一种化脓隐秘杆菌的检测引物及检测试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种化脓隐秘杆菌的检测引物及检测试剂盒。

背景技术：

化脓隐秘杆菌(trueperellapyogenes)是革兰氏阳性短棒状杆菌，是牛、羊和猪等重要经济动物的条件性致病菌，常寄生于上呼吸道和消化道的黏膜处，可引起多种器官和黏膜的化脓性感染，给养殖业造成较大的经济损失。多数情况下，化脓隐秘杆菌感染造成慢性消耗性疾病；感染严重时，常因脓毒败血症引起死亡。此外化脓隐秘杆菌可以引起羚羊、骆驼、狗、猫、象、瞪羚、非洲大羚、鹦鹉、马、鹿、驯鹿、火鸡等多种动物感染。

化脓隐秘杆菌常与其它病原菌混合感染。本实验室对从重庆市荣昌、永川、江津、石柱、垫江、武隆、酉阳、丰都等区县养殖场的山羊淋巴结炎等化脓性样本进行细菌分离鉴定，检出率最高的是球菌，主要是酿脓葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌等，其次是杆菌，杆菌中主要有溶血性曼氏杆菌、奇异变形杆菌、化脓隐秘杆菌、伪结核棒状杆菌等。这些细菌往往有较宽的耐药谱，如何对山羊化脓性感染的病原体进行快速鉴定，为有针对性用药提供技术支撑，是急需解决的问题。

已有文献公布了化脓隐秘杆菌的pcr检测方法，常用的靶基因主要有16srrna基因和溶血素plo基因。16srrna基因虽被用来作为细菌种属鉴定的分子靶标，但在亲缘关系近的细菌间常会交叉反应，作为诊断、检测靶基因往往会出现假阳性结果，还需要对所得产物进行序列测定和序列比对，以进一步鉴定病原体。溶血素plo是化脓隐秘杆菌主要的毒力因子之一，所有的化脓隐秘杆菌分离株均存在plo基因，是常用检测靶基因。在ncbi上进行blast搜索发现，plo基因在化脓隐秘杆菌不同分离株中相对保守，同源性高于96％，与其它细菌无同源性；plo蛋白质在化脓隐秘杆菌不同分离株中的同源性高于98％，与其它细菌的同源性低于67％。

本实验在检测山羊化脓性样本过程中发现，基于化脓隐秘杆菌溶血素plo基因的建立的pcr检测方法最易与伪结核棒状杆菌发生交叉反应，从两种细菌dna中扩增得到的片段大小往往也相近，不易区分。

发明cn103937889b根据plo基因建立的灵敏度更高的环介导等温扩增方法(lamp)来检测化脓隐秘杆菌。相对pcr方法来说，用lamp方法检测优点很明显，不需要昂贵的pcr仪、检测灵敏度高、特异性强、结果可视化等；用lamp方法检测缺点也很明显，核酸提取、试剂加取需要洁净度、封闭的空间以防污染，试剂成本高，操作步骤多等。基层兽医站等机构现阶段已配备了pcr仪、电泳仪等设备，但基本没有配备高洁净度的实验室或降低气溶胶产生的独立空间。

为此，我们基于plo基因建立了常规pcr检测方法并组成试剂盒，所建立的pcr方法具有特异性高、灵敏度高、耗时短的优点。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种化脓隐秘杆菌pcr检测用引物对，其特异性强，能够避免与伪结核棒状杆菌等常见细菌的交叉反应。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

上述用于化脓隐秘杆菌pcr检测的引物对为上游引物f1和下游引物r1，f1的序列为seqidno:1所示，r1的序列为seqidno:2所示。

本发明设计的强特异性引物是实现所述目的的关键因素，为了克服化脓隐秘杆菌pcr检测的假阳性，本发明从plo基因中搜索引物序列，从中选择了4对理想引物对f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4(seqidno:1-8)，分别扩增化脓隐秘杆菌、伪结核棒状杆菌、酿脓葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、溶血性曼氏杆菌、奇异变形杆菌、明串球菌、肠球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、类芽孢菌等12种细菌，只有f1/r1能特异性检测化脓隐秘杆菌。并对培养物和临床样品的共300条f1/r1pcr扩增产物进行测序，blast分析结果均为化脓隐秘杆菌plo基因，保证了方法和试剂盒检测结果的可靠性。

用于设计引物的参考序列为山羊化脓隐秘杆菌重庆分离株2012cq-zsh基因组(genbank登录号cp012649)序列中的plo基因序列，序列为seqidno9所示。

本发明的目的之二在于提供一种基于目的一的引物对制成的化脓隐秘杆菌pcr检测试剂盒，其特异性强、敏感性高、检测准确、耗时短、有效。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

