一种与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因的筛选方法与流程

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因的筛选方法。

背景技术：

卵泡刺激素(follicle-stimulatinghormone,fsh)是由垂体前叶产生的一种糖蛋白类促性腺激素，对促进卵泡的生长发育，调控卵巢各种性激素的合成与分泌发挥着重要作用。fsh的浓度剂量对卵泡发育的启动和周期、卵泡到达成熟的时间以及成熟卵泡数目均至关重要。fsh是生物大分子，不能穿过细胞膜直接传递生物信息，必须通过与靶细胞膜上的fshr特异性结合发挥其生理功能。研究显示，fshr阳性表达的卵巢癌细胞株上fshr的表达量与fsh具有时间和剂量依赖的相关性，当fsh刺激浓度为40iu/l，作用时间为48h时，卵巢癌细胞株的增殖达到峰值(ivarssonk等,humreprod,2001.16:18-23；huangy等,endocrine-relatedcancer,2011.18:13-26)，同时相关基因表达量为最佳(songg等,journalofpracticalobstetricsandgynecology,2004.5:025)。此外，卵泡发育过程中，卵泡大小的差异对fsh的依赖程度也会不同，研究发现，猪小卵泡膜颗粒细胞中fshr结合fsh的能力强于大卵泡(zhengw等,gynecologiconcology,2000.76:80-8)。同时，fshr的mrna表达量随着卵泡的增大而降低，其在中、小卵泡中表达量显著高于大卵泡(zhuoyingh,journalofchongqingmedicaluniversity,2004.2:008)。

在畜牧生产上，fsh具有广泛的应用价值，常用于母畜的同期发情、超数排卵、乏情发情诱导及卵巢疾病的治疗等方面。然而，研究发现，国内fsh及其类似物制品虽价格低廉，但存在着因原材料品质、生产工艺及效价评定等方面的差异造成的效价不稳定问题。

目前用于测定fsh制剂生物效价的方法主要分体内、体外生物活性检测两种方式。其中体内生物活性检测，各国药典(英国、欧洲、美国及中国)都是采用雌幼大鼠卵巢增重法。即利用fsh促进卵泡发育的药理药效特性，基于steelman和pohley于1953年建立的生物活性测定方法，所建立的以人绒毛膜促性腺激素(hcg)增敏的雌幼大鼠卵巢增重法。主要体现在动物数、大鼠体重、溶媒中hcg含量和给药剂量的不同上。在动物数上，chp2010要求每组至少8只，而ep7.1、usp35—nf30要求每组至少5只。动物数量减少，试验误差必定增加，一般生物测定误差在20％左右(zhanjunl,drugstandardsofchina,2012.3(5):336)。在大鼠体重上，chp2010规定：fsh生物测定，大鼠日龄在19～23d(相差不超过3d)，体重在36～50g；ep7.0规定：大鼠日龄在19～28d(相差不超过3d)；usp35—nf30规定：大鼠日龄在20～21d(相差只有2d)。各国药典对大鼠体重要求相差均在10g以内，雌幼鼠既要满足体内基本无内源性促性腺激素，又要要求其对外源fsh有一定灵敏性。长期试验发现：大鼠体重36～40g，对fsh灵敏度极差。在溶媒中hcg含量上，要求持续的hcg刺激，增敏fsh药效，故均以含有hcg的溶媒配置标准品溶液和供试品溶液，使每天给药时都有不断的hcg刺激。在试验中，hcg剂量偏低容易导致试验灵敏度不高。在给药剂量上，fsh的给药剂量是随着大鼠种属、季节、灵敏度变化而变化。因此，该方法虽能真实反映出fsh的生物学效应，但因其需要大量的试验动物、试验动物的日龄与体重的个体差异及检测耗时长等因素，造成该检测方法成本高、准确性差及操作繁琐等不足。

体外生物活性检测方法是利用fsh的免疫活性，通过放射性免疫测定、酶联免疫吸附等方式分析fsh的生物活性，该方法简单易行、快速简便，但是它检测的仅仅是fsh的物理含量，不能反映fsh制品真实的生物活性。

因此建立一个经济、简捷、有效地检测fsh制品及其类似物生物活性的新方法，对于提高fsh在家畜繁殖生产应用中的高效性和安全性具有重要指导意义。然而建立一个经济、简捷、有效地检测fsh制品及其类似物生物活性的新方法最关键的是要找到与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因，通过该基因去指导新的方法，而现有技术中并没有公开相同或相似的技术内容。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因的筛选方法的技术方案。

