本发明属于生物工程领域，具体地，本发明涉及一种调节基因在抑制微生物的生物被膜(biofilm)中的应用。通过构建融合报告基因系统筛选一种小分子化合物激活筛选标记基因，使标记基因的表达提高，从而能够抑制生物被膜合成。对于由铜绿假单胞菌引起多重耐药性及生物被膜引发食源性疾病方面的具有重要意义。
背景技术：
目前院内感染治疗方法主要是应用抗生素杀死或者抑制病原菌的生长。但是铜绿假单胞菌自身具有一些耐药机制，包括低渗透性的外膜、不同外排泵组成型基因的表达和抗生素失活酶的产生(如头孢菌素酶)等，同时也能够获得一些抗性基因(如β-内酰胺酶的基因、编码失活氨基糖苷类抗生素的酶的基因以及修饰靶位的基因)、降低表达一些孔蛋白或者突变喹诺酮靶位基因等，所以铜绿假单胞菌对临床应用的抗生素都产生了耐药性，而且耐药程度日趋严重，多重耐药已成为当今医药界的一个世界性难题。美国传染病协会抗菌工作组(antimicrobialavailabilitytaskforceoftheinfectiousdiseasessocietyofamerica)重点考虑提高耐药菌株的治疗水平。世界卫生组织还设立了专门机构来协调各国对细菌耐药性的研究与监测。
生物被膜作为一种高度组织群体，具有高度的功能性、结构性和协调性。生物被膜菌生物学特性与浮游菌具有很大的区别，较浮游菌相比生物被膜菌的耐药性明显增加，有更强的环境适应能力；因此，临床上与细菌生物被膜有关的许多感染性疾病现在都难以治愈。目前，国内外研究表明导致生物被膜菌耐药的因素很多，主要包括：①在生物被膜形成的早期，特定的细菌基因表达使得生物被膜菌耐药性较浮游菌明显增加；②生物被膜菌分泌大量胞外基质，这些基质作为屏障，降低了抗生素的渗透性，导致生物被膜菌不易被杀灭；③成熟的生物被膜生成后，自内向外菌体密度增加，形成了氧浓度和营养成分梯度，生物被膜菌的生长速度和代谢活性减慢；④表型变异的产生使生物被膜内细菌对多种抗生素产生耐药[8]。所以，生物被膜在由铜绿假单胞菌引起的持续性感染以及慢性感染中发挥重要作用，如何有效抑制生物被膜的形成对治疗铜绿假单胞菌感染起重要作用。
食品安全是卫生部门十分重视的问题，由微生物引起的污染问题繁多。生物被膜的形成对工业环境具有严重的影响，一方面，生物被膜能引起一系列的工业运作问题，例如，降低热量传递、堵塞管，堵塞过滤器，并造成表面损坏。另一方面，生物被膜极易形成污染源，特别是在食品工业中，细菌附着到食物接触面，为细菌污染提供了一个及其丰富的病原体污染源，对人类健康带来不可避免的风险。对食品工业中生物被膜的微生物组成分析表明，混合生物被膜包括病原菌和腐败菌，这些微生物可以通过以下几个来源，如水、生冷类食品和动物，散布于食品工业并长时间吸附在设备表面。因此，有效的抑制生物被膜的形成对食品安全问题也起着十分重要的作用。
本发明通过构建tn5g转座子文库发现一株生物被膜产量增加的突变株，并通过反向pcr鉴定tn5g插入位点，分析其突变基因，并利用互补实验证实了该基因调节生物被膜合成。通过该基因构建一种基因报告系统筛选出小分子化合物，这种小分子化合物能够激活标记基因的表达，从而能够从基因水平对生物被膜的合成阶段进行抑制，有助于解决由生物被膜引起的持续性感染、抗生素耐药性、以及由生物被膜引起的食源性感染等问题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供能够抑制铜绿假单胞菌生物被膜合成的基因，以该基因作为筛选标记，筛选能够促进该基因表达的小分子化合物，通过该基因表达的增加从而使合成生物被膜的能力降低。本发明通过对生物被膜合成相关基因表达的研究，能够更好地了解bsra与生物被膜合成相关基因相互作用的分子机制，为解决由生物被膜引起的高度耐药性提供理论依据。同时，食品工业中，微生物生物被膜引起食品污染，引发食源性疾病，通过研究该基因抑制生物被膜形成的机制能过更好的解决食品加工行业中微生物生物膜形成机制以及生物被膜的抑制和去除问题。
本发明的技术方案为：