上述pcr检测试剂盒包括：f1和r1各100μl、2×pcrmix1.25ml、阳性对照一支、阴性对照一支和超纯水2.5ml。

作为优选的方案，上述2xpcrmix由2×pcrmix由3mmol/lmgcl2，100mmol/lkcl，各500μmol/ldntp，20mmol/ltris-hcl(ph8.3)及0.2u/μltaq聚合酶组成。

阴性对照(negativecontrol)和阳性对照(positivecontrol)是针对“预期结果”而说的。凡是肯定出现预期结果的组，为阳性对照组。凡是肯定不会出现预期结果的组，为阴性对照组。

作为优选的方案，上述阳性对照为化脓隐秘杆菌灭活冻干粉或化脓隐秘杆菌的pcr产物。

作为优选的方案，上述阴性对照为超纯水或细菌灭活冻干粉，所述细菌为伪结核棒状杆菌、酿脓葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、溶血性曼氏杆菌、奇异变形杆菌、明串球菌、肠球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、类芽孢菌的一种或多种。

进一步，优选地，阴性对照为伪结核棒状杆菌、酿脓葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、溶血性曼氏杆菌、奇异变形杆菌、明串球菌、肠球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和类芽孢菌的混合物灭活冻干粉。以细菌灭活冻干粉作为试剂盒中的阴性对照可直观的观察引物效果，将化脓隐秘杆菌与其他11种细菌进行区分。

本发明的目的之三在于提供一种基于目的二化脓隐秘杆菌pcr检测试剂盒的检测方法，其操作简单，pcr耗时较短且准确度高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

上述化脓隐秘杆菌pcr检测方法包括以下步骤：

1)提取dna：提取待检样品和/或阴性、阳性对照的dna备用；

2)基因扩增：将步骤1)提取的dna加入2-6任一项的检测试剂盒中，对其进行pcr扩增；

3)检测：对dna扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

作为优选的方案，步骤1)中所述待检样品为细菌纯培养物、动物组织或脓液。

细菌培养物可使用细菌dna提取试剂盒提取dna以用于pcr检测，也可直接采用煮沸法制备细菌dna以用于pcr检测。煮沸法制备细菌dna方法为：取1ml菌液离心12000×g离心1min弃上清，加入100μl去离子水以悬浮菌体，沸水浴10min，冷却后12000×g离心10min，取上清用于pcr检测。组织或脓液dna可使用组织dna提取试剂盒提取，也可将组织或脓液研磨液接种，待菌液浑浊后按煮沸法制备细菌dna以用于pcr检测。组织或脓液研磨液接种处理方法为：无菌条件下取有化脓病灶的组织或脓液0.1～1g，置无菌匀装器中匀浆，取50μl匀浆液加入到含10％胎牛血清的tsb培养基中，37℃培养至浑浊，去菌液按上述煮沸法制备细菌dna以用于pcr检测。

作为优选的方案，步骤2)所述pcr扩增过程包括：

94℃2min；94℃30s，60℃30s，72℃15s，30个循环；72℃3min。

本发明的有益效果在于：本发明提供的用于检测化脓隐秘杆菌的引物对或试剂盒具有以下优点：(1)基层常规动物疫病诊断实验室的仪器、条件可满足检测需求；(2)特异性高，能避免与伪结核棒状杆菌等脓性样品中常见细菌的交叉反应，提供由伪结核棒状杆菌等常见反应交叉细菌混合物作为阴性对照；(3)灵敏度高，最低能检出1×10^-3ng/μl化脓隐秘杆菌基因组dna；(4)pcr产物大小为264bp，条带易于与引物二聚体区分，目标条带清晰、无杂带；(5)耗时短，pcr反应耗时1小时。

附图说明

图1为f1/r1引物对的pcr检测结果。(m：markerdl2000；1：化脓隐秘杆菌固体培养物；2：化脓隐秘杆菌液体培养物；3：肺脏组织；4：淋巴结组织；5：脓液；6：阳性对照；7-13：伪结核棒状杆菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、类芽孢杆菌、酿脓链球菌、明串球菌、大肠杆菌、肠球菌；14：阴性对照)

图2为f2/r2引物对的pcr检测结果。(m：markerdl2000；1：化脓隐秘杆菌固体培养物；2：化脓隐秘杆菌液体培养物；3：肺脏组织；4：淋巴结组织；5：脓液；6：阳性对照；7-13：伪结核棒状杆菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、类芽孢杆菌、酿脓链球菌、明串球菌、大肠杆菌、肠球菌；14：阴性对照)

图3为f3/r3引物对的pcr检测结果。(m：markerdl2000；1：化脓隐秘杆菌固体培养物；2：化脓隐秘杆菌液体培养物；3：肺脏组织；4：淋巴结组织；5：脓液；6：阳性对照；7-13：伪结核棒状杆菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、类芽孢杆菌、酿脓链球菌、明串球菌、大肠杆菌、肠球菌；14：阴性对照)

