本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，特别涉及到一种山羊snp分子标记在山羊产羔性状研究和山羊育种中的应用。
背景技术：
繁殖性状是重要的经济性状，对于种畜而言，繁殖力就是生产力，繁殖性能直接关系到肉羊产业的经济效应。繁殖性能主要包括总产羔数、产活羔数、初生重、初生窝重、断奶窝重等指标。研究表明，羊的繁殖性状属于低遗传力的阈性状，产羔率低是制约优质高效养羊业发展的主要瓶颈，它受基因控制，而且为加性-显性基因作用模式。在传统的育种方法中，对家畜性状选择的方法多依赖于家畜的表型选择，对于大型家畜的选育往往需要长达几十年的时间，很难迅速地改善家畜群体的繁殖性能，而从遗传本质上研究提高产羔率的育种方法是国内外养羊科技工作者努力寻求破解的技术难题。随着分子生物技术的发展，尤其是分子标记辅助选择(markerassistedselection，mas)技术的发展和完善，直接在分子水平上对产羔性状的基因型进行选择，利用与目标性状紧密连锁的分子遗传标记，对目标性状进行跟踪性选择，减少育种进程中选择的盲目性，从而大大提高育种效率。
骨形态发生蛋白6(bonemorphogeneticproteins6，bmp6)最早是由lyons等人在小鼠胚胎中分离出来的，由于其cdna编码的多肤结构与爪蟾的vgr-1类似，因此最开始被命名为vgr-1。后来celeste等在人胎盘和胎脑中克隆出hbmp6，发现其编码的氨基酸与小鼠的vgr-1氨基酸序列高度同源，具有bmp家族成员的特征，最后将该基因定名为bmp6。该基因具有较广泛的功能，近年来发现bmp6在体内通过抑制或促进相关酶类或生殖激素的活性来影响动物的生殖(juengel等，2006)，随着对bmp6研究的深入，人们在多种哺乳动物多个与生殖相关的组织中检测到bmp6基因的表达。何小龙采用抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization，ssh)技术发现bmp6基因在发情期双羔蒙古羊的卵巢组织中存在差异表达(何小龙，2010)。大量研究发现，其在哺乳动物生殖方面发挥着巨大的作用。
通过以上资料我们可以得出bmp6基因参与动物的繁殖调控过程并发挥着重要的作用。因此，寻找该基因中变异位点，通过与产羔性状的关联分析，是进行分子标记辅助选择的基础，也是研究基因功能的一个重要手段。
虽然现有技术已经报道了bmp6基因参与动物的繁殖调控，然而在不同的物种间，bmp6核苷酸序列差异较大，但是氨基酸序列却十分保守。这加大了每个物种bmp6基因的snp分子标记的寻找难度。如储明星等对济宁青山羊、安哥拉山羊、波尔山羊、内蒙古绒山羊4个山羊品种250个个体中的bmp6基因部分片段进行单核苷酸多态性，结果发现3对引物的扩增片段在检测的4个品种中均无多态性(储明星,肖杰文,李学伟,等.4个山羊品种的bmp6基因部分片段的多态性分析[j].中国畜牧兽医,2008,35(1):55-58.)。肖朝庭等对小尾寒羊、湖羊、多赛特、特克赛尔、考力代五个绵阳品种301个个体中的bmp6基因部分片段进行单核苷酸多态性，结果发现这3对引物的扩增片段在检测的5个品种中也均无多态性(肖朝庭,狄冉,储明星,等.5个绵羊品种bmp6基因部分片段的多态及序列分析[j].畜牧兽医学报,2008,39(12):1631-1639.)。肖杰文在济宁青山羊、内蒙古绒山羊、波尔山羊、安哥拉山羊、辽宁绒山羊和文登奶山羊六个群体中均未能揭示出bmp6基因相关功能区与山羊繁殖力的关系(肖杰文.山羊高繁殖力候选基因gnrhr、bmp6和bmp15的多态性及与繁殖性状的相关性研究[d].四川农业大学,2008.)。
而且到目前为止，在川中黑山羊群体中，尚无人发现bmp6基因的相关调控区存在与产羔性状相关的snp分子标记。
为此开展了川中黑山羊bmp6基因部分基因组序列的snp筛查、检测及与产羔数性状的关联分析，以期对川中黑山羊的产羔性状进行改良，从而有效缩短川中黑山羊的育种进程，快速选育出高繁的种母羊，能够有效地扩大养殖产业的经济效益。
技术实现要素：
