本发明涉及非天然氨基酸的合成领域，具体而言，涉及一种d-杂环氨基酸的合成方法、试剂盒及应用。
背景技术：
非天然手性氨基酸及其衍生物是多肽、类肽以及许多药物分子的重要组成单元，也是合成手性药物的关键中间体。目前，合成手性非天然的杂环氨基酸，主要是采用化学方法，包括使用贵重金属不对称催化氢化来对某一关键中间体实现单一构型的转化、使用手性试剂拆分消旋体、利用手性辅基不对称合成、使用手性原料的定向合成等方法。然而这些方法存在以下缺陷：1)使用贵重金属不对称催化氢化来对某一关键中间体实现单一构型的转化，其缺点是贵重金属不对称催化剂价格昂贵，反应需要大量有机溶剂，产物中有重金属残留且可能存在过度还原的副产物，而且因为合成的原料中含有杂环，常常会干扰贵重金属与配体的结合，造成催化效率不高；2)采用传统的手性拆分方法，得到消旋体中的一个异构体，会造成另外的原料浪费；3)利用手性辅基或手性原料的不对称合成，涉及到价格昂贵的手性原料、较长的合成路线以及大量的有机溶剂，而且对于某些杂环氨基酸的合成，得到的产品光学纯度不高，或者产品和杂质不易分离。
氨基酸根据手性分成d-氨基酸和l-氨基酸两种。天然氨基酸主要是以l型为主，现有技术中也有一些文献或专利报道采用生物酶合成l-非天然氨基酸的方法。d-杂环氨基酸是非天然氨基酸的一类，除了具有天然氨基酸的大部分功能外，还具有非天然氨基酸所不具备的优良性能，在药物合成(医药和农药)、食品及饲料等方面具有广泛的用途。但是，由于杂环氨基酸的性质比较特殊，现有技术通过化学法生产手性非天然氨基酸存在下列问题：一般需要手性金属催化剂、合成路线长、大量使用有机试剂而造成环境污染严重、生产成本高以及产物的光学纯度较难达到要求。目前还没有合适的通过生物酶的生物转化来合成d-杂环结构的氨基酸的报道。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种d-杂环氨基酸的合成方法、试剂盒及应用，以提供一种采用生物酶来生物合成d-杂环氨基酸的方法来提高选择性。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种d-杂环氨基酸的合成方法，该合成方法包括：采用seqidno:1所示的二氨基庚二酸脱氢酶将d-杂环类的酮酸类化合物转化成d-杂环氨基酸。
进一步地，d-杂环类的酮酸类化合物选自如下任意一种：
进一步地，上述合成方法包括：将d-杂环类的酮酸类化合物与氨基供体混合，在二氨基庚二酸脱氢酶及辅酶的作用下反应，得到d-杂环氨基酸。
进一步地，氨基供体选自甲酸铵或氯化铵。
进一步地，辅酶选自β-nadp+或β-nad+。
进一步地，反应的ph为7.8～9.0，优选反应的温度为30～40℃。
进一步地，反应在缓冲液中进行，缓冲液选自tris-hcl盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、磷酸盐缓冲液或硼酸-氢氧化钠缓冲液。
进一步地，上述合成方法包括：将d-杂环类的酮酸类化合物与氨基供体混合，在二氨基庚二酸脱氢酶及辅酶的作用下反应，得到反应产物；以及对反应产物进行后处理，得到d-杂环氨基酸；优选地，后处理的步骤包括：向反应产物中添加反应终止液，得到终止体系；将终止体系进行过滤，得到滤液；以及对滤液中的目的产物进行纯化，得到d-杂环氨基酸；更优选，反应终止液为盐酸，盐酸的添加量以使终止体系的ph≤1为准，过滤的步骤中采用硅藻土垫。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种合成d-杂环氨基酸的试剂盒，该试剂盒包括生物酶，生物酶为seqidno:1所示的二氨基庚二酸脱氢酶。
进一步地，试剂盒还包括d-杂环类的酮酸类化合物，优选d-杂环类的酮酸类化合物为如下任意一种：
根据本发明的另一方面，提供了seqidno:1所示的二氨基庚二酸脱氢酶在筛选d-杂环氨基酸合成原料中的应用。