bsra基因作为筛选生物被膜抑制剂标记基因的应用，所述bsra基因如序列1所示。
包含bsra基因的报告基因系统。
而且，所述报告基因为lacz基因。
包含bsra基因的报告基因系统作为筛选生物被膜抑制剂的应用。
包含bsra基因的报告基因系统作为筛选破坏或抑制生物被膜制剂的标记的应用。
包含权利要求1所述基因的载体或微生物。
bsra基因作为标记生物被膜改变的应用。
bsra基因作为在检测中药和/或天然药物和/或化合物药物对生物被膜抑制剂活性标记的应用。
本发明的优点和技术效果如下：
本发明主要鉴定了抑制铜绿假单胞菌生物被膜合成相关基因表达的基因。通过构建菌株pak-ar2的转座子tn5g突变文库，获得一株生物被膜增加的突变株将其命名为p2-7，通过测其生物被膜发现，其形成生物被膜的能力显著性增加。反向pcr鉴定其突变基因为pa2121，通过生物信息学分析发现pa2121编码一dna结合蛋白，属于lysrfamily家族调节因子。构建携带有pa2121基因的重组质粒pxj1601，将其电转入突变株p2-7中，得到p2-7/pxj1601。通过结晶紫染色法分析，pa2121突变后其形成生物被膜的能力增加，通过测定p2-7/pxj1601的生物被膜发现其形成生物被膜的能力回复到野生型状态。因此得到结论突变基因pa2121抑制生物被膜的合成，将其命名为brsa(biofilmsynthesisrepressora)。
为了分析调节因子bsra对生物被膜的调节机制。本发明构建了三种主要成分的四个操纵子pel、psl、algd、algu启动子的融合报告基因，通过接合转移的方法将携带有三种成分的融合报告基因分别转入野生型pak-ar2、突变株p2-7中，通过测定编码β-半乳糖苷酶的活力发现，psl、pel、algu、algd这四种操纵子启动子的表达水平在p2-7和pak-ar2中存在显著性差异。所以，得出结论，突变株p2-7中胞外多糖pel、psl、alginate的产量比野生型pak-ar2高。同时，为了分析基因bsra对生物被膜的抑制作用，将构建的bsra过表达质粒导入生物被膜产量高的菌株中，分别是铜绿假单胞菌pak、临床菌株tj45、tj54，发现bsra过表达后这三株菌生物被膜的产量下降。从而验证了该基因对生物被膜的抑制作用。通过对生物被膜早晚期以及bsra在生物被膜早期、晚期的表达情况分析发现，在早期生物被膜开始增长时，bsra的表达水平高，当生物被膜处于较低增长水平时，bsra的表达水平也处于较低水平。所以，通过以上实验验证并证明了bsra抑制生物被膜的形成及其调节机制。鉴于该基因的抑制作用，本申请以该基作为筛选标记构建新型报告基因系统，筛选小分子化合物通过促进或激活该标记基因的表达来抑制生物被膜的形成。
本发明涉及一种铜绿假单胞菌基因功能及其应用，铜绿假单胞菌的基因bsra是生物被膜合成过程的调节基因，该转录调节因子能够抑制生物被膜的合成，可用于合成促进该基因表达的药物，从而抑制生物被膜合成而降低抗生素耐药性的应用。
本发明通过对生物被膜合成相关基因表达的研究，能够更好地理解bsra与生物被膜合成相关基因相互作用的分子机制，为解决抗生素耐药性提供理论依据。同时，食品工业中，微生物生物被膜引起食品污染，引发食源性疾病，通过研究该基因抑制生物被膜形成的机制能过更好的解决食品加工行业中微生物生物膜形成机制以及生物被膜的抑制和去除问题。
本申请的重要意义在于：该转录调节因子能够抑制生物被膜的合成，通过合成促进该基因表达的药物或者小分子化合物，从而抑制生物被膜合成而降低抗生素耐药性。本发明通过对生物被膜合成相关基因表达的研究，能够更好地了解bsra与生物被膜合成相关基因相互作用的分子机制，为解决由生物被膜引起的高度耐药性提供理论依据。同时，食品工业中，微生物生物被膜引起食品污染，引发食源性疾病，通过研究该基因抑制生物被膜形成的机制能过更好的解决食品加工行业中微生物生物膜形成机制以及生物被膜的抑制和去除问题。
附图说明