为了克服现有技术对产羔性状遗传选育的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种snp分子标记在山羊产羔性状研究和山羊繁殖育种中的应用，尤其是在川中黑山羊产羔性状研究和山羊繁殖育种中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案得以实现：
一方面，本发明提供了一种影响羊产羔数性状的分子标记，bmp6基因作为山羊产羔数性状的分子标记；所标记的山羊snp位点对应于genebank上已经发布的牛23号染色体上bmp6基因(登录号：ac_000180.1)的编码区序列的第951bp(以编码区序列的第一位碱基为+1位计算)处的t>c突变；所述分子标记的snp位点如seqidno.1所示，其中序列中的m是t或c，其差异导致了山羊产羔性状的不同。
需要说明的是，因为山羊的bmp6基因组序列并不完整，通过构建基因系统发生树及核酸同源性比对，川中黑山羊与牛的亲缘关系较近且核酸同源性也极高，完全可以用牛的基因组序列作为参考序列，因此本研究参照的是genebank上已经发布的牛的基因组序列。
另一方面，本发明还提供了用于鉴定上述山羊snp分子标记的引物，其含有如下所示的核酸序列：
seqidno：2
上游引物pcr-f：5'-tgtgccctcaccctctgtctc-3'；
seqidno：3
下游引物pcr-r：5'-cccggccttcctctttaactc-3'。
另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒含有如seqidno：2(上游引物)和seqidno：3(下游引物)所示的引物对。
另一方面，本发明还提供上述的snp分子标记、引物对，以及试剂盒在研究/鉴定/检测/调节山羊产羔数性状方面的应用，或者是在山羊繁殖育种中的应用，所述的繁殖育种优选为分子标记辅助选择。
另一方面，本发明还提供了一种检测羊产羔性状的方法，包含如下步骤：
检测山羊snp分子标记的单核苷酸是t还是c。
另一方面，本发明提供一种山羊的遗传育种改良的方法，包含以下步骤：
确定羊核心群中种羊的上述snp分子标记，并根据羊snp分子标记做出相应的选择：种羊的继代选育参照genebank中牛的23号染色体上bmp6基因编码序列的951bp处的突变纯合cc型和突变杂合tc型个体，淘汰该位点的野生纯合tt型个体；以逐代提高该位点的等位基因c的频率，从而提高后代山羊的产羔性能。
本发明中，所述的山羊选自黑山羊。发明人经大量的研究发现，通过进一步研究发现，该分子标记除了存在于川中黑山羊中，还存在于雷州黑山羊、努比亚黑山羊和重庆黑山羊中。在本发明的实施例中，以川中黑山羊为代表。在山羊外的其他羊品种中，尚未发现有该分子标记的存在，该位点对山羊具有一定的特异性。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明研究并确定影响山羊产羔数相关的分子标记，使用该分子标记进行标记辅助选择，能够极大地增加川中黑山羊的产羔数，加快育种进程。
(2)本发明提供了一种用于鉴定影响山羊产羔性状分子标记的引物对和试剂盒，通过该分子标记及引物对，可建立高效准确的分子标记辅助选择育种技术，将其应用于山羊繁殖性状的遗传改良中，从而提高羊的产羔数，挖掘羊的繁殖潜力，进而提高企业肉羊养殖的经济效益，增加其核心竞争力。
(3)本发明通过优选该分子标记的优势等位基因，能够增加川中黑山羊产羔性状的遗传进展，减少川中黑山羊繁殖性状的育种时间，从而有效提高种羊育种的经济效益，其中，通过该分子标记，本发明将优选cc型和tc型个体淘汰tt型个体，则每只羊平均产羔数较tt型可以分别增加0.44只、0.46只，由此可见，优良的繁殖性能在养羊产业中发挥着巨大的收益潜力。
附图说明
图1是所述snp分子标记t951c位点的pcr扩增产物凝胶电泳图。
图2是所述snp分子标记t951c位点的pcr-rflp凝胶电泳图。
图3是川中黑山羊cc基因型的测序结果图。
图4是川中黑山羊tt基因型的测序结果图。
图5是川中黑山羊tc基因型的测序结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
实施例中，选取有完整产羔记录的川中黑山羊母羊530只，颈静脉抽血2ml并做抗凝处理，于-20℃保存备用。本研究所使用的川中黑山羊均来自广西省梧州市温氏农牧有限公司的南江种羊场，该场全年实行高床舍饲饲养，按统一饲养标准饲喂日粮，自由采食饮水。
