基于qPCR或数字PCR技术用于检测囊泡中AR-V7及AR的引物及探针的制作方法

本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种基于qpcr或数字pcr技术用于检测囊泡中ar-v7及ar的引物及探针。

背景技术：

细胞外囊泡(extracellularvesicles,evs；以下囊泡均代表细胞外囊泡)是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，直径从30-1000nm不等，胞外囊泡主要由微囊泡(microvesicles,mvs)和外泌体(exosomes)组成，微囊泡是细胞激活或损伤后从细胞膜脱落的小囊泡。由于细胞外囊泡独特的生物学特征，其在疾病诊断中有着重要的意义，特别是其中的外泌体。

外泌体是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合后分泌到细胞外环境中粒径介于30～150nm的膜性小囊泡，是细胞间信息传递的重要媒介，在抗原呈递、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤发生发展及转移过程中发挥了重要作用。其在体液中分布广泛，包括血液、唾液、尿液、乳汁和胸腹水等；包含dna、rna及蛋白质等多种内含物，可以作为肿瘤等多种疾病的无创诊断标志物。

前列腺癌抗雄激素疗法中使用恩杂鲁胺(ar易位和信号转导的抑制剂)和阿比特龙(雄激素生物合成的抑制剂)会有耐药现象的出现。研究表明雄激素受体(ar)剪接变体7信使rna(ar-v7)与抗雄激素疗法耐药有相关性。

antonarakises(nengljmed.2014.)等入组了31例接受恩杂鲁胺治疗的患者和31例接受阿比特龙治疗的前列腺癌患者，对其循环肿瘤细胞中的ar-v7进行检测，结果显示，接受恩杂鲁胺的患者中，ar-v7阳性患者较阴性患者的psa(前列腺特异抗原)应答率更低(0％vs53％，p＝0.004)、psa无进展生存期更短(中位时间1.4个月vs.6.0个月；p<0.001)、临床或影像学无进展生存期更短(中位时间2.1个月vs.6.1个月；p<0.001)，同时总生存期也更短(中位时间5.5个月vs.未观察到；p＝0.002)。与之类似，接受阿比特龙治疗的患者中ar-v7阳性患者psa应答率低于阴性患者(0％vs.68％；p＝0.004)，且psa无进展生存期更短(中位时间1.3个月vs.未观察到；p<0.001)、临床或影像学无进展生存期更短(中位时间2.3个月vs.未观察到；p<0.001)，并且总生存期也更短(中位时间10.6个月vs.未观察到；p＝0.006)。结果表明，在去势抵抗性前列腺癌患者的循环肿瘤细胞中检测到的ar-v7很可能与恩杂鲁胺和阿比特龙的耐药性有关。

目前尚未有成熟的ar-v7检测方法，由于仅仅是转录本的可变剪切，常规的针对组织样本免疫组化、fish并不能很好地解决问题，同时前列腺癌癌组织的采集依赖穿刺，是一种有创的方法。上述文献中利用循环肿瘤细胞(ctc)进行rna检测受到ctc本身数目的限制。并不是所有的前列腺癌患者中均能够采集到ctc，即使能够检测到ctc，大部分样本中ctc的数目较少，对ar-v7本身的检测灵敏度较低而且价格昂贵。

因此，亟待开发一种低成本、简便快速、灵敏的ar-v7检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于qpcr或数字pcr技术用于检测囊泡中ar-v7及ar的引物及探针、检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种基于囊泡的ar-v7检测方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的基于qpcr或数字pcr技术开发的用于检测囊泡中ar-v7及ar的引物及探针，所述引物和探针分别为(seqidno:1-6)：

