本发明涉及分子生物学实验技术领域，特别是涉及一种从火龙果茎中提取高质量dna的方法。
背景技术：
火龙果又称红龙果、龙珠果、仙蜜果、玉龙果，仙人掌科、量天尺属植物；火龙果风味独特，营养丰富，含有一般植物少有的植物性白蛋白及花青素，丰富的维生素和水溶性膳食纤维，还含有黄酮类、植物甾醇类化合物、植物多糖等活性物质，对人体健康有非常好的功效；果、花、茎皆可食用和观赏，是集果树、花卉、蔬菜特点于一体的特色植物，经济、生态效益高。关于火龙果起源到目前为止尚未有一致的说法，而我国最早是20世纪90年代在台湾开始引种，后来慢慢地发展到了大陆地区，种植面积也不断扩大，但世界范围内收集和保存的火龙果种质资源非常少，据dwivedi等统计288个世界范围内的种质库(圃)，一共就134份火龙果种质资源；火龙果研究的起步较晚，种质资源鉴定、评价工作较为落后，还没有形成较为统一的种质资源描述规范和数据标准，主要工作都集中营养成分和品质的研究上，在抗性方面的研究较少(田新民等.火龙果研究现状.北方园艺.2015.)。
火龙果具有很强的抗逆性，研究其抗逆机制将有助于了解植物的抗逆机理，同时进行种质资源鉴定将为火龙果育种提供理论指导，火龙果dna的提取是这一研究的基础。火龙果茎中含有多糖、植醇、维生素e、白蛋白及其他次生代谢物质等粘性物质，其茎中的粘性非常大，且茎越老其粘性就越大，相应的dna提取难度就越大；对于火龙果嫩茎dna提取目前已有多个方法可以提取，如微量ctab法(余志雄等.火龙果总dna提取方法比较研究.中国农学通报.2010.)及一些dna提取试剂盒；经实验研究用一些dna提取试剂盒提取火龙果老茎dna时会引起柱子堵塞。而火龙果大多都是以无性繁殖为主，通过枝条繁殖第二年才会开花结果，再经种子萌发长出小苗又需半个月到一个月的时间，故通过嫩茎提取火龙果dna会耗费大量的时间，所以研究一种能够提取火龙果老茎中的dna的方法具有重要的意义。
技术实现要素：
基于此，本发明提供了一种从火龙果茎中提取高质量dna的方法。
具体技术方案如下：
一种从火龙果茎中提取dna的方法，包括以下步骤：
(1)取火龙果茎，去除茎上的刺、中间髓及90％以上的肉质部分，再用液氮磨细后加入洗涤液i，震荡混匀，静置，离心，得第一沉淀；所述洗涤液i为灭菌后的蒸馏水；
(2)将所述第一沉淀用洗涤液ii进行洗涤，以完全除去粘液，得第二沉淀；所述洗涤液ii为包括以下组分的混合水溶液：180-220mmol/ltris.cl、38-42mmol/ledta-2na、4.5-5.5mol/lnacl，ph7.8-8.2；
(3)向所述第二沉淀中加入ctab抽提液以抽提dna，离心，吸取上清液，得第一溶液；
(4)在所述第一溶液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇的混合溶液，以使蛋白质变性，再离心除去变性后的蛋白质，吸取上清液，得第二溶液；
(5)在所述第二溶液中加入等体积的氯仿/异戊醇的混合溶液，摇匀，静置至分层，离心，吸取上清液，得第三溶液；
(6)在所述第三溶液中加入等体积的异丙醇，冷冻静置，离心，得第三沉淀；
(7)用乙醇水溶液洗涤所述第三沉淀，将洗涤后的第三沉淀置于室温条件下自然风干，再用rnase水溶解，即得。
火龙果茎(尤其是老茎)中间肉质部分含粘性物质较多，粘性大，本发明的提取方法先去除这部分再研磨，可以保证经洗涤液i洗后有足够多的沉淀可用；本发明的提取方法在研磨时无需加pvpp等强还原剂物质，保证实验操作的无毒安全；本发明的提取方法经洗涤液i洗后的样品再用洗涤液ii洗，这样能够很好的去除粘性物质，同时降低了洗涤液ii的使用量，经两步洗涤后就可以把一个粘性大的样品转变成一个粘性极小的样品，极大地降低了粘性物质对dna提取的影响；再结合其它步骤和条件使本发明提取到的dna不含粘性杂质、质量好、得率高。
在其中一些实施例中，所述火龙果茎与所述洗涤液i的配比为1g:45-90ml。
优选地，所述洗涤液i在液氮磨细后的样品化冻之前加入。