(1)川中黑山羊血液基因组dna的抽提是参照血液基因组dna提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)，以1％的琼脂糖凝胶电泳检测，无弥散或拖尾现象；并用紫外分光光度计对抽提的dna进行质量检测和浓度测定。将a260/280比值在1.8～2.0，a260/230比值在1.7～1.9的dna样判为合格。最后将合格的dna样品统一稀释成50ng/μl，并于-20℃冰箱内进行低温保存。
(2)dnapool测序：分别抽取20个和50个不同川中黑山羊个体的dna样品，按等量混合的原则做成两个dna池，并以此为模板进行pcr扩增，并对pcr产物进行测序。利用dnastar软件对测序结果进行序列整理并与ncbi上基因组序列进行比对，发现在该扩增序列的第179bp处存在t→c突变，即为所述snp位点，如图1所示。
(3)川中黑山羊pcr-rflp基因型检测：聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(pcr-rflp)分析技术是在pcr技术的基础上发展起来的。dna碱基置换正好发生在某种限制性内切酶的识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，pcr特异扩增包含碱基置换的这段dna，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常pcr产物进行比较来确定是否变异。
本研究以川中黑山羊血液基因组dna为模板，pcr扩增bmp6基因外显子3的398bp特异性片段产物，通过在线软件nebcutterv2.0(http://nc2.neb.com/nebcutter2/)和primerpremier5.0软件对酶切位点进行分析，确定该特异性片段产物含有hhai(gcg↓c)限制性内切酶识别位点，经hhai酶切后，以3％的琼脂糖凝胶电泳检测等位片段的长度(398bp、220bp+178bp或398bp+220bp+178bp，如图1)，并以此为遗传标记进行相关联分析，从而判断此分子标记是否影响川中黑山羊的产羔数。
(5)统计分析：数据采用spss20.0统计分析软件中的glm(generallinearmodel)程序配合构建的单位点效应模型对所述分子标记位点进行统计分析，采用lsd和dunnett’st3法进行均数间的多重比较，研究胎次和基因型对多胎性状(产羔数)的影响，统计分析所用的线性模型如下：
yjkl＝μ+pj+gk+ejkl
其中：yjkl为个体产羔数记录值；μ为群体平均值；pj为第j个胎次的固定效应；gk为第k种基因型的固定效应；ejkl为随机残差效应。所有数据均用平均值±标准差(mean±sd)的形式呈现。
(6)不同基因型与产羔数表型的关联性分析：根据表1可知，分子标记的snp位点t951c与产羔性状显著相关(p<0.05)，说明此分子标记显著影响川中黑山羊的繁殖性状，可以通过对川中黑山羊的此snp位点的辅助选择，从而提高该群体产羔数，进而加快育种进程。另外根据表1可知，cc型和tc型个体的平均产羔数分别比野生纯合tt型多0.44只、0.46只，且差异均显著(p<0.05)，说明c是优势等位基因，对提高川中黑山羊的产羔数是有利的。在肉羊产业中，产羔数是繁殖性状的重要指标，产羔数越高说明种羊的繁殖成本越低，经济效益越显著。因此，tt型的川中黑山羊的产羔性能是最差的，我们在进行育种的过程中可以淘汰tt型的种母羊，保留突变纯合cc型和突变杂合tc型的种母羊，以逐代提高该位点的等位基因c的频率。
表1t951c位点的不同基因型与川中黑山羊产羔数的相关性
注：不同字母表示差异显著(p＜0.05)。
实施例2
(1)含有与川中黑山羊产羔性状显著相关snp位点的目的片段的扩增：目的片段为23号染色体上的一段398bp的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物是根据genbank上报道的牛bmp6基因序列(登录号为：ac_000180.1)，利用primerpremier5.0软件对bmp6基因的外显子3进行引物设计，扩增川中黑山羊bmp6基因的部分序列。引物由华大生物科技有限公司合成，具体序列如下：
