含CpG-ODN基序重组抑制素质粒的构建方法及其应用与流程

本发明涉及生物基因工程，具体涉及一种含CpG-ODN基序重组抑制素质粒的构建方法，同时涉及该重组抑制素质粒对小鼠颗粒细胞相关凋亡基因表达的影响。
背景技术：
：哺乳动物的卵泡发育是由体内各种生长因子、垂体促性腺激素和类固醇激素共同调节的一个连续而复杂的生理过程。在卵泡发育过程中，颗粒细胞分泌的抑制素(Inhibin,INH)是由α和β亚基组成的异二聚体糖蛋白，属于转化生长因子β(Transforminggrowthfactorbeta，TGFβ)超家族成员之一，通过自分泌或旁分泌的方式调控类固醇激素产生及卵母细胞成熟，参与卵泡发育，甚至在猪的卵泡发育过程中上调卵泡闭锁率。CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)是含有非甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤基序的短单链合成DNA分子。研究表明，CpG-ODN具有免疫刺激活性，能诱导Ⅰ型免疫应答，随后激活机体的细胞和体液免疫。激活人体细胞的最佳CpG-ODN基序是5'-GTCGTT-3'，而对小鼠细胞具有活化作用的最佳CpG-ODN基序是5'-GACGTT-3'。用合成的CpG-ODN能有效激活人和小鼠TLR9介导的NF-κB激活和细胞因子，并产生相应的免疫应激。含CpG-ODN的疫苗可介导细胞增殖，干扰启动子活性和免疫基因的表达，显著增加动物体内IgM和抗病毒分子Mx2的含量。尽管CpG-ODN作为佐剂已表现出提高动物免疫力的能力，但是否影响哺乳动物卵泡发育尤其是颗粒细胞发育尚无报道。技术实现要素：本发明的目的是：针对上述现有技术的不足，提供一种含CpG-ODN基序重组抑制素质粒的构建方法，同时提供该重组抑制素质粒对小鼠颗粒细胞相关凋亡基因表达的影响。本发明选择对小鼠细胞具有免疫刺激活性的CpG-ODN基序，构建含基序CpG-ODN片段和抑制素α(1～32)片段的重组抑制素质粒pEGISI-CpG-ODN，并转染原代培养的小鼠卵巢颗粒细胞，通过qRT-PCR法检测细胞中死亡受体通路相关基因mRNA表达水平的变化，以探讨CpG-ODN是否抑制小鼠颗粒细胞发育，为临床上开发促进哺乳动物卵泡发育和提高动物繁殖力的新型基因疫苗提供新思路。具体地，本发明所采用的技术方案是：一种含CpG-ODN基序重组抑制素质粒的构建方法，该方法步骤如下：a.选择对小鼠细胞具有激活作用的CpG基序5'-GACGTT-3'，设计具有免疫作用的如SEQIDNo.1所示的CpG-ODN片段；b.将CpG-ODN片段和pEGISI质粒分别进行双酶切后连接，连接产物经转化、纯化后，得重组抑制素质粒pEGISI-CpG-ODN。本发明同时提供上述方法构建得到的重组抑制素质粒pEGISI-CpG-ODN在下调小鼠卵巢颗粒细胞促凋亡基因Fas、FasL、DR4/5、TRAIL、Caspase8和Caspase3mRNA的表达水平中的应用，从而抑制小鼠卵巢颗粒细胞凋亡。本发明以pEGISI质粒为表达载体，成功构建了含CpG-ODN基序的重组抑制素质粒pEGISI-CpG-ODN，并转染至原代培养的小鼠卵巢颗粒细胞中，结果显示，与pEGISI组相比，pEGISI-CPG-ODN组能极显著下调颗粒细胞中Fas/FasL和DR4/5/TRAIL死亡受体通路中关键基因(Fas、FasL、DR4/5、TRAIL、Caspase8和Caspase3)mRNA的表达水平(P<0.01)，说明CpG-ODN与pEGISI质粒融合能降低小鼠卵巢颗粒细胞中促凋亡基因mRNA的表达水平，CpG-ODN在一定程度上能减弱外/内源性抑制素对颗粒细胞凋亡的促进作用，进而促进卵泡发育。附图说明图1是pEGISI-CpG-ODN菌落PCR电泳图。其中，M：DL2000DNA相对分子质量标准；1：pEGISI-CpG-ODN单菌落PCR扩增产物。