2龄的青蚶若干个，用粗毛刷刷洗青蚶外表面，在添加有抗生素(青霉素200u/ml+200ug/ml硫酸链霉素)的过滤海水中暂养24h用于减少青蚶自身携带的细菌数量。3按照实施例1配制消毒缓冲液，按照下表加入规定量的抗生素贮备液混合均匀后冰浴备用。抗生素贮备液配比表抗生素硫酸庆大霉素两性霉素b终浓度80μg/ml2.5μg/ml4实验时将青蚶体表用70％酒精棉擦拭干净，打开壳，用灭菌海水(生理盐水)冲洗青蚶组织，置于无菌操作台上。5用解剖器具剪取腹足组织，置于冰浴无菌培养皿中用无菌脱脂棉球沾取70％乙醇溶液对腹足进行擦拭消毒，以擦去粘性液体。6投入包含10ml预冷消毒液的培养皿中在冰浴条件下进行消毒，20min后更换消毒液，期间缓慢摇晃培养皿，重复消毒3次。7除去消毒液，用未加血清的含复合抗生素的培养基溶液冲洗10次，无菌眼科剪把组织块剪成1mm3小块后，用无菌巴氏吸管将组织块转移到用血清表面预处理的24孔培养板中，密度6-10块/孔。在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养4-14h(根据细胞贴壁情况决定)后,正置每孔加入1ml培养基,恒温静置培养6d、12d后观察细胞生长状况。86d后显微镜拍照实验结果见图9，青蚶腹足组织外植体在体外未见细胞正常生长，显微镜下显示发生了微生物污染。对比例4：青蚶腹足组织细胞体外原代培养1参照实施例3的方法。2培养基配比如下表。培养基配比表药品naclkclmgcl2.6h2omg2so4.7h20hepescacl2.2h2o终浓度18.05g/l0.29g/l5.48g/l4.28g/l2.86g/l1.2g/l抗生素青霉素硫酸链霉素硫酸庆大霉素两性霉素b硫酸卡那霉素血清终浓度100u/ml100μg/ml80μg/ml2.5μg/ml80μg/ml15％分别称量上述各种药品于dmem培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，调节ph7.4，最后加入血清。3按照实施例1配制消毒缓冲液，按照下表加入规定量的抗生素贮备液混合均匀后冰浴备用。抗生素贮备液配比表抗生素青霉素硫酸链霉素硫酸庆大霉素两性霉素b硫酸卡那霉素终浓度100u/ml100μg/ml80μg/ml2.5μg/ml80μg/ml417d显微镜拍照实验结果见图10，由于抗生素毒性，细胞生长状态与实施例2体外培养细胞相比较差。当前第1页12