本发明涉及一种利用d804标记快速选择携带qsbrleyd8a基因的抗纹枯病水稻的方法，该方法可利用d804标记快速选出抗水稻纹枯病的稳定株系。
背景技术：
水稻是关乎我国的国家粮食安全的重要粮食作物。我国水稻育种界选育纹枯病抗病水稻的传统方法都是通过表型选择进行的，即用纹枯病致病菌在不同的水稻发育时期对水稻单株进行接种鉴定。由于传统的接种鉴定大部分是在田间种植条件下进行的，接种鉴定的结果误差大，准确性差，而且不同年份的接种结果存在差异，导致接种鉴定结果的准确率低。通过分子标记对水稻纹枯病抗性相关基因进行选择可以在水稻苗期即对纹枯病抗性进行选择，选择的准确率高，可以大大提高育种效率。水稻的纹枯病抗性是一个数量性状，受多个数量性状基因座位(qtl)控制。为了有效的提高育种效率，加快育种进程，本发明提出一种利用d804标记快速选择携带qsbrleyd8a基因的抗纹枯病水稻的方法。本发明相比传统的利用纹枯病致病菌进行接种鉴定的表型选择方法更简便快速，无需进行传统的纹枯病菌接种鉴定，而且相比接种鉴定方法的准确度更高，因此大大提高了育种效率。
技术实现要素：
本发明包括以下步骤：
(1)将水稻品种lemont作为母本与水稻品种扬稻4号作为父本进行杂交，并构建重组自交系分离群体fn，fn中的n≥5；
(2)用d804分子标记pcr扩增步骤(1)获得的重组自交系分离群体内的不同株系的叶片dna，根据d804标记与水稻第8染色体上的纹枯病抗性基因qsbrleyd8a连锁的特点，将d804标记的pcr扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，选出与亲本扬稻4号带型相同的株系即是携带qsbrleyd8a纹枯病抗性qtl的抗纹枯病水稻株系。
进一步地，所述步骤(2)中，d804标记并非等同于qsbrleyd8a纹枯病抗性基因，由于d804标记与qsbrleyd8a基因紧密连锁，可以通过d804标记检测快速获得携带qsbrleyd8a纹枯病抗性qtl的抗纹枯病水稻株系，该方法比传统的纹枯病菌接种的抗性鉴定方法更简便快速，无需接种鉴定即可准确选出抗水稻纹枯病的稳定株系。
具体实施方式
实施例1：在水稻品种lemont和水稻品种扬稻4号杂交组配的f6代分离群体中，d804标记的应用。
1.将水稻品种lemont作母本，与水稻品种扬稻4号作父本进行杂交并构建f6代分离群体(lemont为来自美国的粳稻品种，扬稻4号为来自江苏的籼稻品种，lemont和扬稻4号由中国水稻研究所国家水稻种质资源中期库提供)，这个包括219个株系在内的f6分离群体于2013年5月播种在杭州市富阳区中国水稻研究所试验场。
2.利用标记d804对这个219个株系的分离群体内的每一株系进行pcr检测，利用标记d804与基因qsbrleyd8a连锁的特点，可检测出哪个株系在qsbrleyd8a座位携带扬稻4号的抗病等位基因(用d804标记扩增扬稻4号的带型来追踪qsbrleyd8a座位的扬稻4号抗病等位基因)；哪个株系在qsbrleyd8a座位携带lemont的感病等位基因(用d804标记扩增lemont的带型来追踪qsbrleyd8a座位的lemont感病等位基因)。
3.选择携带不同等位基因的株系以获得平均病斑长度、平均病级不同的水稻材料(表1)。
表1.在f6世代利用d804标记进行选择得到的携带不同等位基因的株系的平均纹枯病病斑长度、平均病级，该f6群体于2013年5月播种于杭州
实施例2：在水稻品种lemont和水稻品种扬稻4号杂交组配的f9代分离群体中，d804标记的应用。
1.将水稻品种lemont作母本，与水稻品种扬稻4号作父本进行杂交并构建f9代分离群体(lemont为来自美国的粳稻品种，扬稻4号为来自江苏的籼稻品种，lemont和扬稻4号由中国水稻研究所国家水稻种质资源中期库提供)，这个包括219个株系在内的f9分离群体于2015年5月播种在杭州市富阳区中国水稻研究所试验农场。
2.利用标记d804对这个219个株系的分离群体内的每一株系进行pcr检测，利用标记d804与基因qsbrleyd8a连锁的特点，可检测出哪个株系在qsbrleyd8a座位携带扬稻4号的抗病等位基因(用d804标记扩增扬稻4号的带型来追踪qsbrleyd8a座位的扬稻4号抗病等位基因)；哪个株系在qsbrleyd8a座位携带lemont的感病等位基因(用d804标记扩增lemont的带型来追踪qsbrleyd8a座位的lemont感病等位基因)。