所述的一种与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

1)选择待筛选细胞株，采用40iu/l浓度的fsh处理48h后，采用半定量pcr方法检测分析各细胞对fsh刺激的反应敏感性，确定fsh效价评定用细胞株；

2)对上述选定细胞经40iu/l浓度的fsh处理18h后，利用转录组测序检测出差异显著表达的基因，并对其中fsh上调基因差异倍数显著的基因进行实时荧光定量pcr检测验证，获得fsh剂量依赖表达的候选基因；

3)运用实时荧光定量pcr分析上述候选基因在fsh剂量梯度0、20、40、60、80、100iu/l下的表达变化，筛选出与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因。

所述的一种与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因的筛选方法，其特征在于所述的步骤1)中半定量pcr方法中pcr反应体系：10ul的反应体系中加入待筛选细胞dna模板1μl，10mm检测候选细胞fsh刺激敏感性标志基因的引物前后各0.2μl，2×transhifipcrsupermix5μl，ddh2o3.6μl；pcr反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，60℃退火60s，72℃延伸15s，扩增28个循环，最后72℃延伸5min。

所述的一种与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因的筛选方法，其特征在于所述的步骤2)中荧光定量pcr检测验证中pcr反应体系：20ul的反应体系中加入fsh效价评定用细胞株细胞dna模板2μl，10mmfsh上调差异倍数显著基因的引物前后各1.2μl，sybrgreenrealtimepcrmastermix10μl，plussolution2μl，ddh2o5.6μl；pcr反应条件为：95℃预变性1min，然后95℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸15s，扩增40个循环，最后72℃延伸10min。

所述的基因lhcgr作为fsh效价评定标志基因的应用。

通过本发明的方法能够筛选出与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因，通过该基因为后续制定出能快速、有效、灵敏、精确的检测出fsh效价的方法提供基础。

附图说明

图1：本发明的技术流程图。

图2：fsh效价评定用候选细胞株的培养。

图3：fsh处理后各个候选细胞中相关调控基因的表达情况。

图4：fsh上调差异倍数显著基因的实时荧光定量pcr的验证。

图5：候选基因lhcgr、pafah1b2、igf1、ccdc71、hsd3b1和star在fsh剂量梯度(0、20、40、60、80、100iu/l)下的表达情况。

图6：基因lhcgr表达量与fsh剂量的线性关系。

具体实施方式

以下结合附图1和实施例来进一步说明本发明。

实施例1:fsh刺激反应敏感性细胞的筛选

fsh效价评定用候选细胞的来源：卵巢癌细胞株caov-3、es-2和ovcar-3购自北京协和细胞库；卵巢癌细胞株nih:ovcar-3、skov-3购自上海中科院细胞库；颗粒细胞采自于浙江海盐县屠宰场的成年母猪卵巢上的3-6mm卵泡，如图2所示。

细胞培养与fsh处理：待上述细胞长满10cm细胞培养皿后，去除培养皿中原培养液，10mlpbs清洗3次，1ml0.25％胰酶，放入37℃、5％co2培养箱内消化，用含有10％血清、1％双抗的dmem新鲜培养液终止胰酶消化，将消化下来的细胞移至50ml离心管，吹打混匀，1100r/min离心3min，弃上清，用上述新鲜培养液重悬细胞，将其转至六孔板中内，放入培养箱培养。每隔1d更换培养液，待六孔板中每个孔的细胞长至80％及以上。去除培养废液，每个孔中加入2ml的pbs清洗2次。弃去pbs后，将fsh处理组(40iu/l)和对照组(0iu/l)处理分别加到六孔板中，做好标记，放入培养箱内培养48h。

提取细胞rna：去除废弃培养基，每个孔中2mlpbs清洗3次，加入1ml的trizol，反复吹吸后移至2ml离心管中，室温放置5min；加入0.2ml的氯仿，上下剧烈震荡15s，室温放置3min后，12000g，4℃离心15min；将上清移至新的1.5ml离心管中，加入0.5ml的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min后，12000g，4℃离心15min；弃上清，加入75％乙醇1ml，轻弹管壁使沉淀浮起，12000g，4℃离心15min；弃上清，将rna沉淀晾干至透明状，根据rna沉淀量加入适量ddh2o。用微量分光光度计检测所提取rna的纯度和浓度，其od260/od280的值应保证在1.8-2.0之间。符合标准的样品可立即进行反转录或-80℃保存。

