本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒(adeno-associatedvirus，aav)转染的方法。
背景技术：
：体外原代培养的皮层神经元在形态和生理特征上都与母体组织相似，能模拟体内环境，因此成为研究神经疾病机理、药物疗效、功能性基因改造等的重要实验模型。细胞转染是指将外源分子如dna，rna等导入真核细胞的技术，随着分子生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核生物的常规工具。因此，原代神经元的转染在神经领域的研究中至关重要，然而由于神经元是一种高度分化的细胞，动物出生后很少分裂，不同于其他细胞，神经元往往转染效率低并且难以存活。目前对神经元转染的方式有脂质体转染、电穿孔转染和慢病毒转染。脂质体转染指表面带正电荷的阳离子脂质体与和核酸的磷酸根通过静电作用形成dna－脂复合体，通过膜的融合、细胞内吞或者直接渗透作用，使dna传递进入细胞，再进一步在核内转录、表达。脂质体转染是应用最为广泛的转染方法之一，然而转染试剂细胞毒性高、转染效率低，使其难以在原代培养的神经元中得以应用。电穿孔转染指利用高强度电场，瞬间提高细胞穿透性，从而导入外源dna。但是强大电场引起的细胞毒性难以解决，并且外源基因无法整合到宿主基因组上导致不稳定表达，更需要特殊的电转仪器。慢病毒转染指通过慢病毒载体将外源基因组合到宿主染色体上，达到稳定持久的表达目的，然而慢病毒所能携带的外源基因片段较小，低于8kb。技术实现要素：因此为了解决上述技术存在的缺陷，本发明提出了一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法，采用了腺相关病毒，同时实现了稳定、高效、快速、大片段的原代神经元转染，满足神经科学研究的需求。为实现上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤：a)提取胎鼠大脑，分离皮层组织，消化处理；b)去除组织杂质，然后于第一培养液中制备细胞悬液；c)将细胞悬液接种于培养皿，置于细胞培养箱内培养，获得原代神经元培养液；d)原代神经元培养液中加入腺相关病毒进行神经元转染；e)转染后不断换液，以维持神经元生长所需的营养和适宜的环境。所述步骤a)的皮层组织来自于怀孕第十八天sd大鼠胎鼠的大脑皮层。所述步骤a)中分离皮层组织采用如下方法：腹腔麻醉孕鼠，取出胎鼠；用酒精消毒胎鼠表面之后断头，在无菌环境下用眼科镊剥开表皮和颅骨，取出全脑；用眼科镊分离大脑皮层，并在解剖显微镜下剥离血管膜。所述步骤a)中消化处理采用如下方法：将剥离完血管膜的皮层组织用眼科镊剪碎；用0.25％的胰酶在37摄氏度的水浴锅中消化10～15分钟；最后加入胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)终止消化。所述步骤a)中胎鼠断头之后到消化处理的用胰酶消化之前的操作均在冰浴的hank’s平衡盐溶液(hank’sbalancedsaltsolution,hbss)中进行。所述步骤b)中去除组织杂质制备细胞悬液具体方法为：吸出消化后的皮层组织沉淀用第一培养液轻轻吹打，静置取上清液；再一次加入第一培养液吹打沉淀，静止取上清；用4umd的滤网过滤获得上清液，再于离心机中五分钟取沉淀，离心转速为800～1200转/分钟；最后用第一培养液将沉淀吹打均匀，制备成细胞密度为15-30万/ml的细胞悬液。所述步骤c)中所述的培养皿指带有玻片的培养皿。