ar-v7正向引物：5′-aatgttatgaagcagggatgactct-3′

ar-v7反向引物：5′-ctttcttcagggtctggtcattt-3′

ar-v7探针：5′-aaaattccgggttggca-3′

ar正向引物：5′-ggaattcctgtgcatgaaagc-3′

ar反向引物：5′-cgatcgagttccttgatgtagttc-3′

ar探针：5′-ctgggtgtcactatgga-3′

本发明还提供含有所述引物及探针的用于qpcr或数字pcr检测ar-v7及ar的试剂盒。

所述试剂盒用于囊泡(包括外泌体)中ar-v7及ar的检测，所述囊泡提取自体液，包括血液、尿液、前列腺液等。囊泡的分离提取方法包括但不限于超离心、梯度密度离心、膜亲和法、聚合物沉淀、色谱法、免疫磁珠捕获法。

与所述试剂盒配套的qpcr反应体系及反应程序为：

qpcr反应体系：

pcr扩增程序：95℃5min；95℃5s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃5min。

本发明中，ar-v7和ar为各自独立的反应体系；所述cdna模板是从囊泡中提取的rna经反转录得到的。

与所述试剂盒配套的数字pcr反应体系及反应程序为：

数字pcr反应体系：

扩增程序：96℃10min；56℃2min，98℃30s，39个循环；60℃2min。

本发明提供一种基于囊泡的无创、快速、高灵敏度的ar-v7及ar全长检测的方法、引物探针及试剂盒。本发明中的引物探针及试剂盒既可以进行qpcr检测也可进行ddpcr(数字pcr)检测。本检测方法针对体液标本(包括血液、尿液及前列腺液等)，临床样本易获取，不仅能够提供用药指导意见，还能够对耐药情况的出现进行反复监控。

本发明还提供一种快速检测ar-v7可变剪切的方法，包括以下步骤：

(1)样本来源针对体液(血液、尿液、前列腺液)提取得到的囊泡(包含外泌体)rna，包括超速离心、exoquick、exoeasy及其他不同方法分离得到的囊泡。

(2)根据人类基因组序列设计ar-v7和ar全长的特异引物和探针。

(3)将囊泡rna利用逆转录酶和试剂进行逆转录得到cdna模板。

(4)配置荧光定量pcr扩增反应体系，进行荧光定量pcr扩增；根据荧光定量pcr仪得到的ct值对检测结果进行判断。

(5)为满足更高检测灵敏度的要求。可配置数字pcr扩增反应体系，进行数字pcr扩增，根据数字pcr仪得到的拷贝数对检测结果进行判断。

本发明首次提供一套基于囊泡rna的特异性引物探针，利用qpcr或数字pcr进行ar-v7的检测。与现有技术相比，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)建立一种基于体液来源样本的无创检测方法，无需进行穿刺活检。

(二)基于qpcr检测的体系检测成本低，检测速度快，仅需90分钟即可完成。

(三)基于数字pcr检测的灵敏度高，可达98％以上(常规的免疫组化检测灵敏度仅为60％～70％)，可以检测低至单拷贝的ar-v7可变剪切。

附图说明

图1为本发明实施例1中特异性引物的筛选实验结果。

图2为本发明实施例2中引物的特异性验证实验结果。

图3为本发明实施例3中细胞系囊泡的qpcr扩增实验结果。

图4为本发明实施例4中细胞系囊泡的数字pcr检测结果。

图5为本发明实施例5中临床患者数字pcr检测结果；其中，a为耐药患者，b为获益患者。

图6为本发明实施例5中临床患者qpcr检测结果；其中，循环数少的3条曲线对应于图5中耐药患者，循环数多的3条曲线对应于图5中获益患者。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1基于囊泡的ar-v7及全长ar检测方法的建立

本发明以ar-v7阳性细胞系22rv1为模板，构建ar-v7荧光定量pcr检测体系及数字pcr检测体系，同时检测ar-v7及全长ar。检测ar-v7及ar全长的方法包括以下步骤：

1、根据ncbi数据库公布的人类ar-v7(ncbi序列号nm_001348061.1)及ar全长(ncbi序列号nm_000044.4)基因序列，进行特异性引物探针设计。

