本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种胎盘壁蜕膜间充质干细胞的培养。
背景技术：
间充质干细胞来源于发育早期中胚层，具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，经体外诱导可分化成为多种类型的细胞，如成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞和心源性细胞等，是组织工程、再生医学和细胞治疗领域中理想的种子细胞。目前已发现间充质干细胞存在于骨髓、脂肪、肝、脐带、胎盘等多种组织中，其中骨髓是间充质干细胞的主要来源。然而，骨髓中间充质干细胞的含量很低，仅占单个核细胞的0.001％～0.01％，且采集骨髓存在出血和感染等风险，而且骨髓间充质干细胞的增殖分化潜能会随供者年龄的增大而下降。因此，有必要寻找新的间充质干细胞来源。近年来发现，胎盘组织中也存在大量的间充质干细胞。
胎盘在胎儿发育中起重要作用，含有大量滋养细胞、丰富的血管及间充质成分，是一个干/祖细胞储备库。胎盘来源广泛，取材方便，不需要侵入性操作，不涉及伦理道德问题，从胎盘中提取的间充质干细胞分化潜能大，增殖能力强，是细胞和基因治疗的理想载体。
与骨髓间充质干细胞相比，胎盘壁蜕膜来源的间充质干细胞因具有更强的自我更新、高度增殖和多向分化潜能，以及取材方便、免疫原性低、不涉及伦理问题等优势而成为组织工程的研究热点。但是如果对整个胎盘进行处理费时费力；步骤较为繁琐导致培养过程中如需细胞转移时，被污染的可能性增大；整个胎盘组织中存在着不止一种间充质干细胞，导致细胞种类不唯一，对以后的研究有一定的干扰。
人胎盘壁蜕膜间充质干细胞(humanplacentaldeciduabasalis-mesenchymalstemcells，hpdb-mscs)易于获取，分离培养出来的细胞活性较好，且单一种类的细胞更易于研究与应用。因此寻找出能简便快捷培养出胎盘壁蜕膜来源的间充质干细胞的培养方法成为一个重要课题。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术中胎盘壁蜕膜间充质干细胞培养步骤繁琐、成本高及可能存在未知病原体感染风险的问题，提供一种操作简便、节约成本同时确保获得具有良好生长活性且保持胎盘壁蜕膜间充质干细胞应有的生物学特性的培养方法，应用前景广阔。
本发明所采取的技术方案是：一种分离与原代培养胎盘壁蜕膜间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：
1)分离及前处理：
将取到的胎盘样品浸泡消毒液30s，清洗数次至液体不再呈血红色，剥离羊膜，分离壁蜕膜组织，用pbs清洗后剪碎；
2)消化：
i型胶原酶消化2h，加入完全培养基终止消化，得到细胞混悬液；
3)原代培养：
将细胞悬浮液倒入200目滤网过滤，收集滤液1200rpm离心5min，弃上清，下层细胞经无血清培养基反复吹打混匀至散开后接种到明胶包被的培养皿中，以37℃、5％co2浓度的环境条件下培养，即可获得胎盘壁蜕膜间充质干细胞。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)中所述消毒液为含有1％双抗溶液的pbs。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)所述分离壁蜕膜组织是完整分离胎盘组织边缘连接的绒毛膜组织及附着于上面的组织，保留壁蜕膜组织。
作为上述方案的进一步改进，步骤2)中采用0.1％的i型胶原酶进行消化。
作为上述方案的进一步改进，步骤3)中培养的天数为4～5天。
本发明的有益效果是：
(1)本发明打破了传统的胎盘间充质干细胞繁琐的分离操作，并且通过调整消化液的选用和原代培养中的工艺参数，从而获得比胎盘间充质干细胞活性更好，纯化程度更高的胎盘壁蜕膜间充质干细胞。
(2)传统的间充质干细胞培养还要避免胎盘中红细胞过多且细胞种类繁多的缺点，本发明只需直接分离胎盘壁蜕膜组织，简化了操作步骤，节省时间同时降低成本。
(3)本发明通过优化消毒液的选用，在免去繁琐的操作步骤同时避免了转移样品过程中造成的污染。
(4)经本发明传代培养出的细胞仍具有良好的活性和应有的生物学特性。
附图说明
图1是实施例2所得的生长曲线图；
图2是实施例3所得的鉴定结果图；
图3是实施例4所得的分化结果图；
图4是实施例5所得的流式细胞分析图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
实施例1：分离与原代培养胎盘壁蜕膜间充质干细胞