图4为f4/r4引物对的pcr检测结果。(m：markerdl2000；1：化脓隐秘杆菌固体培养物；2：化脓隐秘杆菌液体培养物；3：肺脏组织；4：淋巴结组织；5：脓液；6：阳性对照；7-13：伪结核棒状杆菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、类芽孢杆菌、酿脓链球菌、明串球菌、大肠杆菌、肠球菌；14：阴性对照)

图5为f1/r1引物对pcr敏感性试验结果。(m：markerdl2000；1：1000ng/μl；2：1000×10^-1ng/μl；3：1000×10^-2ng/μl；4：1000×10^-3ng/μl；5：1000×10^-4ng/μl；6：1000×10^-5ng/μl；7：1000×10^-6ng/μl；8：1000×10^-7ng/μl；9：1000×10^-8ng/μl；10：1000×10^-9ng/μl；11：阴性对照)

图6为应用f1/r1引物对检测临床样品的pcr结果。(m：markerdl2000；1：阳性对照；2：阴性对照；3-7：临床样品)

具体实施方式

以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

1.菌株及样品

化脓隐秘杆菌、伪结核棒状杆菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、类芽孢杆菌、酿脓链球菌、明串球菌、肠球菌、大肠杆菌、肠球菌等均由本实验室分离、鉴定及保存。确诊为化脓隐秘杆菌感染的小鼠肺脏组织、淋巴结组织、脓液由本实验室攻毒、鉴定及保存。

2.试剂

液体tsb培养基:称取40gtsa粉末，加入950ml去离子水，经121℃灭菌15分钟，冷却至50℃左右，加入50ml新生牛血清，充分摇匀后配制而成。

固体tsb培养基:称取40gtsa粉末、17g琼脂粉，加入950ml去离子水，经121℃灭菌15分钟，冷却至50℃左右，加入50ml新生牛血清，充分摇匀后配制而成。

pcrmix、细菌dna提取试剂盒、裂解液、蛋白酶k、tris饱和酚、氯仿等。

实施例1

1.dna模板的制备

①液体培养物:取1ml菌液离心12000×g离心1min弃上清，加入100μl去离子水以悬浮菌体，沸水浴10min，冷却后12000×g离心10min，取上清作为模板。

②固体培养物:刮取化脓隐秘杆菌纯培养物，悬浮于加入100μl去离子水中，沸水浴10min，冷却后12000×g离心10min，取上清作为模板。

③肺脏组织、淋巴结组织、脓液:取样品加入pbs研磨，室温孵育10min，5000r/min，取500μl上清，加入50μl10％sds溶液和10μl20μg/ml的蛋白酶k，56℃水浴2h，加入500μltris饱和酚，充分混匀后，12000×g/min离心10min，取上清，加入等量的氯仿：异戊醇(24：1)，充分混匀后12000×g/min离心10min，取上清加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min，12000×g/min离心10min，弃上清，加入70％乙醇冲洗沉淀，弃乙醇，加入20μl灭菌去离子水溶解沉淀，-20℃保存作为模板。

2.引物设计

根据化脓隐秘杆菌重庆分离株2012cq-zsh基因组(genbank登录号cp012649)中的plo基因序列，采用primer-blast方法搜索引物，从候选引物中筛选4对引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1及seqidno:1-8。

表1pcr引物对序列

3.pcr扩增

将上述提取的dna模板用上述引物进行pcr扩增，阴性对照为超纯水，pcr反应体系为20μl，反应体系见表2。

表2pcr反应体系

pcr反应参数为：

94℃2min；94℃30sec，60℃30sec，72℃15sec，30循环；72℃3min；室温保存。

4.pcr产物检测及结果分析

取5μlpcr扩增产物加入加样孔，用1×tae缓冲液作为电泳液，在恒压120v下进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，电泳20min后将凝胶置于凝胶成像仪中拍照以观察pcr结果。回收阳性条带，将其克隆至pmd18-t，转化如dh5α，挑选阳性克隆对其中的插入片段进行序列测定，在ncbi上进行blst搜索以进行同源性比对。

试验结果如图1-4所示，4对引物均能从化脓隐秘杆菌培养物、确诊含有化脓隐秘杆菌的肺脏组织、淋巴结组织、脓液中特异性扩增出与预期大小相符的目的条带。序列测定和序列分析结果显示，所得序列与化脓隐秘杆菌plo基因的同源性高于>92％，与其他细菌无同源性，表明序列是化脓隐秘杆菌plo基因。

5.pcr的特异性试验

培养伪结核棒状杆菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、类芽孢杆菌、酿脓链球菌、明串球菌、肠球菌、大肠杆菌、肠球菌、溶血性曼氏杆菌、沙门氏菌等细菌，取1ml菌液离心12000×g离心1min弃上清，加入100μl去离子水以悬浮菌体，沸水浴10min，冷却后12000×g离心10min，取上清作为模板。

