原发性胆汁性肝硬化的诊断试剂盒及相关基因在制备该试剂盒中的应用的制作方法

文档序号:15457531发布日期:2018-09-15 01:32

本发明属于疾病研究领域,具体涉及原发性胆汁性肝硬化(PBC)的诊断标志物及其试剂盒的开发。



背景技术:

原发性胆汁性肝硬化(PBC)又名原发性胆汁胆管炎,是一种慢性肝内胆汁淤积性疾病。患者肝内汇管区大量CD4+和CD8+为主自身反应性淋巴细胞浸润,导致非化脓性胆管炎,伴随外周血清中出现高滴度抗线粒体抗体(AMA)、胆汁淤积相关的生化指标升高,并有外周血淋巴细胞亚群和多种细胞因子的变化,因而免疫系统异常在PBC发病中具有重要作用,但其机制尚不完全清楚。我国报道的PBC病例数呈不断上升趋势,但尚缺乏系统的流行病学调查。上海、广州及贵州学者在当地健康体检人群中通过筛查AMA的M2亚型(AMA—M2)及进一步检查,推算出PBC在人群中的患病率为49.2/10万~99.78/10万。这些报道提示,我国PBC的患病率并不低于国外,需要引起重视。

PBC的发病机制尚不完全清楚。目前认为遗传背景和环境因素相互作用导致了免疫耐受丧失,从而启动了针对肝内胆管上皮细胞的自身免疫反应。PBC的遗传易感性研究在欧洲及北美地区显示出较高的一致性,而在亚洲包括日本和中国进行的研究一致性不高。这说明PBC的发病可能存在种族差异,也可能与地域环境因素的不同有关,提示需进一步探讨遗传与环境因素相互作用在本病发生发展中的意义。近,我国学者对南方(主要是上海和江苏)汉族PBC患者进行了研究,发现早前欧美及日本报道的14个与PBC相关的单核苷酸多态性位点中,有7个与中国PBC患者相关。这些资料提示,我国PBC患者的遗传易感性与欧美及日本既存在共性,也存在差异。

早期诊断和治疗是控制PBC疾病发展的最有效手段。目前对PBC的治疗缺少有效的办法,熊去氧胆酸是唯一对早期PBC患者(尤其是黄疸没有出现的患者)进行有效控制的药物,但无治愈作用,而挽救晚期PBC患者的唯一手段是实施肝脏移植。我国是病毒性肝炎高发的国家,PBC的临床症状与病毒性肝炎相似,PBC患者早期常被误诊为病毒性肝炎或药物性肝炎,严重影响了PBC患者的诊疗。因此,对PBC患者进行早期的有效诊断,具有重要的社会意义。

我们利用高通量转录组测序筛选与PBC密切相关的基因,不仅有利于研究PBC的发生和发展的病理机制,而且能为诊断和治疗PBC提供新的诊断标志物或新的药物靶点。



技术实现要素:

为了弥补现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种可用于PBC疾病诊疗的标志物基因。相比传统的PBC疾病的诊断和治疗方法,使用基因标志物来诊断和治疗PBC疾病具有及时性、特异性和无创性。

为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:

提供一种诊断原发性胆汁性肝硬化的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含通过检测受试者外周血中PELI2基因、ZNF264基因和CDK15基因的表达水平来判断受试者是否患有原发性胆汁性肝硬化的试剂。

优选地,所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR或基因芯片诊断原发性胆汁性肝硬化的试剂。

所述用于RT-PCR或实时定量PCR的试剂为如下引物:

PELI2:正向引物为5’-CACTGCGCCCCCAATAAGG-3’(SEQ ID NO:1);

反向引物为5’-GTTCTCCAGAGGAGAGTGGC-3’(SEQ ID NO:2);

ZNF264:正向引物为5’-AGTCATGGTTCTCTGGTGGTTT-3’(SEQ ID NO:3);

反向引物为5’-GAAGCCCTCCTGTAGCTGTC-3’(SEQ ID NO:4);

CDK15:正向引物为5’-TGGGGGAAAGGTTCAAGTGC-3’(SEQ ID NO:5);

反向引物为5’-CACTGTTACTCCGTGGCCTT-3’(SEQ ID NO:6)。

所述试剂盒还包含内参基因的扩增引物:

β-actin:正向引物为5’-ATCCTGCGTCTGGACCT-3’(SEQ ID NO:9);

β-actin:反向引物为5’-ACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’(SEQ ID NO:10)。

