本发明属于药物检测
技术领域:
,具体涉及一种匹多莫德分散片的微生物限度检查方法。
背景技术:
:匹多莫德的种类多,分散片是其中的一种。匹多莫德分散片是一种可以增强身体免疫能力的药物,所以很多人都在服用这种药物,因为很多病人的身体不健康都是因为免疫力低下造成的,要是服用了匹多莫德分散片之后的话,就可以避免感染性疾病的反复发作,并且配合一些医生制定的药物效果更好的。匹多莫德分散片为免疫增强剂,可用于细胞免疫功能受抑制的患者反复发作的上、下呼吸道感染、中耳炎、泌尿系感染和妇科感染。本品用以减少急性发作的次数,缩短病程,减轻发作的程度;也可作为急性感染时抗生素的辅助用药。关于匹多莫德分散片的微生物限度检查方法至今尚未有报道。技术实现要素:本发明的目的是提供一种匹多莫德分散片的微生物限度检查方法,在微生物限度检验过程中避免假阴性的现象,降低患者用药安全风险。本发明所述的匹多莫德分散片的微生物限度检查方法,步骤如下:(1)菌液制备分别制备金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液;(2)供试液制备取匹多莫德分散片供试品10g,置于无菌均质袋中,加100ml的45℃ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,用均质器拍打1min,摇匀,作为1:10的供试液;(3)需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定需氧菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉,霉菌为黑曲霉,酵母菌为白色念珠菌。①供试品组取1:10的供试液1ml加入到薄膜过滤器中,用300mlph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗,分3次冲洗,贴于胰酪大豆琼脂培养基上,平皿倒置30~35℃培养5天;取1:10的供试液1ml注皿倒入沙氏葡萄糖琼脂培养基,平皿倒置20~25℃培养7天;②菌液组取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9ml和0.1ml菌液混匀,取1ml注皿;其中,金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液分别加入到胰酪大豆胨琼脂培养基中,平皿倒置30~35℃培养3天;白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液分别加入到沙氏葡萄糖琼脂培养基中,平皿倒置20~25℃培养5天;③试验组取1:10的供试液9.9ml和0.1ml菌液混匀,取1ml注皿;其中,金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液分别加入到胰酪大豆胨琼脂培养基中,平皿倒置30~35℃培养3天;白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液分别加入到沙氏葡萄糖琼脂培养基中,平皿倒置20~25℃培养5天;④各平皿培养后进行需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定,试验组菌落数减去供试品组菌落数的值与菌液组菌落数的比值在0.5~2范围内即为合格;(4)大肠埃希菌的检查①菌液制备:制备大肠埃希菌菌悬液;②检查方法:供试品组:取1:10供试液10ml,加入100mltsb培养基中,混匀,30~35℃培养18~72小时,得到培养物;取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42~44℃培养24~48小时;取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上,30~35℃培养18~72小时;结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长,或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性,判定供试品未检出大肠埃希菌;试验组:取1:10供试液10ml及不大于100cfu大肠埃希菌加入100mltsb培养基中,混匀,30~35℃培养18~72小时,得到培养物;取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42~44℃培养24~48小时;取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上,30~35℃培养18~72小时;结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长,或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性,判定试验组未检出大肠埃希菌;阳性对照组:取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml及不大于100cfu大肠埃希菌加入100mltsb培养基中,混匀,30~35℃培养18~72小时,得到培养物;取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42~44℃培养24~48小时;取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上,30~35℃培养18~72小时;结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长,或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性,判定阳性对照组未检出大肠埃希菌;阴性对照组:取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml加入100mltsb培养基中,混匀,30~35℃培养18~72小时,得到培养物;取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42~44℃培养24~48小时;取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上,30~35℃培养18~72小时;结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长,或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性,判定阴性对照组未检出大肠埃希菌。步骤(1)中金黄色葡萄球菌菌悬液的制备方法是取经30~35℃培养18~24小时的金黄色葡萄球菌新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为5000~10000cfu的菌悬液。步骤(1)中铜绿假单胞菌菌悬液的制备方法是取经30~35℃培养18~24小时的铜绿假单胞菌新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为5000~10000cfu的菌悬液。步骤(1)中枯草芽孢杆菌菌悬液的制备方法是取经30~35℃培养18~24小时的枯草芽孢杆菌新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为5000~10000cfu的菌悬液。步骤(1)中白色念珠菌菌悬液的制备方法是取经20~25℃培养2~3天的白色念珠菌新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为5000~10000cfu的菌悬液。步骤(1)中黑曲霉孢子悬液的制备方法是取经20~25℃培养5~7天的黑曲霉的新鲜培养物,加3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,吸出孢子悬液至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数为5000~10000cfu的孢子悬液。