图2是pEGISI-CpG-ODNPCR产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，M：DL2000DNA相对分子质量标准；1：pEGISI-CpG-ODNPCR扩增产物。图3是pEGISI-CpG-ODN质粒测序结果。图4是荧光显微镜检测质粒在颗粒细胞中的表达情况(10×10)。其中，A：pEGFP转染组；B：pEGISI转染组；C：pEGISI-CpG-ODN转染组。图5是小鼠颗粒细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳图。其中，1：pEGFP转染组；2：pEGISI转染组；3：pEGISI-CpG-ODN转染组。图6是质粒转染颗粒细胞48h后CpGmRNA的表达量图。图7是小鼠颗粒细胞转染质粒后凋亡基因Fas、FasL、Caspase8和Caspase3mRNA的表达量图。图8是小鼠颗粒细胞转染后凋亡基因DR4/5、TRAIL、Caspase8和Caspase3mRNA的表达量图。上述图6-图8中，P<0.01表示差异极显著(**)，0.01<P<0.05表示差异显著(*)。具体实施方式实验动物：21～23日龄雌性ICR小鼠，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。菌种及生化试剂：抑制素质粒pEGISI(含绿色荧光蛋白(GFP)、乙肝表面抗原(HBsAg)S基因及抑制素(INH)基因)由曹少先等(曹少先，茆达干，舒邓群等.卵泡抑制素与GFP融合基因疫苗pEGISI的构建及表达[J].家畜生态学报，2007，(02)：9-12.)构建，本实验室保种；T4DNA连接酶、限制性内切酶XhoⅠ、HindⅢ、2000Reagent、Opti-MEM培养基(Thermoscientific，美国)；无内毒素质粒提取试剂盒、柱式RNA提取试剂盒(天恩泽，北京)；PrimeScriptTMRTreagentKit、PremixExTaqTM(TaKaRa，日本)；DME/F-12培养基(Hyclone，美国)；实施例1重组抑制素质粒pEGISI-CpG-ODN的构建及鉴定1.CpG-ODN片段的设计与合成选择对小鼠细胞具有激活作用的CpG基序：5'-GACGTT-3'，根据设计原则设计具有免疫作用的CpG-ODN片段，正链：5'-CTCGAGCGGCACGTTGACGTTCACGTTGACGTTCACGTTGACGTTCACGTTGACGTTCCCAAGCTTGGG-3'(SEQIDNo.1，划线部分为限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ的酶切位点及其保护性碱基)，由华大基因技术有限公司合成。2.重组抑制素质粒pEGISI-CpG-ODN的构建及鉴定将带有酶切位点的CpG-ODN片段和pEGISI质粒分别用XhoⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切，然后用T4DNA连接酶于4℃连接过夜，连接产物转化到感受态细胞E.coliDH5α中，将冰浴好的混合物放入42℃水浴90s，再冰浴2～3min，混合物于700μL无抗性LB培养基中37℃摇床培养45min，然后取100μL均匀地涂布于含有Kana抗生素的LB固体平板上，平板于37℃恒温箱中倒置培养过夜。质粒进行单菌落筛选，上游引物为：5'-CGCAATGGGCGGTAGGCGTG-3'(SEQIDNo.2)，下游引物为：5'-CCCAAGCTTGGGAACGTCAACGT-3'(SEQIDNo.3)。用TaqDNA聚合酶按以下程序进行扩增：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸10s，共35个循环。3.重组质粒pEGISI-CpG-ODN的鉴定结果3.1含pEGISI-CpG-ODN菌落PCRpEGISI-CpG-ODN质粒经单菌落筛选，用普通PCR进行扩增，1.2％琼脂糖凝胶电泳图显示在100bp左右出现目的片段，与扩增CpG-ODN片段的引物大小相符合(图1)。