应用本发明的技术方案，采用本申请的二氨基庚二酸脱氢酶将d-杂环类的酮酸化合物转化生成d-杂环氨基酸，能够得到较高转化率和较高手性纯度的非天然手性氨基酸，且采用该二氨基庚二酸脱氢酶进行合成的方法所用的工艺条件稳定，反应条件温和，整个生产过程中操作简单、污染较低，为人工合成d-杂环氨基酸提供一种新的思路方法。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有技术中的d-杂环氨基酸的合成存在收率低等缺陷，为了改善这一现状，发明人对现有的采用生物酶合成d-杂环氨基酸的方法进行了研究，并发现目前d-杂环氨基酸的合成收率低的原因在于，没有针对特定的合成原料选择合适的二氨基庚二酸脱氢酶来合成相应的d-杂环氨基酸。为了找到相匹配的d-杂环氨基酸合成原料及二氨基庚二酸脱氢酶，发明人从现有众多的酮酸类化合物原料中筛选了在市场上已商业化的原料或者容易制备的酮酸类化合物，并针对这些原料，从酶库中筛选了近100种酶后，发现一种来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶(seqidno:1所示序列：mnkvhkiavvgygnigkyavqalnrapdmelagvvrrarsardvppelagvpiatsidelegveaailatptrttpeyasdilskgihtvdsydihgeladvrrklddiakrhgsvaivsagwdpgtdsmirsmlefmapggvtytnfgpgmsmghsvavkaidgvkdalsmtiplgtgvhrrmvyveceagadfetvkekvladpyfvndethviqvddvqqlvdvghgvsmerkgvsgathnqlfnfemrinnpaltsqvlvaaaratfkqqpgaytmievpiidfmygdreelikrlv)在合成d-杂环基氨基酸上能达到较高的转化率和选择性。
基于上述研究结果，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种d-杂环氨基酸的合成方法，该合成方法包括：采用seqidno:1所示的二氨基庚二酸脱氢酶将d-杂环类的酮酸类化合物转化成d-杂环氨基酸。采用seqidno:1所示的二氨基庚二酸脱氢酶在合成d-杂环基氨基酸上能达到较高的转化率和选择性。
通过对现有的多种d-杂环类的酮酸类化合物进行筛选，发明人发现当选择如下任意一种化合物：
相应地，采用上述d-杂环类的酮酸类化合物为原料时，所获得的d-杂环氨基酸选自如下任意一种：
上述合成方法可以在现有的二氨基庚二酸脱氢酶合成氨基酸的方法基础上，根据原料及生物酶的不同对合成条件进行合理调整得到。为了进一步提高产品的手性纯度，在本申请一种优选的实施例中，上述合成方法包括：将d-杂环类的酮酸类化合物与氨基供体混合，在二氨基庚二酸脱氢酶及辅酶的作用下反应，得到d-杂环氨基酸。
上述优选实施例中的氨基供体可以是现有的常用的氨基供体，为了使底物的转化率更高，在本申请一种优选的实施例中，上述氨基供体选自甲酸铵或氯化铵。不同的底物可以选择相同的氨基供体也可以选择不同的氨基供体，但为了使产品的手性纯度更高，针对不同的底物原料可以通过优化选择最合适的氨基供体进行上述合成反应。比如，当原料为
上述合成方法中，为了提高生物酶的催化活性，通常添加辅酶来促进反应的进行。在本申请一种优选的实施例中，上述辅酶选自β-nadp+或β-nad+。
上述合成方法中，反应的具体条件可以根据底物转化率进行合理优化调整。在本申请一种优选的实施例中，上述反应的ph为7.8～9.0，优选反应的温度为30～40℃。上述反应条件下不仅产品的手性纯度高，而且相对温和，便于控制使得该合成方法更简便易行。当然，对于不同的原料而言，其最合适的ph条件和反应温度也略有差异，可以根据具体原料进行合理调整。优选地，当原料为
为了使上述反应的产品手性纯度更高，在本申请一种优选的实施例中，将上述反应在缓冲液中进行，缓冲液选自tris-hcl盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、磷酸盐缓冲液或硼酸-氢氧化钠缓冲液。不同缓冲液对不同的原料的优化效果略有差异。比如，在tris-hcl盐缓冲液中，
在本申请一种优选的实施例中，上述合成方法包括：将d-杂环类的酮酸类化合物与氨基供体混合，在二氨基庚二酸脱氢酶及辅酶的作用下反应，得到反应产物；对反应产物进行后处理，得到d-杂环氨基酸。通过后处理能够将反应产物中的杂质去除，从而获得纯度较高的目标产物。
