本发明属于分泌蛋白信号肽快速检测技术领域，具体地说，涉及一种利用xeg1在细胞外引起坏死的特点，在植物细胞上快速验证分泌蛋白信号肽的方法。
背景技术：
分泌蛋白指在细胞内合成，分泌到细胞外起作用的蛋白质。信号肽位于分泌蛋白的n端，一般由15-30个氨基酸组成，在信号肽的引导下，新合成的蛋白质被分泌到胞外发挥作用。植物病原菌大豆疫霉的病原相关分子模式蛋白xeg1在有信号肽的情况下可以在烟草上引起细胞坏死，去除信号肽则不能引起坏死。因此将需要检测的信号肽部分和xeg1无信号肽的c端融合，在细胞中表达，如果待检测信号肽有功能，则能引导xeg1至细胞外，引起细胞坏死；如果待检测信号肽没有功能，则不能引导xeg1至细胞外引起坏死。
当前，检测分泌信号肽功能的方法还有酵母的psuc2系统，或者在病原菌中对分泌蛋白融合标签蛋白进行超量表达，并进行检测等。酵母系统需要进行酵母转化，并且在多种培养基上验证，操作过程繁琐，费用高。在病原菌中超量表达融合有标签蛋白的分泌蛋白，需要进行病原菌的转化，效率较低，周期长，并且费用较高。现有技术亟需一种操作简单、成本低、准确率高、效率高且耗时短的检测具有分泌功能信号肽的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种成本低、准确率高、成本低、耗时短的鉴定信号肽是否具有分泌功能的方法。本发明利用分泌蛋白xeg1在植物细胞外引起细胞死亡的特点，将待检测信号肽和xeg1去信号肽部分融合，在植物细胞中表达并观察是否引起坏死，可以快速高效的检测信号肽是否具有分泌功能。
本发明提供了一种基于病原相关分子模式蛋白鉴定具有分泌功能信号肽的方法，包括以下步骤：
(1)将待鉴定信号肽与病原相关分子模式蛋白无信号肽的c端融合，构建表达载体；
(2)将步骤(1)构建的表达载体转化感受态细胞；
(3)将步骤(2)的感受态细胞注射入植物细胞中，观察注射位点坏死情况，若注射位点细胞坏死，则待检测信号肽具有分泌功能，若注射位点细胞无坏死，则待检测信号肽不具有分泌功能。
所述病原相关分子模式蛋白为大豆疫霉xeg1，其氨基酸序列如seqidno.1所示，其核苷酸序列如seqidno.2所示。
步骤(1)所述表达载体为植物瞬时表达载体。
步骤(2)所述感受态细胞为农杆菌感受态。
步骤(3)所述植物为烟草、马铃薯、番茄、辣椒。
本发明提供的基于病原相关分子模式蛋白鉴定具有分泌功能信号肽的方法还包括设立阳性对照，所述阳性对照是在步骤(1)阶段，将大豆疫霉无毒效应蛋白avr1b的信号肽连接病原相关分子模式蛋白无信号肽的c端构建表达载体得到。
优选地，阳性对照为将氨基酸序列如seqidno.3所述的avr1b的信号肽连接氨基酸序列如seqidno.1所示大豆疫霉xeg1的无信号肽的c端构建植物瞬时表达载体得到。
本发明提供了上述方法在筛选具有分泌功能信号肽中的应用。
进一步地，通过本发明的方法可以筛选得到具有分泌功能的信号肽，本领域技术人员可以利用这些信号肽应用于异源基因表达。
基于此，本发明提供了上述方法在制备转基因植物中的应用。
本发明的有益效果在于，本发明克服现有技术鉴定分泌蛋白信号肽工作量大、费用高、周期长等缺陷，基于xeg1在细胞外引起坏死的特点，通过在植物细胞瞬时表达的方法，可以方便、快捷的对待鉴定信号肽功能进行鉴定，操作鉴定、耗时短、成本低、结果准确可靠，能够很好的满足信号肽功能鉴定的要求，在植物基因工程技术领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为通过xeg1验证信号肽分泌功能图。avr1b、ssssvp1、gme5899、avrpiz-t的信号肽融合xeg1的去信号肽部分在烟草上进行农杆菌介导的瞬时表达，4-6天后观察注射位点是否坏死，全长的xeg1作为对照。灰色表示avr1b、ssssvp1、gme5899、avrpiz-t或xeg1的信号肽。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
(1)将大豆疫霉无毒效应蛋白avr1b的信号肽序列(氨基酸序列如seqidno.3)和核盘菌的分泌蛋白ssssvp1的信号肽序列(氨基酸序列如seqidno.4)分别连接氨基酸序列如seqidno.1所示大豆疫霉xeg1的无信号肽的c端，构建植物瞬时表达载体，获得可以在植物上表达avr1bsp-xeg1和ssssvp1sp-xeg1的载体。