3.选择携带不同等位基因的株系以获得平均病斑长度、平均病级不同的水稻材料(表2)。
表2.在f9世代利用d804标记进行选择得到的携带不同等位基因的株系的平均纹枯病病斑长度、平均病级，该f9群体于2015年5月播种于杭州
实施例3：在水稻品种lemont和水稻品种扬稻4号杂交组配的f11代分离群体中，d804标记的应用。
1.将水稻品种lemont作母本，与水稻品种扬稻4号作父本进行杂交并构建f11代分离群体(lemont为来自美国的粳稻品种，扬稻4号为来自江苏的籼稻品种，lemont和扬稻4号由中国水稻研究所国家水稻种质资源中期库提供)，这个包括219个株系在内的f11分离群体于2016年5月播种在杭州市富阳区中国水稻研究所试验农场。
2.利用标记d804对这个219个株系的分离群体内的每一株系进行pcr检测，利用标记d804与基因qsbrleyd8a连锁的特点，可检测出哪个株系在qsbrleyd8a座位携带扬稻4号的抗病等位基因(用d804标记扩增扬稻4号的带型来追踪qsbrleyd8a座位的扬稻4号抗病等位基因)；哪个株系在qsbrleyd8a座位携带lemont的感病等位基因(用d804标记扩增lemont的带型来追踪qsbrleyd8a座位的lemont感病等位基因)。
3.选择携带不同等位基因的株系以获得平均病斑长度、平均病级不同的水稻材料(表3)。
表3.在f11世代利用d804标记进行选择得到的携带不同等位基因的株系的平均纹枯病病斑长度、平均病级，该f11群体于2016年5月播种于杭州
从以上3个实施例子可以看出，利用d804标记选择携带qsbrleyd8a抗性等位基因(来自扬稻4号)的株系的平均病斑长度和平均病级均比携带qsbrleyd8a感病等位基因(来自lemont)的株系小，d804标记有效实现了利用qsbrleyd8a抗性基因的目的。在实际应用过程中，无需对重组自交系分离群体内的株系进行田间接种鉴定，只需要利用d804标记进行检测就行了，而上述实施例1至例3的接种鉴定结果只是为了证明d804标记确实是有效的，实际操作过程中不需要接种鉴定。以上3个实施例子纹枯病田间接种鉴定方法采用带菌牙签接种方法，该接种方法见zou等，mappingquantitativetraitlocicontrollingsheathblightresistanceintworicecultivars(oryzasatival.)，thero.appl.genet.，2000年101卷，569-573。接种采用的纹枯病致病菌编号为zj03，由中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室提供。每个重组自交系分离群体内的株系接种3个单株，每个单株接种2个分蘖，在始穗期接种，接种后30天调查发病情况。平均病斑长度是每个接种的株系内6个分蘖的平均病斑长度，平均病级是每个接种株系内3个单株的平均值。病级评分的方法采用国际上通用的0-9级评分方法，0级代表植株不发病，9级代表植株发病死亡。
以上3个实施例子pcr扩增所用到的叶片dna的提取方法采用通用的ctab方法；d804分子标记的pcr扩增程序为94℃5分钟，35个循环的94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，及最后的72℃7分钟；pcr扩增产物采用通用的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法和硝酸银染色法进行检测。d804标记序列见zeng等，developmentof1047insertion-deletionmarkersforricegeneticstudiesandbreeding，genet.mol.res.2013年12卷第4期，5226-5235。由于这些方法都是通用的常规实验方法，因此在这里不再赘述。
最后，需要指出的是，本发明不仅仅限于以上的实施例子，本领域技术人员从本发明公开内容直接推导或联想到的所有变通情况，均认为是本发明的保护范围。例如，d804分子标记不仅仅局限于应用在lemont和扬稻4号组配的fn(n≥2)分离群体，也可应用于lemont和扬稻4号组配的bckfm(k≥1，m≥1)群体、双单倍体dh群体等。