本发明还涉及一种用于检测PELI2基因、ZNF264基因和CDK15基因的试剂在制备用于诊断原发性胆汁性肝硬化的试剂盒中的应用。

所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR或基因芯片检测所述基因的试剂。

所述用于RT-PCR或实时定量PCR的试剂为SEQ ID NO 1-6所示的引物。

本发明通过高通量测序筛选获得了在原发性胆汁性肝硬化中的表达显著上调或下调的基因,通过对这些基因进行进一步的筛选和验证,从中确定了3个能够用于诊断或预测个体是否患有PBC的基因标志物组合,这一组合的获得为PBC的诊断带来了极大的便利,有利于PBC的早期诊断、早期治疗。

附图说明

图1为提取的总RNA的电泳图。

图2为PCR验证候选基因在原发性胆汁性肝硬化患者中的表达改变情况。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1:筛选与原发性胆汁性肝硬化相关的基因

1、样品收集

收集医院风湿免疫科门诊或者住院部PBC患者30例,健康对照组(health control,HC)选取与PBC组年龄、性别匹配的健康志愿者30例。全部30例健康对照年龄和性别与PBC组匹配,无既往肝病史、自身免疫性疾病史、肿瘤病史及相应家族史。

2、RNA样品的制备及质量分析

2.1RNA样品的制备

(1)PBC患者和健康志愿者,每人采集外周静脉血10ml,EDTA抗凝。

(2)抽提外周血单个核细胞(PBMC):Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。

(3)分离PBMC的总RNA:Trizol一步法提取PBMC总RNA。

2.2RNA样品的质量分析

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品,RNA-seq测序的样品要求:OD260/OD280为1.8-2.2。

Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量,观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求,可以用于文库构建及测序。部分样品的RNA分析图像如图1所示。此类图像的RNA属于符合要求的RNA样品。

3、高通量转录组测序

3.1测序文库的建立

用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA后,用片段化缓冲剂(Fragment buffer)将其打断成短片段,以mRNA为模板用6碱基随机引物合成第1条cDNA链,再加入缓冲液、RNase H、dNTPs和DNA polymerase I合成第2条cDNA链,再用QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱;在做末端修复和加poly(A)并连接测序接头后,用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择,最后进行PCR扩增,建立测序文库。

3.2测序

测序用Illumina HiSeq 2000进行文库的测序,由深圳华大基因科技有限公司测序。

3.3转录丰度评估及差异基因的获得

用组装软件Trinity对转录组从头组装。首先SOAP denovo程序将reads通过片段重叠连成更长的片段叫Contig;再将Contig连在一起得到两端不能再延长的序列Unigene,再对其做去冗余处理、进一步拼接、同源转录本聚类,得到最终的Unigene。

匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理,Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。

差异基因的筛选首先用FC(Fold—change,倍数变化)和统计检测P值初选,然后用FDR(False discovery ratio)校验方法对P值进行假阳性检验。当FDR≤0.001,log2(Ratio)绝对值≥1时(Ratio为PBC患者某Unigene FPKM与健康对照中Unigene FPKM的比值),该Unigene表达差异显著。

3.4结果

前期的RNA-seq测序结果共筛选出121个差异表达基因,其中表达水平上调的基因51个,表达水平下调的基因70个。

实施例2PCR验证候选基因在原发性胆汁性肝硬化患者中的表达改变情况

根据前期高通量转录组深度测序的结果,按照P value的大小、FC的大小以及文献调研选择PELI2(其表达在PBC患者中下调)、ZNF264(其表达在PBC患者中下调)、CDK15(其表达在PBC患者中上调)、C2orf69(其表达在PBC患者中上调)基因进行验证。收集医院风湿免疫科门诊或者住院部PBC患者30例,健康对照组选取与PBC组年龄、性别匹配的健康志愿者30例,采用PCR进行经典的分子生物学实验验证,具体操作步骤如下所示:

1、RNA提取:参见实施例1。

2、逆转录:用逆转录缓冲液对1μg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系,每个样品取1μg总RNA作为模板RNA,在PCR管中分别加入以下组分:DEPC水,5×逆转录缓冲液,10mmol/L dNTP,0.1mmol/l DTT,30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV,模板RNA。42℃孵育1h,72℃10min,短暂离心。

3、PCR扩增:

PELI2:正向引物为5’-CACTGCGCCCCCAATAAGG-3’(SEQ ID NO:1);

反向引物为5’-GTTCTCCAGAGGAGAGTGGC-3’(SEQ ID NO:2);

ZNF264:正向引物为5’-AGTCATGGTTCTCTGGTGGTTT-3’(SEQ ID NO:3);

反向引物为5’-GAAGCCCTCCTGTAGCTGTC-3’(SEQ ID NO:4);

CDK15:正向引物为5’-TGGGGGAAAGGTTCAAGTGC-3’(SEQ ID NO:5);