具体操作如下：根据片段序列设计特异性引物，sp1bf(seqidno.7)和lapsp1b-xeg1r(seqidno.8)扩增avr1b的信号肽区域，获得扩增产物a，lapsp1b-xeg1f(seqidno.9)和xeg1r(seqidno.10)扩增xeg1的c端区域，获得扩增产物b；sp-ssssvp1f(seqidno.11)和lapsp-ssssvp1-xeg1r(seqidno.12)扩增ssssvp1的信号肽区域,获得扩增产物c，lapsp-ssssvp1-xeg1f(seqidno.13)和xeg1r扩增ssssvp1的c端区域，获得扩增产物d。按照如下反应进行pcr扩增：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。扩增完成后，在1％的琼脂糖凝胶上电泳，获得长度为目的大小的dna扩增条带；使用凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。由于分别要将avr1b和ssssvp1的信号肽区域与xeg1的c端进行融合，因此以sp1bf和xeg1r引物，以扩增产物a和b的片段混合物为模板，进行pcr扩增，获得avr1b信号肽和xeg1的c端融合片段avr1bsp-xeg1；以sp-ssssvp1f和xeg1r引物，以扩增产物c和d的片段混合物为模板，进行pcr扩增，获得ssssvp1信号肽和xeg1的c端融合片段ssssvp1sp-xeg1。使用凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。将表达载体进行通过claⅰ和smai酶进行双酶切，酶切产物用凝胶回收试剂盒进行回收。通过一步连接试剂盒(货号：c112-01，vazymebiotechco.,ltd)将基因片段和载体连接，转化大肠杆菌jm109，挑取阳性克隆，经pcr验证以及提取质粒酶切验证，送公司测序验证。
(2)通过电击转化农杆菌的方法获得含有目的载体的农杆菌。具体操作如下：农杆菌转化在电转化仪上进行，将电击杯及杯架置于冰上。设置电转化仪参数，电容c＝25μf，电压v＝2.5kv(电击杯为0.2cm)。电转完成后，加入1mllb培养液至电击杯中，重新悬浮细胞并转移ep管中，30℃振荡培养1-2h。离心收集细胞，弃上清，保留50-100μl液体，轻轻混匀涂布于含有卡那霉素的lb平板上，30℃培养，待长出单菌落后，挑取单菌落进行阳性菌落验证。
(3)分别将含有avr1bsp-xeg1和ssssvp1sp-xeg1表达载体的农杆菌在烟草中共注射，4-6天后观察注射位点是否坏死。挑取含有目的基因质粒的农杆菌于含有卡那霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中，30℃振荡培养24h，3000rpm，3min离心收集菌体，用mgcl2(10mm)溶液重悬，重复3次后，再次悬浮。定容od600＝0.3注射烟草。选取温室中生长4到6周的本氏烟，选择合适烟草叶片用于注射接种农杆菌。注射器针头在烟草下表皮造成微小创伤，用无针头的注射器将农杆菌悬液渗透到本氏烟叶片中。分别将含有avr1bsp-xeg1和ssssvp1sp-xeg1的农杆菌在烟草上进行注射，同时以含有xeg1的农杆菌注射作为阳性对照，4-6天后观察注射位点是否坏死。发生坏死说明蛋白能够分泌到细胞外，没有坏死则说明蛋白不能分泌到细胞外，信号肽没有功能，见图1。结果表明avr1bsp-xeg1和ssssvp1sp-xeg1均能够引起植物细胞坏死，说明avr1b和ssssvp1的信号肽具有分泌功能。
实施例2
为了验证方法的可靠性，选择稻曲病菌中预测的分泌蛋白gme5899和稻瘟病菌中的无毒效应蛋白avrpiz-t信号肽的分泌功能进行检测。通过实施例1中(1)的方法将gme5899((氨基酸序列如seqidno.5)和avrpiz-t(氨基酸序列如seqidno.6)信号肽区域和xge1的去信号肽区域融合，构建植物瞬时表达载体，通过电击转化农杆菌，将目的基因表达载体的农杆菌在烟草中共注射，4-6天后观察注射位点是否坏死。发生坏死说明蛋白能够分泌到细胞外，没有坏死则说明蛋白不能分泌到细胞外，信号肽没有功能，见图1。结果表明gme5899sp-xeg1和avrpiz-tsp-xeg1均能够引起植物细胞坏死，说明gme5899和avrpiz-t的信号肽具有分泌功能。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>华中农业大学
<120>一种基于病原相关分子模式蛋白鉴定具有分泌功能信号肽的方法
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