3.2pEGISI-CpG-ODN质粒扩增通过普通PCR方法扩增pEGISI-CpG-ODN质粒的CpG-ODN片段，扩增产物用1.2％琼脂糖凝胶进行验证，可见100bp左右出现明显条带，与预期大小相符合(图2)。3.3测序结果将pEGISI-CpG-ODN菌落条带正确的单菌落进行扩菌，并用无内毒素质粒提取试剂盒进行质粒小提，质粒送往华大基因进行测序。测序结果表明，含免疫片段的CpG-ODN核苷酸序列正确插入到pEGISI质粒中，证明重组抑制素质粒pEGISI-CpG-ODN构建成功(图3)。实施例2CpG-ODN能否拮抗抑制素对小鼠卵巢颗粒细胞发育的抑制作用的探讨1.小鼠卵巢颗粒细胞的分离与培养取21～23日龄雌性ICR小鼠5只，用乙醚麻醉小鼠后迅速将其脱颈处死。小鼠腹部用75％的酒精棉球进行擦拭消毒。于无菌环境中迅速取出双侧卵巢，体式显微镜下去除多余的输卵管、脂肪及其它组织。用预热的PBS冲洗卵巢3遍，4号针头刺破卵泡，释放出颗粒细胞及卵母细胞。加入1mL完全培养基(DME/F-12+15％FBS+1％青链霉素)进行吹打，用40μm的过滤器过滤细胞悬液，以分离卵母细胞，得到的细胞悬液于1000rpm离心5min，弃上清，获得细胞沉淀。颗粒细胞以1×106/mL密度铺板于细胞培养瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。2.质粒转染将培养的颗粒细胞以2×106/孔密度铺板于6孔板中，当细胞融合率达到80％左右进行转染，转染前24h更换为无双抗培养基(DME/F-12+15％FBS)。实验分为三组：pEGFP质粒转染组为空载体组(又称pEGFP组)，抑制素质粒pEGISI转染组为对照组(又称pEGISI组)，含CpG-ODN基序的重组抑制素质粒转染组为实验组(又称pEGISI-CpG-ODN组)，每组设3个重复。用脂质体2000进行转染。分别用47μL和44μLOpti-MEM培养液稀释DNA(3μg)和2000(6μL)，室温静置5min后，将两者温和混合至体积为100μL/孔，室温静置20min，呈点滴状添加到6孔板内，5h后更换细胞培养液，转染后48h收集细胞进行荧光定量PCR(qRT-PCR)检测。结果显示，三种质粒(pEGFP、pEGISI和pEGISI-CpG-ODN)转染颗粒细胞48h，荧光显微镜观察各孔细胞中绿色荧光蛋白(EGFP)的荧光强度和转染数目，可见各组转染效率为60％左右(图4)。3.细胞中总RNA的提取及反转录三种质粒(pEGFP、pEGISI和pEGISI-CpG-ODN)转染颗粒细胞48h后收集细胞，根据柱式RNA提取试剂盒说明书进行细胞中总RNA的提取，每孔加入500μLTrizol溶液提取细胞中的总RNA。通过OD260/280的比值和琼脂糖凝胶电泳来分析所提RNA的质量及完整性。用PrimerScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser反转总RNA后得到模板cDNA，将cDNA作为模板进行qRT-PCR检测。结果显示，微量紫外可见分光光度计测定OD260/280比值均在1.8～2.0之间；1.2％琼脂糖电泳鉴定RNA的完整性，28s、18s、5s三条条带清晰可见，表明所提总RNA质量良好，可用于后续实验(图5)。4.qRT-PCR检测相关凋亡基因mRNA的表达采用荧光定量PCR仪(ABIStepOne)检测死亡因子受体(Fas)/死亡因子Fas配体(FasL)和死亡因子受体(DR4/5)/死亡因子DR4/5配体(TRAIL)通路中相关基因的表达。qRT-PCR反应体系：2xSYBRPremixExTaq5μL，上下游引物各0.2μL(0.2μM)，50xROXReferenceDye0.2μL，cDNA模板1μL，ddH2O3.4μL，总体积10μL。反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火延伸30s，共40个循环。所有操作过程均在冰上完成。以β-actin作为内参基因，并用2-△△CT法分析实验结果。