上述后处理为氨基酸合成步骤中常见的后处理操作，包括反应终止的操作以及对产物进行提纯的操作。在本申请一种优选的实施例中，上述后处理的步骤包括：向反应产物中添加反应终止液，得到终止体系；将终止体系进行过滤，得到滤液；以及对滤液中的目的产物进行纯化，得到d-杂环氨基酸。
在本申请一种优选的实施例中，上述反应终止液为盐酸(优选为浓盐酸，加入的量少，实际加入量以ph≤1为准)，过滤的步骤中采用硅藻土垫。采用盐酸进行反应的终止能够快速实现反应的终止。而采用硅藻土垫进行过滤具有操作简单有效、成本低的优势。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种合成d-杂环氨基酸的试剂盒，该试剂盒包括生物酶，该生物酶为seqidno:1所示的二氨基庚二酸脱氢酶。采用含有该二氨基庚二酸脱氢酶的试剂盒进行d-杂环氨基酸的合成，具有选择性高的优点。
在一种优选的实施例中，上述试剂盒中还包括d-杂环类的酮类化合物，优选d-杂环类的酮类化合物为如下任意一种：
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了seqidno:1所示的二氨基庚二酸脱氢酶在筛选d-杂环氨基酸合成原料中的应用。该应用能够筛选中新的、转化率和/或特异性更高的底物，以便形成种类更多、应用范围更广泛的d-杂环氨基酸。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实施例1
(1)投料：向2l四口圆底瓶中，加入10g主原料
(2)反应：并将其升温至30℃，进行反应。
(3)后处理：反应16h后跟踪体系，检测原料反应完毕，降至室温，向四口烧瓶中缓慢滴加浓盐酸使反应后混合体系的ph值至1以终止反应，体系过硅藻土，滤液用30％naoh调节ph至8.0，用300mlmtbe萃取1次，水相用30％naoh调ph至10.0，加入22g叔丁氧羰基，滴加30％naoh，控制ph为10.0，温度为25℃下反应16h，加入300mlmtbe萃取两遍。水相用10wt％盐酸调ph至4.5，用300mlmtbe萃取3次。有机相用300ml饱和食盐水洗两次，分液后水相弃之，有机相加入10g无水硫酸镁干燥，干燥后抽滤，滤饼用mtbe冲洗。滤液再次缩干，得到9.2g固体。
所得固体的核磁数据如下：1hnmr(400mhz,d2o)：δ8.43(d，2h)，7.87(d，1h)，7.50(t，1h)，3.97(t，1h)，3.24(dd，2h)。
经核磁检测，内标(即目标产物)的含量为98.5％，经液相色谱检测，手性纯度为99.7％。
实施例2
(1)投料：向2l四口圆底瓶中，加入10g主原料
(2)反应：并将其升温至40℃，进行反应。
(3)后处理：反应16h后跟踪体系，检测原料反应完毕，降至室温，搅拌下缓慢向其中滴加浓盐酸使反应后混合体系的ph值至1以下；将调酸后的体系过1～2cm的硅藻土垫，用200ml纯化水洗滤饼2次得水溶液，用氢氧化钠将得到的滤液ph值调节至5之间，抽滤该混合溶液得滤饼和滤液，滤饼分别以300ml纯化水洗两次后，再用5倍体积纯水搅拌洗涤3次，抽滤后的滤饼烘干后得产品7.4g。
所得产品的核磁数据如下：1hnmr(400mhz,d2o)：δ7.74(d，1h)，7.17(d，1h)，4.20(s，1h)，4.07(t，1h)，3.38(s，1h),3.34(dd，1h),3.10(dd，1h)。
经核磁检测，核磁内标的含量为98.4％，经液相色谱检测，手性纯度为98.5％。
实施例3
(1)投料：向2l四口圆底瓶中，加入10g主原料
(2)反应：并将其升温至35℃，进行反应。
(3)后处理：反应16h后跟踪体系，检测原料反应完毕，降至室温，向四口烧瓶中缓慢滴加浓盐酸使反应后混合体系的ph值至1以终止反应，体系过硅藻土，得到的滤液冰水浴下用固体氢氧化钠调节ph值在6之间，搅拌30min后抽滤，得到固体；固体再用10ml水洗，烘干得到产品8.5g。