一种分离与原代培养胎盘壁蜕膜间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：
1)分离及前处理：
将取到的胎盘样品浸泡含有1％双抗溶液的pbs30s，清洗数次至液体不再呈血红色，剥离羊膜，完整分离胎盘组织边缘连接的绒毛膜组织及附着于上面的组织，保留壁蜕膜组织，用pbs清洗后剪碎；
2)消化：
加入0.1％的i型胶原酶消化2h，加入完全培养基终止消化，得到细胞混悬液；
3)原代培养：
将细胞悬浮液倒入200目滤网过滤，收集滤液1200rpm离心5min，弃上清，下层细胞经无血清培养基反复吹打混匀至散开后接种到明胶包被的培养皿中，以37℃、5％co2浓度的环境条件下培养4～5天，即可获得胎盘壁蜕膜间充质干细胞。
4)传代培养：
4-1)当原代培养中胎盘壁蜕膜间充质干细胞融合度达到80～90％时，弃去细胞培养液，用pbs洗涤3次；
4-2)用胰蛋白酶取代物覆盖细胞使细胞得到解离，待细胞回缩变圆并从培养皿上开始脱落时用含有10％胎牛血清的完全培养基终止消化，得混合液；
4-3)将混合液反复吹打直至贴壁细胞从培养皿上脱落形成细胞悬液，细胞悬液1200rpm下离心5min，弃上清，下层细胞经无血清培养基反复吹打混匀至散开，进行胎盘壁蜕膜间充质干细胞的传代培养。
所述的无血清培养基购于lonza公司；所述的胰酶取代物购于gibco公司。
实施例2：绘制生长曲线
从实施例1中选取生长良好的第3代和第6代的胎盘壁蜕膜间充质干细胞进行计数，并根据所得数据绘制生长曲线，以1×104接种至24孔板内，每间隔24h取三个孔，并记下平均数，整理数据得图1所示的胎盘壁蜕膜间充质干细胞生长曲线图。
实施例3：免疫荧光鉴定
(1)从实施例1中选取生长良好的第3代胎盘壁蜕膜间充质干细胞，接种在明胶包被的24孔板上，待达到70％融合时，弃去培养液，用pbs洗涤2遍；
(2)在24孔板内加入3.7％多聚甲醛溶液固定30min，并用含有5％fbs的pbs洗涤细胞3次，每次洗涤10min,；
(3)在24孔板内加入透化剂(0.1％tritonx-100，pbs)，室温孵育15min后弃去，用pbs洗3遍，每次5min；
(4)在24孔板内加入封闭液(含有10％fbs的pbs)37℃封闭1h后弃去，pbs洗3遍，每次5min；
(5)在4℃下与针对cd34、cd44和cd90(1:200，santacruz，ca)的一抗孵育过夜，除去一抗后，用含有5％fbs的pbs洗涤细胞3次，每次洗涤10min；
(6)室温下在黑暗中，加入用fitc标记的二抗(1:500，santacruz，ca)1h，用pbs洗3遍，每次5min；
(7)最后将样品在避光条件下用dapi孵育5min，用pbs洗3遍，每次5min；
(8)加入抗荧光淬灭剂后在荧光显微镜下分析得图2所示的免疫荧光鉴定结果图(cd34不表达，可表达cd44、cd90)。
所述dapi购于invitrogen公司。
实施例4：分化
在第3次传代时以相同密度接种至六孔板的其中三个孔内，标记1、2、3，其中1、2两孔为实验组，3孔为对照，当细胞生长至80％融合时，去除培养基，然后用pbs洗涤细胞3次。
(1)将脂肪形成分化诱导培养基加入1孔中；
(2)将成骨分化诱导培养基加入2孔中；
(3)全培养基中加入3孔对照组细胞中。
培养基每3～4天完全更换。在诱导14天后，观察到1孔出现明显的大量钙结节时通过茜素红染色测定成骨能力，在诱导17天后观察到2孔中产生大量油脂时通过油红o染色评价脂肪生成能力。在光学显微镜下观察并拍照，得到如图3所示的分化结果图。
所述脂肪形成分化诱导培养基(adm)和成骨分化诱导培养基(odm)购于gibco公司；所述油红o、茜素红染色液购于solarbio公司。
实施例5：流式细胞分析
(1)从实施例1中选取生长良好的第3代胎盘壁蜕膜间充质干细胞(p3)、胰蛋白酶取代物消化收集细胞，调节细胞浓度1×106个/ml；
(2)1500r/min条件下离心5min，细胞沉淀重悬于100μl的pbs中；
(3)加入相应检测细胞表面抗体hla-abc、hla-dr以及对应的同型对照igg1、igg2，室温避光放置30min；
(4)pbs清洗2次，1000r/min条件下离心5min，弃上清，加入500μl的pbs重悬细胞，流式细胞仪检测。
所述hla-abc、hla-dr、同型对照igg1、igg2抗体购于bd公司。
结果表明，hpdb-mscs是较为理想的免疫赦免细胞，而且其低表达hla-abc，不表达hla-dr，表现出低免疫源性和免疫抑制作用，证明hpdb-mscs具有免疫抑制作用，为各种疾病的细胞治疗提供了新的选择。
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。