将上述提取的dna模板用上述引物进行pcr扩增，pcr反应体系为20μl，反应体系见表2。循环体系为：94℃2min；94℃30sec，60℃30sec，72℃15sec，30循环；72℃3min；室温保存。取5μlpcr扩增产物加入加样孔，用1×tae缓冲液作为电泳液，在恒压120v下进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，电泳20min后将凝胶置于凝胶成像仪中拍照以观察pcr结果。

试验结果如图1-4所示，只有f1/r1引物对能从化脓隐秘杆菌dna模板中扩增出特异条带，而未从伪结核棒状杆菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、类芽孢杆菌、酿脓链球菌、明串球菌、肠球菌、大肠杆菌、肠球菌、溶血性曼氏杆菌、沙门氏菌等细菌dna中扩增条带，表明f1/r1引物对能准确检测化脓隐秘杆菌，而区分其它细菌。

6.pcr敏感性试验

将新鲜化脓隐秘杆菌单菌落接种于液体tsb培养基中，37℃培养48h，收集菌体，用pbs洗涤菌体3次，细菌dna提取试剂盒提取dna，测定核酸质量，调整浓度为1000ng/μl，依次稀释成1000×10^-1ng/μl、1000×10^-2ng/μl、1000×10^-3ng/μl、1000×10^-4ng/μl、1000×10^-5ng/μl、1000×10^-6ng/μl、1000×10^-7ng/μl、1000×10^-8ng/μl、1000×10^-9ng/μl。以上述10个.稀释度的dna溶液为模板，按表2加入各组分进行pcr扩增，循环体系为：94℃2min；94℃30sec，60℃30sec，72℃15sec，30循环；72℃3min；室温保存，以检测该pcr方法的敏感性。

试验结果如图5所示，模板浓度为1000×10^-6ng/μl时能出现清晰可见的目的条带，模板浓度小于1000×10^-6ng/μl时无明显条带出现，因此准确检测化脓隐秘杆菌的最低模板浓度为1000×10^-6ng/μl，即1×10^-3ng/μl，使用本发明提供的试剂盒检测待检样品，可准确检测化脓隐秘杆菌dna不低于1×10^-3ng/μl。

本发明检测模板dna浓度下限为1×10^-3ng/μl，证明本发明化脓隐秘杆菌检测方法的敏感性高。

实施例2

使用实施例1特异性好的f1/r1引物对，检测临床样本，样本包括组织、脓液等。

1.dna制备

取样品加入pbs研磨，室温孵育10min，5000r/min，取500μl上清，加入50μl10％sds溶液和10μl20μg/ml的蛋白酶k，56℃水浴2h，加入500μltris饱和酚，充分混匀后，12000×g/min离心10min，取上清，加入等量的氯仿：异戊醇(24：1)，充分混匀后12000×g/min离心10min，取上清加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min，12000×g/min离心10min，弃上清，加入70％乙醇冲洗沉淀，弃乙醇，加入20μl灭菌去离子水溶解沉淀，-20℃保存以备pcr检测。

向阳性对照化脓隐秘杆菌灭活冻干粉和阴性对照伪结核棒状杆菌等细菌混合物灭活冻干粉中加入500μl去离子水，同组织等样品dna制备方法一样制备对照dna。

2.pcr检测

将上述提取的dna模板用上述f1/r1引物对进行pcr扩增，阴性对照为伪结核棒状杆菌dna，pcr反应体系为20μl，反应体系见表3。

表3化脓隐秘杆菌pcr检测反应体系

循环体系为：94℃2min；94℃30sec，60℃30sec，72℃15sec，30循环；72℃3min；室温保存。

3.pcr结果分析

取5μlpcr扩增产物加入加样孔，用1×tae缓冲液作为电泳液，在恒压120v下进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，电泳20min后将凝胶置于凝胶成像仪中拍照以观察pcr结果。对阳性目的条带进行序列测定与序列分析。

试验结果如图6所示，运用基于f1/r1引物对建立的pcr方法能从临床样本中扩增出与预期大小相符的目的条带。300条(其中280条为从临床样本中扩增所得)阳性检测条带的序列测定和序列分析结果显示，所得序列是化脓隐秘杆菌plo基因。结果表明本发明所建立的试剂盒及pcr方法能有效地从临床待检样本中检测化脓隐秘杆菌。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110>重庆市畜牧科学院

<120>一种化脓隐秘杆菌的检测引物及检测试剂盒

<160>9

<170>patentinversion2.1

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工设计引物f1

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<212>dna

<213>人工设计引物r4

<400>8

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<210>9

<211>1605

<212>dna

<213>化脓隐秘杆菌（trueperellapyogenes）的plo基因序列

<400>9

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