图1为生物被膜生产能力分析图；
图2生物被膜合成相关基因psl、pel、algu、algd这四个操纵子启动子的表达水平示意图，其中，图2a为12h的、图2b为24h的，图2c为36h的，图2d为48的；
图3生物被膜早晚期图；
图4bsra表达的时间曲线分析图；
图5过表达bsra对生物被膜的抑制作用。
具体实施方式
以下所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按以上所述而顺畅地实施本发明；但是，凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例。
本发明将基因bsra作为标记基因，构建基因报告系统来筛选促进标记基因表达的小分子化合物的应用。
本发明通过构建菌株pak-ar2的转座子tn5g突变文库，获得生物被膜阳性突变株。反向pcr鉴定突变株的tn5g插入位点，并且通过blastp分析出突变基因。构建基因的表达载体，对相应突变株进行基因功能回复实验，用实验证明该基因是能够抑制生物被膜合成相关基因的表达。该基因可以作为筛选抑制生物被膜合成的小分子化合物的依据，进一步筛选出治疗和防治由生物被膜引起的持续性感染的药物以及能够应用于食品工业中的生物被膜抑制剂。
本申请通过构建tn5g转座子文库发现一株生物被膜产量增加的突变株，并通过反向pcr鉴定tn5g插入位点，分析其突变基因，并利用互补实验证实了该基因调节生物被膜合成。该基因的发现有助于从基因水平解决由于生物被膜引起的持续性感染、抗生素耐药性、以及由生物被膜引起的食源性感染。
本申请用于研究该基因的方法具体步骤如下：
1、材料和方法
菌株和质粒：实验所用菌株及质粒，具体见表1所示，实验所涉及的引物具体见表2所示。
2、转座子文库构建
参照实验方法描述(见[kagamiy，ratliffm，surberm，etal.typeiiproteinseeretionbypseudomonasaeruginosa：genetiesuppressionofaeonditionalmutationinthelikeeomponentxeptbytheeytoplasmieeomponentxepr[j〕.moleeularmierobiology，1998，27(1)：221一233])并做了相应的修改构建耐受噬菌体k5的突变株文库)，
具体如下：将供体菌菌株e.coli/prk2013tn5g和受体菌菌株pak-ar2过夜培养，过夜培养菌液转接到加有相应抗生素的液体培养基扩大培养，即e.coli/prk2013tn5g转接至含有庆大霉素(10μg/ml)液体lb培养基中，pak-ar2转接至含有氨苄青霉素(10μg/ml)的液体lb培养基中，培养10h。菌液以4000rpm/min离心收集菌体，分别用新鲜lb液体培养基洗涤e.coli/prk2013tn5g和pak-ar2菌体3次，以去除残留的抗生素。最后将e.coli/prk2013tn5g和pak-ar2两种菌泥混匀，加入牛肉膏蛋白脉培养基平板，37℃培养9h。用lml液体lb重悬菌泥，加入5ml含有庆大霉素(100μg/ml)、氨苄青霉素(100μg/ml)的噬菌体k5纯裂解液，并置于37℃摇床以220rpm培养4h，以裂解对噬菌体k5敏感的突变株，离心收集菌体，涂于含有庆大霉素(100μg/ml)、氨苄青霉素(100μg/ml)的lb平板，37℃培养12h。对平板上的单菌落进行纯化，对纯化后的单菌落使用双层平板法进一步验证突变株对k5的敏感性。
3、反向pcr鉴定tn5g插入位点
通过苯酚-氯仿抽提法取突变株p2-7的基因组dna，使用限制性内切酶taqi酶切基因组dna，65℃处理4h，用苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)纯化回收酶切产物，用t4dna连接酶将酶切产物在16℃处理12h，使dna片段发生自身环化，以连接产物为模板，根据tn5g的末端反向重复序列设计一对引物otn1(5’gatcctggaaaacgggaaag3’)和otn2(5’ccatctcatcagagggtagt3’)，反向pcr鉴定突变株p2-7基因组内转座子的插入位点，并通过blastn分析插入位点所在的基因。