qRT-PCR引物设计见表1。表1qRT-PCR引物序列引物名称正向引物序列(5'-3')反向引物序列(5'-3')β-actinCATCCGTAAAGACCTCTATGCCAACATGGAGCCACCGATCCACAFasTATCAAGGAGGCCCATTTTGCTGTTTCCACTTCTAAACCATGCTFasLTCCGTGAGTTCACCAACCAAAGGGGGTTCCCTGTTAAATGGGDR4/5CGGGCAGATCACTACACCCTGTTACTGGAACAAAGACAGCCTRAILATGGTGATTTGCATAGTGCTCCGCAAGCAGGGTCTGTTCAAGACaspase8TGCTTGGACTACATCCCACACTGCAGTCTAGGAAGTTGACCACaspase3TGGTGATGAAGGGGTCATTTATGTTCGGCTTTCCAGTCAGACTC4.1结果三种质粒(pEGFP、pEGISI和pEGISI-CpG-ODN)转染颗粒细胞48h后收集细胞，采用qRT-PCR法检测CpG在各组细胞中的含量。结果表明，与pEGFP组和pEGISI组相比，含CpG-ODN基序的pEGISI-CpG-ODN组中CpGmRNA的含量极显著升高(P<0.01)(图6)。qRT-PCR检测Fas/FasL死亡受体通路中基因的表达：三种质粒(pEGFP、pEGISI和pEGISI-CpG-ODN)转染颗粒细胞48h后收集细胞，用qRT-PCR法检测Fas、FasL、Caspase8和Caspase3在各组细胞中的含量。结果表明，与pEGFP组相比，抑制素质粒pEGISI转染颗粒细胞后，显著上调促凋亡基因FasmRNA的表达(P<0.05)，极显著上调促凋亡基因FasL、Caspase8和Caspase3mRNA的表达(P<0.01)；与pEGISI组相比，pEGISI-CpG-ODN组中促凋亡基因Fas、FasL、Caspase8和Caspase3mRNA的表达量极显著下降(P<0.01)(图7)。qRT-PCR检测DR4/5/TRAIL死亡受体通路中基因的表达：三种质粒(pEGFP、pEGISI和pEGISI-CpG-ODN)转染小鼠颗粒细胞48h后收集细胞，用qRT-PCR法检测DR4/5、TRAIL、Caspase8和Caspase3在各组细胞中表达量。研究结果表明，与pEGFP组相比，抑制素质粒pEGISI组上调促凋亡基因Caspase8和Caspase3mRNA的表达水平(P<0.01)；与pEGISI组相比，pEGISI-CpG-ODN组极显著下调促凋亡基因DR4/5、TRAIL、Caspase8和Caspase3mRNA的表达水平(P<0.01)(图8)。由上可知，pEGISI-CPG-ODN组与pEGISI组相比能极显著下调颗粒细胞中Fas/FasL和DR4/5/TRAIL死亡受体通路中关键基因(Fas、FasL、DR4/5、TRAIL、Caspase8和Caspase3)mRNA的表达水平(P<0.01)。因此，本研究证实了CpG-ODN与pEGISI质粒融合能降低小鼠卵巢颗粒细胞中促凋亡基因mRNA的表达水平，进而抑制细胞凋亡。序列表<110>湖南农业大学<120>含CpG-ODN基序重组抑制素质粒的构建方法及其应用<130>002<160>3<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>69<212>DNA<213>人工序列()<400>1ctcgagcggcacgttgacgttcacgttgacgttcacgttgacgttcacgttgacgttccc60aagcttggg69<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列()<400>2cgcaatgggcggtaggcgtg20<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列()<400>3cccaagcttgggaacgtcaacgt23当前第1页1 2 3