设计的引物和探针如下(seqidno:1-6)：

ar-v7正向引物：5′-aatgttatgaagcagggatgactct-3′

ar-v7反向引物：5′-ctttcttcagggtctggtcattt-3′

ar-v7探针：5′-aaaattccgggttggca-3′

ar正向引物：5′-ggaattcctgtgcatgaaagc-3′

ar反向引物：5′-cgatcgagttccttgatgtagttc-3′

ar探针：5′-ctgggtgtcactatgga-3′

为了探索合适的针对ar-v7及ar全长检测的引物对，基于双端引物退火温度接近、序列gc含量不能过高或过低的引物设计原则，根据ar-v7及ar全长的基因序列分别设计了三对ar-v7引物和两对ar全长引物，具体如下：

ar-v7-1正向引物：5′-aatgttatgaagcagggatgactct-3′

ar-v7-1反向引物：5′-ctttcttcagggtctggtcattt-3′

ar-v7-2正向引物：5′-ccatcttgtcgtcttcggaaatgttatgaagc-3′

ar-v7-2反向引物：5′-tttgaatgaggcaagtcagcctttct-3′

ar-v7-3正向引物：5′-aagagaagtacctgtgcgcc-3′

ar-v7-3反向引物：5′-tcagggtctggtcattttga-3′

ar-f-1正向引物：5′-ggaattcctgtgcatgaaagc-3′

ar-f-1反向引物：5′-cgatcgagttccttgatgtagttc-3′

ar-f-2正向引物：5′-aagagaagtacctgtgcgcc-3′

ar-f-2反向引物：5′-ttcagattaccaagtttcttcag-3′

利用ar-v7前列腺癌细胞系22rv1(已知可同时表达ar-v7及ar全长)、肺癌细胞系h3122(表达ar全长、不表达ar-v7)和食管癌细胞系yes2、kyse30(均不表达ar全长和ar-v7)等4个细胞系的裂解液，使用ultrapurernakit进行rna提取，并利用promega试剂盒进行反转录，使用普通pcr体系2ng/ulcdna模板1ul，分别加入1ul浓度为0.2um的正向引物和反向引物，加入2×taqmastermix10ul，补depc水至25ul)进行pcr扩增，并用扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。结果表明引物对ar-v7-1及ar-f-1分别针对ar-v7和ar全长有良好的灵敏度及特异性，而引物对ar-v7-2、ar-v7-3存在多个扩增条带特异性不够，ar-f-2同等条件下条带的亮度不够，表明灵敏度不如ar-f-1。因此，在后续实验中选取引物对ar-v7-1(seqidno:1-2)及ar-f-1(seqidno:4-5)的序列进行实验。

2、样本处理与rna的提取：样本适用范围包括血液、尿液(20ml以上)和前列腺液(5ml)等体液；取血液10ml/尿液20ml以上/前列腺液5ml，使用超速离心、exoquick或exoeasy进行囊泡的分离。得到囊泡后使用trizolreagent、ultrapurernakit、mirneasyminikit等rna提取试剂盒提取总rna，提取的rna溶解于depc处理的ddh2o中，用于进行逆转录操作。

3、rna逆转录：采用promega或superscriptiv等逆转录试剂盒对上述得到的rna按试剂盒指定操作进行逆转录，得到cdna模板。

4、荧光定量pcr(qpcr)检测：取上述2ng/ulcdna模板1ul，分别加入1ul的正向引物和反向引物和2ul探针(浓度均为0.2um)，加入2×taqmastermix10ul，补depc水至25ul；pcr扩增条件为：95℃预变性5min，1个循环；95℃5s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃5min1循环。

5、数字pcr检测：取2ng/ulcdna模板3ul，分别加入1ul正向引物、1ul反向引物和2ul探针(浓度均为0.2um)，加入quantstudio3dmastermix7.5ul，补depc水至15ul；扩增条件为：96℃预变性10min，1个循环；56℃2min，98℃30s，39个循环；60℃2min1个循环。