4、互补实验(complementationexperiment)
我们使用突变基因上游序列1000bp在启动子预测网站(http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测突变基因的启动子区，并且以预测启动子上游500bp序列和终止密码子下游500bp序列利用primerpremier5设计引物，用来扩增突变基因。根据载体pucp20存在的酶切位点和突变基因的序列选择两种限制性内切酶。以铜绿假单胞菌pak的基因组dna为模板，扩增目的基因，回收纯化基因，并用酶切位点对应的限制性内切酶酶切目的基因和pucp20质粒，回收纯化酶切产物，在t4dna连接酶作用下将基因和载体pucp20连接，转化大肠杆菌dh5α，筛选鉴定阳性转化子。将验证正确的重组质粒通过电转化转入突变株p2-7中，用双层平板方法检测转化子是否恢复了对噬菌体的敏感性；用结晶紫染色法检测转化子形成生物被膜的能力是否恢复到野生型状态。
5、生物被膜的测定
首先将过夜培养的菌液按10％的接种量转接到每孔含有180μl新鲜1/3lb的96孔板中，37℃静置培养48h。将96孔板倒置，轻轻甩出孔中菌液，将96孔板缓缓放入静止的蒸馏水中，甩出孔中蒸馏水，以此方法冲洗三次，将孔中多余的蒸馏水甩干，加入200μl的0.1％的结晶紫溶液，染色15min后将孔中的结晶紫甩出，并用蒸馏水冲洗3次，洗去没有结合的结晶紫，甩干孔中的蒸馏水，加入200μl的无水乙醇，然后静置15min充分洗脱生物被膜上结合的结晶紫，将96孔板中溶液转移至新的96孔板中，测定od595吸光值。
6、转录融合报告基因构建及酶活测定
选择生物被膜合成相关操纵子psl、pel、algd、algu，通过fruitfly网站预测四个操纵子基因启动子区域，并分别设计引物扩增启动子区域片段，启动子区域上游用ecori酶切位点，下游用bamhi酶切位点，将pcr扩增片段与pdn19lacω连接转化构建融合报告基因。将构建好的重组质粒通过电转的方式导入到野生菌株pak-ar2、突变株p2-7以及中。按照融合报告基因酶活测定方法，测定四个融合报告基因在两株菌中的β-半乳糖苷酶活性。将构建好的菌株接到5mllb中37℃振荡过夜培养，按3％的接种量转接过夜培养菌液到5ml新鲜lb中，培养至od600＝0.6左右，按照标准的酶活测定方法测定。每个菌株测定三次作为平行。
7、生物被膜早晚期的测定
将菌株ar2、p2-7接到5mllb中37℃振荡过夜培养，按10％的转接量转接过夜菌液到含有1/3lb的96孔板中。静置于37℃培养中，每隔一段时间结晶紫染色法测生物被膜直到测至48h为止。即轻轻倒掉孔中的菌液，并用水反复冲洗两次自然晾干15min。每孔加入200ul的1％结晶紫—3％冰醋酸水溶液染色15min，用水反复冲洗并甩干，每孔加入200μl95％的乙醇，充分溶解结晶紫，并测定波长od595时结晶紫溶液的吸光度。
8、bsra表达的时间曲线
设计引物扩增bsra启动子区域片段，启动子区域上游用ecori酶切位点，下游用bamhi酶切位点，将pcr扩增片段与pdn19lacω连接转化构建融合报告基因。将构建好的重组质粒通过电转的方式导入到野生菌株pak-ar2中。按照融合报告基因酶活测定方法，测定其在48h内酶活的变化情况。
表1菌株和质粒说明
apr，氨节青霉素抗性；gmr，庆大霉素抗性；spr，smr分别表示壮观霉素和链霉素
表2引物序列说明
下划线碱基表示引物酶切位点
9、结果和讨论
(1)生物被膜的测定