反向引物为5’-CACTGTTACTCCGTGGCCTT-3’(SEQ ID NO:6);

C2orf69:正向引物为5’-GAAGTCCCTCCCTCAGGAAC-3’(SEQ ID NO:7);

反向引物为5’-GCCAACAGGAGCAATTCGTT-3’(SEQ ID NO:8);

β-actin:正向引物为5’-ATCCTGCGTCTGGACCT-3’(SEQ ID NO:9);

β-actin:反向引物为5’-ACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’(SEQ ID NO:10)。

反应混合物中各成分:正向引物、反向引物、10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、cDNA模板的量为分别为0.2、0.2、0.4、0.4、1.0、1.0、0.2、0.1和5μL,最后补充双蒸水使反应体系为10μL。PCR的反应条件如下:94℃,5min预变性;94℃,30s变性;58℃,30s退火;72℃,30s延伸;共40个循环,电泳检测PCR扩增产物。以DNA条带的亮度来衡量DNA量,条带越亮,代表DNA量越多。以β-actin作内参对照,将各个基因扩增产物的条带的亮度进行均一化处理,比较正常样本和PBC病人样本中各个基因扩增产物的亮度的比值。结果如图1所示,与正常对照相比,PELI2在PBC患者中的表达显著下调,ZNF264的表达在PBC患者中显著下调,CDK15的表达在PBC患者中显著上调,同RNA-sep结果一致。C2orf69的表达在PBC患者中与正常对照无显著差异,与RNA-seq结果不一致。

实施例3差异表达基因用于预测未知样本是否患有PBC的效果验证

收集不同于实施例1和2中的另外的样本,包括不知道是否患病、待诊断的样本20例,已知健康对照组(health control,HC)的样本10例。

抽提样本外周血的单个核细胞(PBMC),分离总RNA。反转录后,采用实施例2所示的引物分别对20例未知样本以及10例健康样本(作为对照)的3个基因PELI2、ZNF264、CDK15及内参基因β-actin进行PCR扩增。反应混合物中各成分:正向引物、反向引物、10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、cDNA模板的量为分别为0.2、0.2、0.4、0.4、1.0、1.0、0.2、0.1和5μL,最后补充双蒸水使反应体系为10μL。PCR的反应条件如下:94℃,5min预变性;94℃,30s变性;58℃,30s退火;72℃,30s延伸;共40个循环,电泳检测PCR扩增产物。以DNA条带的亮度来衡量DNA量,条带越亮,代表DNA量越多。以β-actin作内参对照,将各个基因扩增产物的条带的亮度进行均一化处理。10个健康样本中各个基因扩增产物的均一化后的数值的平均值作为标准值,比较未知样本中每个基因的均一化数值和各基因的标准值之间的比值。具体表达情况如表1所示,结果表明,PELI2、ZNF264表达显著下调(P<0.05)且CDK15表达显著上调(P<0.05)的未知样本共5例(1号、5号、11号、14号、19号),推测为PBC患者。

表120个未知样本中各基因的表达上下调倍数(未知样本/健康对照样本)

根据美国肝病研究学会(从SLD)2009年制定的原发性胆汁性肝硬化指南:a.胆汁淤积的生化学证据:主要基于ALP升高;b.AMA阳性;c.非化脓性破坏性胆管炎及小叶间胆管破坏的组织学证据(Class I,Level B)。如果符合上述三个标准中的两项则PBC的诊断可以建立。经临床诊断,1号、5号、11号、14号、19号确实均为PBC患者。而其余未被推测为PBC的15个个体中,有5个是慢性乙型肝炎、3个仅有胆汁淤积反应、7个为健康个体,均不是PBC患者。因此,利用这三个基因标志物的上下调所推测的PBC患者的结论是准确的。

由此可见,本发明提供了可以在基因检测水平推测个体是否是PBC患者的标志物,利用基因检测可以实现对PBC疾病及时性、特异性和无创性的诊断。

尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

序列表

<120>原发性胆汁性肝硬化的诊断试剂盒及<110>李璇

相关基因在制备该试剂盒中的应用

<160>10

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

CACTGCGCCC CCAATAAGG

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

GTTCTCCAGA GGAGAGTGGC

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

AGTCATGGTT CTCTGGTGGT TT

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

GAAGCCCTCC TGTAGCTGTC

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

TGGGGGAAAG GTTCAAGTGC

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

CACTGTTACT CCGTGGCCTT

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

GAAGTCCCTC CCTCAGGAAC

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

GCCAACAGGA GCAATTCGTT

<210>9

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ATCCTGCGTC TGGACCT

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ACTTGCGCTC AGGAGGAG

再多了解一些
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