实施例2引物的特异性验证

分别取前列腺癌细胞系22rv1(已知同时表达ar-v7及ar全长)、肺癌细胞系h3122(表达ar全长、不表达ar-v7)和食管癌细胞系yes2、kyse30(均不表达ar全长和ar-v7)等4个细胞系的裂解液，使用ultrapurernakit进行rna提取，并利用promega试剂盒进行反转录，使用普通pcr体系(2ng/ulcdna模板1ul，分别加入1ul浓度为0.2um的正向引物和反向引物，加入2×taqmastermix10ul，补depc水至25ul)进行pcr扩增，并用扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。结果显示，采用本发明中设计的特异性引物，仅能够从ar-v7阳性的细胞系中扩增出相应条带，不管ar-v7引物还是ar全长引物都与预期结果一致，表明引物序列在全基因组范围内具有很好的特异性。

实施例3细胞系囊泡的qpcr扩增实验

分别取前列腺癌细胞系22rv1及食管癌细胞系kyse30的细胞上清进行囊泡的提取，得到的囊泡使用ultrapurernakit进行rna提取，并利用promega试剂盒进行反转录，使用qpcr体系(cdna模板1ul，分别加入1ul浓度为0.2um的正向引物和反向引物和2ul浓度为0.2um的探针，加入2×taqmastermix10ul，补depc水至25ul)进行qpcr扩增(反应条件同实施例1)，并用扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。结果显示，在阳性细胞系22rv1的囊泡rna中均能够扩增得到相应的产物，而对应的阴性细胞系kyse30的囊泡rna均呈现为阴性，表明在囊泡rna中，引物序列具有很好的特异性。

实施例4细胞系囊泡的数字pcr检测

分别取前列腺癌细胞系22rv1、h2231和ntc细胞系上清进行囊泡的提取，得到的囊泡使用ultrapurernakit进行rna提取，并利用promega试剂盒进行反转录，使用数字pcr反应体系(取2ng/ulcdna模板3ul，分别加入浓度为0.2um的1ul正向引物、1ul反向引物和2ul探针，加入quantstudio3dmastermix7.5ul，补depc水至15ul)进行ar-v7及ar全长拷贝数检测(反应条件同实施例1)，结果如图4所示。结果表明：首先本发明中的引物探针具有很好的特异性，完全不存在非特异性扩增；其次，本发明中的整个体系能够有效的用于ar-v7及ar全长的检测。

实施例5临床样本检测

分别取前列腺癌抗雄激素治疗耐药和获益的患者血浆标本各1ml进行囊泡(包含外泌体)的分离提取，得到的囊泡使用ultrapurernakit进行rna提取，并利用promega试剂盒进行反转录，使用数字pcr反应体系(反应体系及反应条件同实施例1)进行ar-v7检测。根据fam信号值结果显示，耐药患者1ml血浆囊泡rna中检测出49个拷贝的ar-v7(图5-a)，而获益患者中未检测出ar-v7的表达(图5-b)。表明本发明中的数字pcr检测体系可以用于临床患者的ar-v7检测。

取上述两个前列腺癌患者的cdna模板，使用qpcr反应体系(反应体系及反应条件同实施例3)进行ar-v7检测，每个样本设置3个平行对照，检测结果如图6所示。以ct值(循环数)小于30为阳性，ct值(循环数)大于30为阴性为阈值标准，与上述数字pcr检测结果一致。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

antonarakises,luc,wangh,etal.ar-v7andresistancetoenzalutamideandabirateroneinprostatecancer[j].newenglandjournalofmedicine,2014,371(11):1028-38。

序列表

<110>北京恩泽康泰生物科技有限公司

<120>基于qpcr或数字pcr技术用于检测囊泡中ar-v7及ar的引物及探针

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