筛选得到一株耐受噬菌体k5的突变株，将其命名为p2-7，反向pcr鉴定其突变基因为bsra，通过生物信息学分析发现bsra编码一dna结合蛋白，属于lysrfamily家族调节因子。构建携带有bsra基因的重组质粒pxj1601，将其电转入突变株p2-7中，得到p2-7/pxj1601，通过噬菌体敏感实验观察到p2-7/pxj1601没有恢复对噬菌体k5敏感性。通过结晶紫染色法分析，bsra突变后其形成生物被膜的能力增加，构建重组质粒pxj1601，将其电转入突变株p2-7中，得到回复株p2-7/pxj1601，通过测定p2-7/pxj1601的生物被膜发现其形成生物被膜的能力回复到野生型状态(图1)。
(2)bsra与生物被膜合成相关基因的表达相关
铜绿假单胞菌在生物被膜形成过程中主要产生三种胞外多糖，分别是藻酸盐(alginate)、pel(pellicleformation)、psl(polysaccharidesynthesislocus)，psl操纵子包括15个基因(psla–pslopa2231-pa2245)，这15个基因编码的蛋白用于合成胞外多糖psl，pel操纵子包含7个基因(pela-pelf，pa3058-pa3064)，这7个基因用于合成胞外多糖pel。藻酸盐主要由algd基因簇(algdalg8alg44algkalgealggalgxalglalgialgfalga)中的基因编码的酶合成的，同时algu基因簇(algu、muca、mucb、mucc、mucd)中的基因主要用于调节硅藻酸盐的合成。为了分析生物被膜这三种主要成分的合成基因在p2-7中的表达情况，将三种主要成分的四个操纵子的启动子构建融合报告基因，通过接合转移的方法将携带有三种成分的融合报告基因分别转入野生型pak-ar2、突变株p2-7、中，通过测定在12h、24h、36h、48h时编码β-半乳糖苷酶的活力发现，psl、pel、algu、algd这四个操纵子启动子的表达水平在p2-7和pak-ae2中存在显著性差异(图2a为12h的、图2b为24h的，图2c为36h的，图2d为48的)。所以，得出结论，突变株p2-7中胞外多糖pel、psl、alginate的产量比野生型pak-ar2高，p2-7中三种胞外多糖均增加。
(3)过表达基因bsra抑制生物被膜的合成
与野生pak-ar2相比突变株p2-7的生物被膜的能力增加，推测突变基因bsra可能抑制生物被膜的形成。为了验证bsra对生物被膜确实存在一定的抑制作用，将bsra在pak和临床菌株tj45、tj54中过表达后，检测其形成生物被膜的能力是否下降。将bsra在pak、tj45、ti54中过表达后，pak、tj45、ti54形成生物被膜的能力降低(图3)。由此推断bsra对生物被膜的形成起到一定的抑制作用。
(4)bsra对早期生物被膜的影响。
有研究表明，pel、psl在生物被膜早期微型菌落开始形成时便产生，并且pel、psl对生物被膜成熟期蘑菇型大菌落结构的形成起重要作用。实验发现与野生ar2相比p2-7形成生物被膜的能力增加，为了研究bsra对生物被膜早晚期的影响作用。通过结晶紫染色法分别测6-48h内p2-7与ar2生物被膜的变化情况，发现在第10h时p2-7形成生物被膜的能力就显著性高于ar2(图4)，所以，推测bsra对生物被膜早期有影响。
(5)bsra表达的时间曲线
将构建的bsra启动子的融合报告基因导入pak-ar2后，分别测其3h、6h、8h、10h、12h、24h、48h的酶活发现，在生物被膜形成初期，生物被膜开始增多时bsra的表达水平明显增高，当生物被膜的增长缓慢时，bsra的表达水平也处于较低水平(图5)。
(6)构建bsra融合报告基因系统及筛选化合物
通过fruitfly网站预测bsra启动子区域，并分别设计引物扩增启动子区域片段，启动子区域上游用ecori酶切位点，下游用bamhi酶切位点，将pcr扩增片段与质粒pdn19lacω连接转化构建融合报告基因。将构建好的重组质粒通过电转的方式导入到野生菌株pak-ar2中。将一些小分子化合物按照一定的浓度加入液体lb中与含有bsra融合报告基因系统的pak-ar2菌株共同培养，每间隔一段时间测菌株酶活情况，通过测定的酶活高低来反应bsra基因表达水平的高低，以此来筛选能够影响bsra表达的小分子化合物。