优选地，步骤(1)中所述静置的时间为8-12min，所述离心的条件包括5000-8000g离心8-12min。
优选地，所述用洗涤液ii进行洗涤的次数为3-6次，每次洗涤液ii的用量与所述火龙果茎的配比为2-4ml:1g。
优选地，步骤(2)中的每次洗涤包括如下步骤：在沉淀中加入洗涤液ii后震荡混匀，静置4-6min，然后在10000-13000g的条件下离心2-6min。
优选地，所述ctab抽提液为包括以下组分的混合水溶液：1.8-2.2％(m/v)ctab、98-102mmol/ltris.cl、19-21mmol/ledta-2na、1.3-1.5mol/lnacl，ph7.8-8.2。ctab抽提液中无需添加β-巯基乙醇，进一步降低了实验的毒性。
优选地，所述ctab抽提液与所述火龙果茎的配比为1.2-2.6ml:1g。以该配比添加ctab抽提液即可有效的将dna提取出来，如果再加多会造成试剂的浪费，加少会减少最后的dna得率。
优选地，所述抽提dna的抽提条件包括：将加有ctab抽提液的所述第二沉淀在60-70℃的条件下裂解30-60min，期间每8-12min颠倒混匀一次。
优选地，步骤(3)中所述离心的条件包括：10000-13000g常温离心8-12min。
优选地，所述第一溶液的体积比所述ctab抽提液的体积少250-350μl。
优选地，所述第二溶液的体积比所述第一溶液和所述酚/氯仿/异戊醇的混合溶液的总体积少250-350μl。
优选地，所述第三溶液的体积比所述第二溶液和所述氯仿/异戊醇的混合溶液的总体积少250-350μl。
每次离心后吸取上清液时都保留最下面的250-350μl左右的上清液不吸取，这样可以在保证dna得率的同时，极大地保证不吸到下层杂质。
优选地，所述酚/氯仿/异戊醇的混合溶液为体积比为25：24：1的的tris平衡酚、氯仿和异戊醇的混合溶液。
优选地，所述氯仿/异戊醇的混合溶液为体积比为24：1的氯仿和异戊醇的混合溶液。
优选地，步骤(4)包括：在所述第一溶液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇的混合溶液后震荡混匀，再置于摇床上轻摇2-3h，以使蛋白质充分变性，再静置4-6min，待分层后在10000-13000g的条件下常温离心8-12min，，吸取上清液，得第二溶液。加入酚/氯仿/异戊醇的混合溶液后置于摇床上2-3h，在该条件下能更充分地除去蛋白质。
优选地，步骤(5)中所述离心的条件包括10000-13000g常温离心8-12min。
优选地，步骤(6)中所述冷冻静置的条件包括：-18～-22℃静置25-30min。该条件下能更充分的将dna沉淀出来，时间过短沉淀不充分，时间过长会引起杂质同时沉淀。
优选地，步骤(6)中所述离心包括：在10000-13000g，3-5℃的条件下离心12-18min。
优选地，所述乙醇水溶液的体积浓度为72-78％，所述rnase水的终浓度为45-55μg/ml。使用浓度为45-55μg/ml的rnase水溶解，能够保证在去除dna中rna的同时不影响下游的实验，rnase水的浓度更优选为50μg/ml。
本发明的从火龙果茎中提取高质量dna的方法具有以下优点和有益效果：
本发明的提取方法能够从粘性超高的火龙果茎(老茎和嫩茎)中提取出不含粘性杂质、质量好、得率高的dna，该方法可适用于火龙果老茎中的dna的提取，能够解决“火龙果老茎粘性大，高质量dna提取难度大”的问题。以本发明的方法提取得到的dna的质量高，可直接用于下游的分子生物学实验，能够满足issr扩增的要求。并且本发明的提取方法毒性低、易操作。
附图说明
图1为本发明实施例1中的火龙果dna电泳检测、单酶切检测及双酶切检测图；其中m为dl5000dnamarker，1～7为dna电泳检测泳道，其中1、3泳道为红肉火龙果基因组dna，2泳道为白肉火龙果基因组dna，4泳道为黑火龙果基因组dna，5、6、7泳道为黄皮火龙果基因组dna；8～14泳道为用hindiii进行dna单酶切反应的结果检测泳道，8～14泳道所使用的dna模板分别对应于1～7泳道中的基因组dna；而15～21泳道为用hindiii和ecori进行dna双酶切反应的结果检测泳道，15～21泳道所使用的dna模板也分别对应于1～7泳道中的基因组dna。