seqidno：2
上游引物pcr-f：5'-tgtgccctcaccctctgtctc-3'；
seqidno：3
下游引物pcr-r：5'-cccggccttcctctttaactc-3'。
(2)pcr扩增体系和程序设置
pcr反应体系：10μl体系中含基因组dna模板1μl，上、下游引物各0.2μl，5μltaqdna聚合酶，以去离子双蒸水补充至终体积。
pcr反应程序：94℃预变性2min，35个循环(94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃后延伸5min，4℃保存。
(3)pcr-rflp基因分型
pcr反应结束后即进行分子标记t951c位点扩增产物的酶切。酶切体系：15μl体系中含10×buffer1μl，双蒸水8.5μl，限制性内切酶hhai(10u/μl)0.5μl，pcr反应产物5μl，震荡混匀，37℃水浴30min。酶切产物使用3％的琼脂糖凝胶电泳分型。
(3)不同基因型测序结果判定：序列测序在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段进行正反两个方向的测序。将分子标记t951c位点的三种不同基因型的pcr产物送测，结果如图3和图4和图5所示。
测序结果如下seqidno.1所示：
注：序列表中标注的m为突变位点(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示的为引物序列。
实施例3分子标记的snp位点t951c效应分析
本发明提供一个能显著增加川中黑山羊产羔数的snp标记，使用该snp进行标记辅助选择，能够极大地增加川中黑山羊繁殖性能的育种进程。
本发明中影响羊产羔数的分子标记snp位点全部选育成cc型和ct型个体，则每只种母羊的平均产羔数可以增加0.44只或0.46只，由此可见繁殖性能高的种母羊的选育，对降低繁殖成本，提高养羊业经济效益及促进我国肉羊产业的快速发展具有重要的意义。本snp标记的个体中，cc型和ct型较tt型个体之间的产羔数存在显著差异(p<0.05)，通过优选川中黑山羊该snp位点的优势等位基因c，可最终实现提高养殖效益的目的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、替代、简化、组合、修饰，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南农业大学
<120>bmp6基因作为山羊产羔数性状的分子标记
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>398
<212>dna
<213>山羊(caprahircus)
<400>1
tgtgccctcaccctctgtctcctctctcttccagagactcggacctgtttctgctgggca60
cgcgtgctgtgtgggcctcagaggcgggctggctggagtttgacatcacggccaccagca120
acctgtgggtcctgactccgcagcacaacatggggctgcagctgagcgtggttacgcgmg180
acggtgagttcagggactcgggcctttgcctccttggcggcaggtgtgggcagccgtggt240
ccccaggcgggccccccgtttcccgacctcctggagccttggtggacaagcagagtcctg300
ccccagggcctcctggcaaggactcagggacggttagatggtccgggagcctcagagagg360
ggtaggagctgggtgctgagttaaagaggaaggccggg398
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tgtgccctcaccctctgtctc21
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cccggccttcctctttaactc21