所述步骤c)采用如下方法处理：直径为12mm的圆形玻片用浓硝酸浸泡处理10～24小时；吸去浓硝酸，用无菌水于摇床清洗5次，每次一小时；高压灭菌锅灭菌处理后烘干；在无菌的环境下，将玻片铺于培养皿中，加入0.1mg/ml的多聚l赖氨酸4度孵育10～14小时；吸去多聚赖氨酸，用灭菌水清洗三次，加入第一培养液，置于细胞培养箱中用细胞悬液进行接种。所述步骤c)中细胞接种是六孔板接种密度为30万个每孔，细胞培养是置于37摄氏度，5％二氧化碳的细胞培养箱中培养。所述步骤d)是在原代神经元培养液培养的第84～108小时加入腺相关病毒进行转染，每30万个左右神经元加入2～4ul腺相关病毒溶液，腺相关病毒滴度为2.82×1013v.g/ml。所述步骤d)神经元转染具体采用以下方式：在原代神经元培养液培养的第84～108小时从培养皿中吸取200ul培养液与1～3ul腺相关病毒混匀，制成病毒悬液，再将病毒悬液加入回培养皿中，摇匀置于细胞培养箱培养。所述步骤e)的第一次换液是在转染10～14小时后吸出原培养液，再加入第二培养液，并置于培养箱中培养。所述步骤e)以每隔72～96小时半量换液的方法进行换液，用移液枪吸除一半容积的旧培养基，再加入一半容积的第一培养基。所述第二培养液由第一培养液和保留培养液组成，体积比为1～2∶1；所述的保留培养液为原代神经元培养液培养的第84～108小时从培养皿中吸取的1ml培养液，保留培养液置于ep管中并且4摄氏度保存。第二培养液具体配方体积比如下表：第一培养液1～2保留培养液1所述第一培养液由neurobasal神经元培养基、双抗、glutamaxsupplement和b27组成，体积比为400～500∶3～5∶3～5∶10。neurobasal是神经元培养基，购于thermofisher公司。双抗为青链霉素混合液，购于solarbio公司。glutamaxsupplement可以防止在长期培养过程中谷氨酰胺的降解和氨的积累，购于thermofisher公司。b27是细胞培养添加剂，用于神经元生长和保持其活性，购于thermofisher公司。四种成分组成如下表：neurobasal400～500双抗3～5glutamaxsupplement3～5b2710采用本发明的方法优势在于：1)本发明的步骤简单，方法简单易行；2)本发明率先完成大脑皮层神经元的体外培养；3)本发明培养得到的神经元细胞数量充足，生长状态良好，可以从哺乳动物的大脑皮层组织中分离出高活性、高数量的神经元；4)本发明中神经元转染的方法为采用腺相关病毒转染，转染速度快，效率高，可转染进大基因片段，并且不影响神经元的活性。附图说明图1为本发明根据实施例，倒置相差显微镜20倍物镜观察下培养第6天的原代皮层神经元；图2为本发明根据实施例，倒置相差显微镜40倍物镜观察下培养第6天的原代皮层神经元；图3为本发明根据实施例，普通正置荧光显微镜40倍物镜观察下转染第96小时荧光蛋白的表达情况。图4为本发明根据实施例，普通正置荧光显微镜20倍物镜观察下转染第13天map2染色成像情况。图5为本发明根据实施例，普通正置荧光显微镜20倍物镜观察下转染第13天荧光蛋白的表达情况。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。本发明的实施例如下：根据本发明的原代皮层神经元培养及转染方法，进行组织皮层区原代神经元的培养与转染，具体如下：1.培养皿包被神经元培养前一天，在35mm的培养皿中铺入四片直径12mm的玻片，加入2ml0.1mg/ml的多聚l赖氨酸，放置在4度冰箱里12～15小时，取出培养皿，在超净台内用移液枪吸除全部多聚l赖氨酸，置于超净台内等待培养皿自然干燥，干燥后加入2ml第一培养液，置于细胞培养箱中备用，培养箱设置为37摄氏度，5％的二氧化碳浓度。2.