步骤(4)中大肠埃希菌菌悬液的制备方法是取经30~35℃培养18~24小时的大肠埃希菌新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为5000~10000cfu的菌悬液。本发明与现有技术相比,具有如下有益效果:本发明能够防止样品在检验过程中假阴性的出现,降低患者用药安全风险。具体实施方式以下结合实施例对本发明做进一步描述。实施例1(1)菌液制备①金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌取经30~35℃培养18~24小时的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为5000~10000cfu的菌悬液。②白色念珠菌取经20~25℃培养2~3天的白色念珠菌新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为5000~10000cfu的菌悬液。③黑曲霉取经20~25℃培养5~7天的黑曲霉的新鲜培养物,加3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,吸出孢子悬液至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数为5000~10000cfu的孢子悬液。(2)供试液制备取匹多莫德分散片供试品10g,置于无菌均质袋中,加100ml的45℃ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,用均质器拍打1min,摇匀,作为1:10的供试液;(3)需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定①供试品组取1:10的供试液1ml加入到薄膜过滤器中,用300mlph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗,分3次冲洗,贴于胰酪大豆琼脂培养基上,平皿倒置30~35℃培养5天;取1:10的供试液1ml注皿倒入沙氏葡萄糖琼脂培养基,平皿倒置20~25℃培养7天;计数结果见表1。②菌液组取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9ml和0.1ml菌液混匀,取1ml注皿;其中,金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液分别加入到胰酪大豆胨琼脂培养基中,平皿倒置30~35℃培养3天,计数结果见表2;白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液分别加入到沙氏葡萄糖琼脂培养基中,平皿倒置20~25℃培养5天,计数结果见表3;③试验组取1:10的供试液9.9ml和0.1ml菌液混匀,取1ml注皿;其中,金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液分别加入到胰酪大豆胨琼脂培养基中,平皿倒置30~35℃培养3天,计数结果见表4;白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液分别加入到沙氏葡萄糖琼脂培养基中,平皿倒置20~25℃培养5天,计数结果见表5;④各平皿培养后进行需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定,试验组菌落数减去供试品组菌落数的值与菌液组菌落数的比值在0.5~2范围内即为合格;测定结果见表6、表7。需氧菌、霉菌和酵母菌的比值均在0.5~2范围内,检测供试品合格。表1供试品组计数结果(单位:cfu)需氧菌霉菌和酵母菌00表2需氧菌菌液组计数结果(单位:cfu)表3霉菌和酵母菌菌液组计数结果(单位:cfu)白色念珠菌黑曲霉9283表4需氧菌试验组计数结果(单位:cfu)表5霉菌和酵母菌试验组计数结果(单位:cfu)白色念珠菌黑曲霉9080表6需氧菌比值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉0.880.991.020.880.94表7霉菌和酵母菌比值白色念珠菌黑曲霉0.980.96(4)控制菌检查方法适用性试验:大肠埃希菌的检查①菌液制备:取经30~35℃培养18~24小时的大肠埃希菌新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为5000~10000cfu的菌悬液。②检查方法:供试品组:取1:10供试液10ml,加入100mltsb培养基中,混匀,30~35℃培养18~72小时,得到培养物;取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42~44℃培养24~48小时;取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上,30~35℃培养18~72小时;结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长,或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性,判定供试品未检出大肠埃希菌;试验组:取1:10供试液10ml及不大于100cfu大肠埃希菌加入100mltsb培养基中,混匀,30~35℃培养18~72小时,得到培养物;取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42~44℃培养24~48小时;取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上,30~35℃培养18~72小时;结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长,或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性,判定试验组未检出大肠埃希菌;阳性对照组:取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml及不大于100cfu大肠埃希菌加入100mltsb培养基中,混匀,30~35℃培养18~72小时,得到培养物;取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42~44℃培养24~48小时;取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上,30~35℃培养18~72小时;结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长,或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性,判定阳性对照组未检出大肠埃希菌;阴性对照组:取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml加入100mltsb培养基中,混匀,30~35℃培养18~72小时,得到培养物;取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42~44℃培养24~48小时;取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上,30~35℃培养18~72小时;结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长,或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性,判定阴性对照组未检出大肠埃希菌。测定结果见表8。表8大肠埃希菌适用性试验结果供试品组试验组阳性对照组阴性对照组-++-当前第1页12