10、本申请的重要意义
人们发现生长于生物被膜中的细菌，无论其形态结构、生理生化特性、对抗菌药物的敏感性等都与普通浮游生长的细菌显著不同，致病特点也不同。生物被膜可以保护细菌逃逸宿主免疫和抗菌药物的杀伤作用。即使抗菌药物达到对该菌mic的100倍以上，生物被膜中的细菌仍能存活而不被杀灭，从而产生对抗菌药物的高度耐药性，导致临床感染的难治性。
此外，有了生物膜的保护，细菌就能抵抗清洗和消毒因子，降低清洗和消毒的效果，给食品生产加工企业污染埋下隐患。食品工业中食源性病原菌和腐败菌形成的生物被膜不仅可以通过残留、接触的方式引起各种污染，还可通过散播微生物或微生物团形成的气溶胶的方式污染整个生产环境，而且这种污染是随机性的，在生产过程中隐蔽性强、易被忽视且很难控制和防范。
本申请中发现的基因bsra能够从基因水平抑制生物被膜的合成，该基因通过抑制生物被膜合成相关基因的表达，在生物被膜形成初期时便对生物被膜合成基因pel、psl的表达起到抑制作用。从而使最终生物被膜的产量显著性降低。该转录调节因子能够抑制生物被膜的合成，通过合成促进该基因表达的药物或者小分子化合物，从而抑制生物被膜合成而降低抗生素耐药性。本发明通过对生物被膜合成相关基因表达的研究，能够更好地了解bsra与生物被膜合成相关基因相互作用的分子机制，为解决由生物被膜引起的高度耐药性提供理论依据。同时，食品工业中，微生物生物被膜引起食品污染，引发食源性疾病，通过研究该基因抑制生物被膜形成的机制能过更好的解决食品加工行业中微生物生物膜形成机制以及生物被膜的抑制和去除问题。
序列1：bsra序列表
atgaagctgaacttgcagcagctcgacctcaacctgcttctggtcttcgatgccctgatgcgcgaacgcaacctgtcgcgcgcggcgatccgcctgcatc
gcagccagccggcggtgagcaacgccctcgcccgcctgcgcgaacagctcgaccagccgctgttccggcgcgccgccaagggcctggaacccaccgccgc
cgccctcgccctgtacgtgccggtgcgccaggccctgcatctgctgcaggccggccttggctcccaggaaaccttcgatccgcacactgcgcggaccttt
cgcctgacgatgaacgactatgcccagttgcgcctgctgccgggcctggtgacccgcctgaagaccctggccccgcgggtgacgctggaggtacgtcccg
acgaaggcgcctcgatcccggcgcaactggccagcggcgaactcgacctggcgatcgactacctgtacttcgacgagcccgagctggcctaccggccggt
cggcgaggaacgcctggtggtgatcggccggcagggccatccggccttccgcggcggcctcgaccgcgcggcctacgaggccgcgcagcacgtctcgatc
ctgccgcgggtcgggcgcggcagtccgctggagatcgtcctcggctcggccagggtgcagcgccaggtgcaattgctggtgcctcactacctgaccatcc
cggccatcgtcgccagcaccgagctgctcggcaccgtgccacgccgcctggccgagcgcttcgccggcagccatggtttgcaactggcggacgtcccctt
cgagatggccccggtgcaggtcaacctgatctggcatcgccagcaggaagcgacgcccggcctgcaatggctacgcgagcagatcgtgcagatcgaacagggctga。