图2为本发明实施例2中的火龙果dna电泳检测图；其中m为dl5000dnamarker，1、3、9、10和12泳道为白肉火龙果基因组dna，2、5、6、8和11泳道为红肉火龙果基因组dna，4泳道为黑火龙果基因组dna，7泳道为双色火龙果基因组dna。
图3为本发明实施例2中用火龙果线粒体细胞色素b基因特异引物cob1-f/r扩增图2中4泳道的黑火龙果基因组dna的pcr产物电泳图。
图4为本发明实例3中的火龙果dna电泳检测图；m为dl5000dnamarker，1、5泳道为红皮白肉火龙果基因组dna，2、3泳道为红皮红肉火龙果基因组dna，4泳道为黄皮白心火龙果基因组dna，6泳道为紫衫1号火龙果基因组dna，7泳道为红莲火龙果基因组dna，8泳道为紫衫2号火龙果基因组dna，9泳道为玫瑰一号火龙果基因组dna，10泳道为粗维火龙果基因组dna，11泳道为黄陂火龙果基因组dna，12泳道为白肉火龙果基因组dna，13泳道为红皮火龙果基因组dna。
图5为本发明实例3中用issr通用引物ubc808扩增图4中13个火龙果基因组dna的pcr产物电泳图；m为dl5000dnamarker，1～13泳道分别是以红皮白肉、红皮红肉、红皮红肉、黄皮白心、红皮白肉、紫衫1号、红莲、紫衫2号、玫瑰一号、粗维、黄陂、白肉及红皮火龙果基因组dna为模板的ubc808引物扩增产物。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的从火龙果茎中提取高质量dna的方法进行更详细的说明。但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品；所用的技术手段若未特别指明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中所述的火龙果老茎是指成熟的火龙果茎(2年生及以上)，所述的火龙果嫩茎是指刚抽生不久的茎尖或种子萌发后1年内长成的茎。
以下实施例中所用的所有试剂的配制方法如无特别说明均可按照常规ctab法来进行。
以下实施例中所用的洗涤液i为高温蒸汽灭菌(121℃，15min)的蒸馏水，室温保存。
以下实施例中所用的洗涤液ii为：含有200mmol/ltris.cl(ph8.0)、40mmol/ledta-2na(ph8.0)及5mol/lnacl的水溶液，高温蒸汽灭菌(121℃，15min)，室温保存。
以下实施例中所用的ctab抽提液为：含有2％(m/v)ctab、100mmol/ltris.cl(ph8.0)、20mmol/ledta(2na)(ph8.0)及1.4mol/lnacl的水溶液，高温蒸汽灭菌(121℃，15min)，室温保存。
以下实施例中所用的rnase水其终浓度为50μg/ml，配制方法为：5μlrnase母液(10mg/ml)溶于1ml的超纯水中，超纯水预先高温蒸汽灭菌(121℃，15min)，于-20℃保存。
实施例1
一、dna的提取
本实施例提供的从火龙果老茎中提取高质量dna的方法如下：
(1)取0.8的经去除茎上的刺、中间髓及90％以上的肉质部分的火龙果老茎，用液氮在研钵中磨细，迅速转移至50ml离心管中，样品化冻前加入45ml的洗涤液i，并震荡混匀，去除不能打散的样品，静置10min，然后8000g离心10min，倒掉上清液，并用小勺子将沉淀表层的粘液去掉，得第一沉淀。
(2)然后将第一沉淀转移至2ml离心管中，加入1ml洗涤液ii，震荡混匀后继续加洗涤液ii至离心管差不多满为止，再震荡混匀，静置5min，然后12000g常温离心5min，倒弃上清液，并在吸水纸上拍打去除尽可能多的粘液；但拍打过程中注意不要让沉淀掉出来。