所得产品的核磁数据如下：1hnmr(400mhz,d2o)：δ6.08(q，2h)，4.12(t，1h)，3.41(s，1h)，3.28(dd，1h)，3.16(s，1h),2.94(dd，1h),2.17(s，3h)。
经核磁检测，内标的含量为95.0％，经液相色谱检测，手性纯度为99.4％。
实施例4
(1)投料：向2l四口圆底瓶中，加入10g主原料
(2)反应：并将其升温至35℃，使反应体系按照下述化学式进行反应。
(3)后处理：反应16h后跟踪体系，检测原料反应完毕，降至室温，搅拌下缓慢向其中滴加浓盐酸使反应后混合体系的ph值至1以下；将调酸后的体系过1～2cm的硅藻土垫，用氢氧化钠将得到的滤液ph值调节至6之间，得粗品水溶液。将粗品水溶液过型号为001×7的强酸性阳离子交换树脂树脂柱纯化，所得粗品用无水乙醇洗涤后进行抽滤，滤饼烘干得固体产品；滤液过型号为001×7的强酸性阳离子交换树脂树脂柱纯化得固体产品5.1g。
所得产品的核磁数据如下：1hnmr(400mhz,d2o)：δ4.90(t，1h)，3.92(m，4h)，3.45(t，1h)，3.40(s，1h)，3.35(s，1h),1.94(dd，1h),1.74(dd，1h),1.54(td，2h)。
经核磁检测，核磁内标的含量为98.2％，经液相色谱检测，手性纯度为99.1％。
实施例5
(1)投料：向2l四口圆底瓶中，加入10g主原料
(2)反应：并将其升温至35℃，使反应体系按照下述化学式进行反应。
(3)后处理：反应16h后跟踪体系，检测原料反应完毕，降至室温，搅拌下缓慢向其中滴加浓盐酸使反应后混合体系的ph值至1以下；将调酸后的体系过1～2cm的硅藻土垫，用200ml纯化水洗滤饼2次得水溶液，用氢氧化钠将得到的滤液ph值调节至6之间，抽滤该混合溶液得滤饼和滤液，滤饼分别以300ml纯化水洗两次后，再用5倍体积纯水搅拌洗涤3次，抽滤后的滤饼烘干后得产品8.2g。
所得产品的核磁数据如下：1hnmr(400mhz,d2o)：δ7.30(d，1h)，7.02(t，1h)，6.93(s，1h)，3.50(t，1h)，3.15(d，2h)。
经核磁检测，内标的含量为98.0％，经液相色谱检测，手性纯度为98.5％。
实施例6
(1)投料：向2l四口圆底瓶中，加入10g主原料
(2)反应：并将其升温至35℃，使反应体系按照下述化学式进行反应。
(3)后处理：反应16h后跟踪体系，检测原料反应完毕，降至室温，向四口烧瓶中缓慢滴加浓盐酸使反应后混合体系的ph值至1以终止反应，体系过硅藻土，得到的滤液冰水浴下用固体氢氧化钠调节ph值在6之间，搅拌30min后抽滤，得到固体；固体再用10ml水洗，烘干得到9.0g产品。
所得产品的核磁数据如下：1hnmr(400mhz,d2o)：δ7.18，6.82(2d，2h，arom.-h)，3.78(dd，1h,hα)，3.23(2dd，2h，hβ)，2.10(s，2hch3)。
经核磁检测，内标的含量为99.0％，经液相色谱检测，手性纯度为99.0％。
对比例1
按照文献“transition-metal-assistedasymmetricsynthesisofaminoacidanalogues.anewsynthesisofopticallypured-andl-pyridylalanines”中记载的化学合成方法合成d-甲基2-乙酰氨基-3-(4-吡啶基)-丙酸甲酯(与实施例1相同的产物)。将380mg甲基2-乙酰氨基-3-(4-吡啶基)-丙烯酸甲酯，46mg(s，s)-[rh(dipamp)(cod)]+(bf4-)和10ml甲醇加入到高压釜中，通h2使压力达到65psi，跟踪至反应完后，柱层析分离出产品349mg，通过气相色谱检测手性纯度为92％。
对比例2
利用l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶来催化实施例1-6中的原料转化成相应氨基酸的反应，使用液相色谱检测跟踪，结果见表2。
利用液相色谱检测得到实施例1至6以及对比例1的d-杂环氨基酸的手性纯度，并记录在表1中。
表1：
由表1中的数据可以看出，实施例1至实施例6采用本发明的制备方法得到的d-杂环氨基酸的手性纯度均大于98％。而且，由实施例1与对比例1的对比可以发现，采用本申请二氨基庚二酸脱氢酶对特定d-杂环氨基酸的选择性比化学合成的方法高。