分离皮层组织，进行消化处理用质量浓度10％的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300g大鼠约3ml)，用手术刀剖开大鼠腹部，取出胎鼠；将质量浓度为75％的酒精喷于胎鼠皮肤消毒，并在超净台内进行后续操作。在超净台无菌环境下对消毒后的胎鼠断头，将取下的胎鼠头部放置并在解剖过程中始终置于冰浴的hbss中，用眼科镊剥开其表皮和颅骨，取三个全脑组。用眼科镊分离大脑皮层，并在解剖显微镜下剥离血管膜。将剥离完血管膜的皮层组织用眼科镊剪碎，并将剪碎的组织与hbss一同吸入15ml的离心管中，静置5～10分钟至组织沉至离心管底部，用移液枪将离心管上清液吸除。之后在离心管中加入6ml质量浓度0.25％的胰酶，盖紧离心管盖，拿出超净台并放置于37摄氏度的水浴锅中消化15分钟，每隔5分钟轻轻摇晃，使充分消化。消化完成后将离心管置于超净台内并加入1mlfbs终止消化。3.去除组织杂质，于第一培养液中制备细胞悬液在超净台内使用移液枪吸出消化后的沉淀，并将其转移至新15ml离心管a中用6ml第一培养液轻轻吹打，静置5～10分钟后用移液枪吸取上清液3-5ml，并将吸取的上清液通过4umd的滤网过滤至离心管b内。再一次加入6ml第一培养液吹至离心管a中吹打沉淀，静置5～10分钟后取上清液3～5ml，同样用4umd的滤网过滤上清液至离心管b中。将装有上清液的离心管管盖紧闭，拿出超净台并置于离心机中，设置离心转速为1000转/分钟，离心五分钟。离心完成后将离心管拿入超净台内，用移液枪吸除全部上清液，并在离心管内重新加入5～10ml第一培养液将沉淀吹打均匀。在25×16型血球计数板上盖上一张玻片，用移液枪吸取10ul细胞悬液，从血球计数板边缘缓慢滴入，拿出超净台，在显微镜下计数，计算血球计数板四个角和中央的五个中方格(80个小方格)的细胞数，用公式(细胞个数/1ml＝80个小方格细胞总数÷80×400×10000)计算出细胞悬液的细胞密度。用第一培养液稀释细胞悬液，制备成密度为15～30万/ml的细胞悬液。此种方法可分离出高数量神经元，三对脑半球可得到1000万～4000万个神经元。4.将细胞接种于培养皿，置于细胞培养箱内培养每个3.5mm的培养皿接种30万个细胞，将根据密度换算所得到体积的细胞悬液加入到包被好的培养皿中，用画“8”的方式轻轻摇晃培养皿，使细胞均匀分布，将培养皿拿出超净台，放置在细胞培养箱内培养。在培养的第6天，取培养皿，于倒置相差显微镜20倍物镜下观察，图1所示，于40倍物镜下观察，图2所示，图中可见神经元活性高，生长状态好。5.神经元转染接种后的第96小时，从在超净台内从培养皿中吸取1ml培养液于ep管中为保留培养液，4摄氏度保存。再从培养皿中吸取200ul培养液与3ul腺相关病毒(aav-cmv-gfp，滴度为2.66×1013v.g./ml)在新的ep管内混匀，制成病毒悬液；将病毒悬液加入原培养皿中，轻轻摇匀，置于细胞培养箱培养。普通正置荧光显微镜40倍物镜观察下转染第96小时荧光蛋白的表达情况。6.转染开始后，在转染过程中不断换液12小时后从培养箱内取出培养皿，在超净台内吸出培养皿中所有的原培养液，加入37摄氏度预热的第二培养液2ml，重新置于培养箱中培养。每隔72小时半量换液的方法更换新第一培养液：每隔72小时，在超净台内弃去1ml旧培养液，加入37摄氏度预热的新第一培养液1ml，放回二氧化碳培养箱培养。在转染后的第96小时，取培养皿于普通正置荧光显微镜40倍物镜下观察荧光蛋白的表达情况，如图3所示，神经元转染速度快，神经元状态良好。在转染的第13天，用4％的多聚甲醛固定神经元后，用map2对神经元进行免疫荧光染色，于正置荧光显微镜20倍物镜下观察神经元的数量，如图4所示。相同视野下观察表达绿色荧光蛋白神经元的数量，如图5所示。根据图4、图5可以看出神经元转染效率高，可达到50％。当前第1页12