(3)重复步骤2四次，最后两次离心时间为3min，得第二沉淀。最后两次离心时间可缩短到2-3min，这可避免后面使用剧烈震荡混匀，四次后一定确保上清液不含粘液，否则继续重复洗涤直至粘液完全除去。
(4)向第二沉淀中加入1.3mlctab抽提液，震荡混匀，置于65℃水浴锅中裂解60min，水浴期间每10min颠倒混匀一次，水浴结束后，静置至室温，12000g常温离心10min，吸取上清液950μl，得第一溶液。
(5)在步骤(4)所得的第一溶液中加入等体积的tris平衡酚/氯仿/异戊醇(体积比为25：24：1)的混合溶液，震荡混匀，置于摇床上轻轻摇2-3h，以使蛋白充分变性，再静置5min左右，待分层后12000g常温离心10min，吸取650μl上清液，得第二溶液。
(6)在步骤(5)所得的第二溶液中加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24：1)的混合溶液，摇匀，静置至分层，12000g常温离心10min，吸取350μl上清液，得第三溶液。
(7)在步骤(6)所得的第三溶液中加入等体积的异丙醇，置于-20℃的条件下30min，再于12000g、4℃的条件下离心15min，倒弃上清液，得第三沉淀。
(8)用浓度为75％(体积比)的乙醇洗涤所述第三沉淀两次，12000g离心2min，倒弃上清液，并在吸水纸上轻轻拍打，置于室温自然风干。
(9)向洗涤后的沉淀中加40μlrnase水，置于室温待dna完成溶解后于-20℃保存。
二、dna质量检测
用本实施例提供的提取方法分别对红肉火龙果、白肉火龙果、黑火龙果、黄皮火龙果的老茎进行dna提取。再将提取得到的dna的质量进行检测：将上述提取的dna在thermoscientificnanodrop2000c检测仪上进行检测，结果如表1所示：
表1dna质量检测结果
从表1中可以看出所有样品dna的od260/od280的比值都在2.0左右，说明dna质量比较好，下面将通过电泳等方法来进一步验证dna的质量。
三、dna电泳检测
取8μldna进行琼脂凝胶电泳检测，所用dnamarker为擎科生物的dl5000dnamarker，结果如图1的1～7泳道所示。从图1可以看出所有泳道胶孔清晰，dna条带为单一条带，没有拖带或拖尾现象，同时没有rna条带，说明提取的dna质量好，rna去除彻底。
四、单酶切反应
将上述提取的dna直接进行单酶切反应，体系和反应条件如下：
10μl酶切反应体系为：1μl10×fastdigestgreenbuffer(thermo)，0.5μlfastdigesthindiii(thermo)，4μldna模板，灭菌超纯水4.5μl；
酶切反应条件：37℃酶切30min。
五、单酶切反应电泳检测
将上述单酶切产物进行电泳检测，上样量为10μl，所用dnamarker为擎科生物的dl5000dnamarker，结果如图1的8～14泳道所示，从图1的8～14泳道可以看出提取的dna已基本被完全酶切，说明提取的dna不影响酶切反应，能够满足酶切反应的要求。
六、双酶切反应
将上述提取的dna直接进行双酶切反应，体系和反应条件如下：
10μl酶切反应体系为：1μl10×fastdigestgreenbuffer(thermo)，0.5μlfastdigesthindiii(thermo)，0.5μlfastdigestecori(thermo)，5μldna模板，灭菌超纯水3μl；
酶切反应条件：37℃酶切30min。
七、双酶切反应电泳检测
将上述双酶切产物进行电泳检测，上样量为10μl，所用dnamarker为擎科生物的dl5000dnamarker，结果如图1的15～21泳道所示。从图1的15～21泳道可以看出dna都完全酶切了，说明提取的dna可直接进行酶切反应。
实施例2
一、dna的提取
步骤(1)-步骤(8)同实施例1。
(9)向洗涤后的沉淀中加30μlrnase水，置于室温待dna完成溶解后于-20℃保存。
二、dna电泳检测
用本实施例提供的提取方法分别对白肉火龙果、红肉火龙果、黑火龙果和双色火龙果的老茎进行dna提取，再将提取得到dna进行电泳检测。