此外，采用对比例2的l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化与实施例1～6相同的原料来试图合成与实施例1～6相同的产物，使用液相色谱检测跟踪，结果记录于表2中。
表2：
由表2中的数据可以看出，采用对比例2的l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化与实施例1～6相同的原料，合成产物的手性纯度均小于10％。由此可见，本申请二氨基庚二酸脱氢酶在催化特定原料合成d-杂环氨基酸时，相对于现有的其他二氨基庚二酸脱氢酶具有难以预料的高选择性。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明的二氨基庚二酸脱氢酶将杂环酮酸转化生成d-杂环氨基酸，得到较高转化率和较高ee的非天然手性氨基酸，合成方法采用的工艺条件稳定，反应条件温和，整个生产过程中操作简单、污染较低，为人工合成d-杂环氨基酸提供一种新的思路方法。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>凯莱英医药集团（天津）股份有限公司
<120>d-杂环氨基酸的合成方法、试剂盒及应用
<130>pn82310kly
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>301
<212>prt
<213>novibacillusthermophilus
<400>1
metasnlysvalhislysilealavalvalglytyrglyasnilegly
151015
lystyralavalglnalaleuasnargalaproaspmetgluleuala
202530
glyvalvalargargalaargseralaargaspvalproprogluleu
354045
alaglyvalproilealathrserileaspgluleugluglyvalglu
505560
alaalaileleualathrprothrargthrthrproglutyralaser
65707580
aspileleuserlysglyilehisthrvalaspsertyraspilehis
859095
glygluleualaaspvalargarglysleuaspaspilealalysarg
100105110
hisglyservalalailevalseralaglytrpaspproglythrasp
115120125
sermetileargsermetleugluphemetalaproglyglyvalthr
130135140
tyrthrasnpheglyproglymetsermetglyhisservalalaval
145150155160
lysalaileaspglyvallysaspalaleusermetthrileproleu
165170175
glythrglyvalhisargargmetvaltyrvalglucysglualagly
180185190
alaaspphegluthrvallysglulysvalleualaaspprotyrphe
195200205
valasnaspgluthrhisvalileglnvalaspaspvalglnglnleu
210215220
valaspvalglyhisglyvalsermetgluarglysglyvalsergly
225230235240
alathrhisasnglnleupheasnpheglumetargileasnasnpro
245250255
alaleuthrserglnvalleuvalalaalaalaargalathrphelys
260265270
glnglnproglyalatyrthrmetilegluvalproileileaspphe
275280285
mettyrglyaspargglugluleuilelysargleuval
290295300