20μl反转录反应体系：先将包含5×gdnabuffer2μl、总rna2μg和rnase-freeddh2o的去除基因组dna混合液10μl，42℃，孵育3min；冰上加入10×fastrtbuffer2μl，rtenzymemix1μl，fq-rtprimermix2μl，rnase-freeddh2o5μl，42℃，孵育30min；95℃，孵育3min。

采用半定量pcr方法检测上述候选细胞中fsh调控标志基因的表达情况，以分析上述候选细胞对fsh处理的反应敏感性。其中用于检测人卵巢癌细胞的标志基因为akr1c1、bdkrb1、caspase1、ebp和ctnnb1；猪卵泡颗粒细胞的标志基因为cyp11a1、inha、hsd17b1、hsd3b1和star。

pcr反应体系：10ul的反应体系中加入dna模板1μl，10mm引物(如表1所示)前后各0.2μl，2×transhifipcrsupermix5μl，ddh2o3.6μl。pcr反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，退火60s，72℃延伸15s，扩增28个循环，最后72℃延伸5min。

表1.检测候选细胞fsh刺激敏感性的相关基因

pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，与对照组相比，在浓度为40iu/l的fsh刺激下，各个卵巢癌细胞株所选标志基因的表达量并没有明显变化。猪卵泡颗粒细胞中基因star、hsd3b1的表达水平均显著升高。说明，在本发明中，猪卵泡颗粒细胞更适合作为后续fsh剂量依赖基因筛选用细胞。

实施例2:fsh剂量依赖表达的候选基因的筛选

依据按实施例1的结果，对fsh(40iu/l)处理18h后的卵泡颗粒细胞进行转录组测序，分析基因表达变化，该工作由联川生物技术(杭州)有限公司完成。结果显示，fsh处理后共有190个差异显著表达的基因，其中上调的基因有85个，下调的基因有105个。从中选择fsh上调基因中差异显著表达倍数由大到小的17个基因(如表2所示)：mthfd2、pag1、lhcgr、ctsl、tshz1、pafah1b2、sdc1、igf1、mesdc2、alg2、dctpp1、sat2、ccdc71、hsd3b1、adam10、mrpl22、star。

表2.fsh上调的差异表达倍数大于2倍的基因

对上述所选的差异显著的基因进行实时定量pcr验证。pcr反应体系：20ul的反应体系中加入猪卵泡颗粒细胞dna模板2μl，10mm引物(如表3所示)前后各1.2μl，sybrgreenrealtimepcrmastermix10μl，plussolution2μl，ddh2o5.6μl。

表3.实时定量pcr验证的差异表达基因

pcr反应条件为：95℃预变性1min，然后95℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸15s，扩增40个循环，最后72℃延伸10min。结果如图4显示，lhcgr、pafah1b2、igf1、ccdc71、hsd3b1、star具有极极显著性差异(p<0.001)，pag1、sdc1、sat2、adam10、mrpl22有极显著差异(p<0.01)，mthfd2、ctsl、tshz1、dctpp1差异显著(p<0.05)，mesdc2、alg2差异不显著(p>0.05)。

实施例3:fsh效价评定标志基因的筛选

依据实施例2，将6个差异表达极显著(p<0.001)的基因lhcgr、pafah1b2、igf1、ccdc71、hsd3b1和star进行fsh剂量梯度(0、20、40、60、80、100iu/l)表达筛选，如图5所示，基因pafah1b2、igf1、ccdc71、hsd3b1和star的表达量没有随着fsh剂量增加而增加，基因lhcgr的表达量与fsh剂量梯度呈线性增长趋势。

以fsh处理浓度为横坐标，基因lhcgr差异表达量为纵坐标作散点图，添加趋势线。图6所示，将fsh浓度范围20～100iu/l为横坐标制作出来的散点图，添加趋势线后，显示相关系数r2＝0.9835。r的平方值的取值一般为0到1之间的数值，表示趋势线的估计值与对应的实际数据之间的拟合程度。当趋势线的r2等于1或者接近1时，其可靠性最高，两者之间相关性高。说明fsh浓度在20～100iu/l之间时，随着fsh浓度的增加，基因lhcgr表达量呈线性增加。即筛选出fsh效价评定标志基因。