将dna稀释至一致浓度后取5μl进行琼脂凝胶电泳检测，所用dnamarker为擎科生物的dl5000dnamarker，结果如图2所示。从图2可以看出所有泳道胶孔清晰，dna条带为单一条带，没有拖带或拖尾现象，同时没有rna条带，说明提取的dna质量好，rna去除彻底。
三、pcr扩增
将上述提取的黑火龙果dna直接用作模板，进行pcr扩增。
根据同源扩增获得的火龙果线粒体细胞色素b基因序列，使用prime5软件设计一对扩增该基因orf区的引物，正向引物序列cob1-f:5’-gggagaaagaggtcaaaac-3’(seqidno.1)；反向引物序列cob1-r:5’-gaaagttcagccttacccta-3’(seqidno.2)；引物由擎科生物合成。
25μlpcr反应体系为：12.5μl2×primestarmaxdnapolymerase(takara)，0.3μm引物，2μldna模板，补灭菌超纯水至25μl。
pcr扩增的条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，53℃退火15s，72℃延伸25s，共33个循环；最后72℃延伸3min，16℃保持。
四、pcr产物电泳检测
将上述pcr扩增获得的产物进行电泳检测，上样量为25μl，所用dnamarker为擎科生物的dl5000dnamarker，结果如图3所示。从图3可以看出，以本发明的方法提取的dna直接用作模板，并不影响pcr反应，能够很好地扩增出目标条带来。
实施例3
一、dna的提取
提取方法同实施例2。
二、dna电泳检测
用本实施例提供的提取方法分别对红皮白肉火龙果、红皮红肉火龙果、黄皮白心火龙果、紫衫1号火龙果、红莲火龙果、紫衫2号火龙果、玫瑰一号火龙果、粗维火龙果、黄陂火龙果、白肉火龙果和红皮火龙果的老茎进行dna提取，再将提取得到dna进行电泳检测。
将dna稀释至一致浓度后取5μl进行琼脂凝胶电泳检测，所用dnamarker为擎科生物的dl5000dnamarker，结果如图4所示。从图4可以看出所有泳道胶孔清晰，dna条带为单一条带，没有拖带或拖尾现象，同时没有rna条带，说明提取的dna质量好，rna去除彻底。
三、issrpcr扩增
将上述提取的dna直接用于issr扩增。使用issr通用引物ubc808扩增基因组dna模板，通用引物ubc808序列为:5’-agagagagagagagagc-3’(seqidno.3)；引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。
10μlpcr反应体系为：5μl2×premixtaq(takara)，1μm引物，1μldna模板，补灭菌超纯水至10μl。
pcr扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸5min，共35个循环；最后72℃延伸5min，16℃保持。
四、pcr产物电泳检测
将上述pcr扩增获得的产物进行电泳检测，上样量为10μl，所用dnamarker为擎科生物的dl5000dnamarker，结果如图5所示。从图5可以看出，以本发明的方法提取的dna能够直接用于issr扩增，能够满足分子标记实验的要求。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>中国科学院华南植物园
<120>从火龙果茎中提取高质量dna的方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gggagaaagaggtcaaaac19
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gaaagttcagccttacccta20
<210>3
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
agagagagagagagagc17