本发明属于药物合成技术领域，具体涉及一类阿司匹林衍生物及其制法和应用。
背景技术：
乙酰肝素酶(Heparanase,HPSE-1)，哺乳动物体内唯一能够识别硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)侧链-HS结构的内源性β-葡萄糖醛酸酯酶，与肿瘤的转移密切相关。乙酰肝素酶通过切割HSPG上的HS链促进细胞的迁移和浸润过程，引起细胞外基质和细胞基底膜的降解，从而破坏癌细胞转移的屏障；通过释放尿激酶型纤溶酶及组织纤溶酶激活物，激活纤溶酶原，活化基质中的金属蛋白酶，以促使硫酸乙酰肝素结合的碱性成纤维细胞生长因子的释放，从而发挥促进细胞转移的作用(Biochim Biophys Acta,2001,1471(3):M99-M108；Biochemistry,2005,44:12103-12213；IntJBiochem CellB,2006,38(12):2018-2039)。乙酰肝素酶在肺癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤细胞中高表达并促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。同时，HPSE还能将HS链上结合的VEGF、bFGF、HGF等血管新生促进因子释放到肿瘤细胞附近，诱导肿瘤组织的血管新生(Cancer Research,2010,70:5649-5669；Molecular Cancer Therapeutics,2013,12:1190-1201；WorldJournal ofSurgical Oncology,2014,12:85)。因此，乙酰肝素酶在肿瘤血管的生成、肿瘤的增生、浸润以及转移中起到了重要的作用。对于乙酰肝素酶抑制剂的研究和筛选已成为人类寻找癌症治疗潜在药物的新方向。
目前处于研发前沿的乙酰肝素酶抑制剂均为肝素类似物，而相关的小分子抑制剂研发工作无突破性进展。PI-88是澳大利亚Progen公司生产的乙酰肝素酶抑制剂，相对分子质量为2300，是高度硫酸化的甘露聚糖寡聚糖的混合物，是有前景的抗肿瘤候选药物，其作为抗肿瘤药物已经进入临床研究。现有的抑制剂如肝素类似物和硫酸化多糖，很难制备单抗并常常伴随抗凝血作用，而抗体和疫苗类拮抗剂生产工艺复杂，生产成本高，还经常引起剧烈的免疫反应。为了进一步提高乙酰肝素酶抑制剂的选择性和生物利用度，降低其毒副作用，研究开发乙酰肝素酶小分子抑制剂已成为现代抑制剂类药物研发的热点。
近年来，研究发现乙酰肝素酶为阿司匹林潜在的抗肿瘤转移作用靶点。研究表明，阿司匹林通过结合于调节乙酰肝素酶的酶活关键氨基酸Glu225位，抑制酶活功能，调控相关信号通路，从而抑制肿瘤的血管新生和转移。基于这个发现，为了进一步提高阿司匹林对乙酰肝素酶的抑制活性，降低其毒副作用，本发明设计合成了一类新的乙酰水杨酸类似物，作为一类新的小分子乙酰肝素酶抑制剂用于抗肿瘤，具有十分重要的意义。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是：提供一类阿司匹林衍生物或其异构体、前药、药学上可接受的盐、复盐、溶剂化物，与阿司匹林相比，对乙酰肝素酶的活性抑制作用更强，具有更好地抑制肿瘤细胞活性和作用。
本发明还提供了一类阿司匹林衍生物的制备方法。
本发明又提供了阿司匹林衍生物或其异构体、前药、药学上可接受的盐、复盐、溶剂化物制备抑制乙酰肝素酶的制剂中的应用。
本发明采用的技术方案如下：
一类具有式I或式II所示结构的阿司匹林衍生物
或其异构体、前药、药学上可接受的盐、复盐、溶剂化物，其中X＝C，N，O，或S；n＝0，1，2，3，或＞3。
本发明所述的阿司匹林衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：乙酰水杨酸在酰化剂的作用下，反应生成乙酰水杨酰氯，反应式如下：
步骤2：不同链长的二醇(X＝O，S，或N)在(BoC)2O作用下，反应生成中间体a，反应式如下：
步骤3：中间体a与乙酰水杨酰氯在弱碱性条件下发生酰化反应，得到中间体b，反应式如下：
步骤4：中间体b与三氟乙酸反应，脱掉叔丁基得到中间体c，反应式如下：
步骤5：中间体c在酰化剂的作用下，发应生成中间体d，反应式如下：
步骤6：丙叉基穿心莲内酯与中间体d在弱碱性条件下发生亲核反应，得到式I化合物，反应式如下：
进一步地，将步骤6制得的式I化合物在酸水溶液中反应，脱去丙酮叉得到式II化合物，其反应式如下：
进一步地，步骤1中将乙酰水杨酸溶于二氯甲烷中，在N2保护下，加入草酰氯和催化剂量的DMF，室温搅拌反应，使羧基酰化形成中间体乙酰水杨酰氯；
步骤2中，将不同链长的二醇(X＝O，S，或N)溶解在DMF中，并加入三乙胺和(BoC)2O，在N2保护下，体系在40-50℃搅拌反应2-5h，得到中间体a；
步骤3中，将中间体a溶于二氯甲烷中，降温至0℃，并加入三乙胺，在N2保护下，缓慢滴加乙酰水杨酰氯的二氯甲烷溶液，然后体系在室温搅拌反应2-3h，得到淡黄色油状物b；
步骤4中，所述中间体b在三氟乙酸的作用下，室温搅拌反应1-2h，脱掉叔丁基得到白色固体中间体c；
步骤5中，将所述中间体c溶于二氯甲烷中，在N2保护下，加入酰化剂草酰氯或氯化亚砜，室温搅拌反应30min后，加入催化剂量的DMF，25-85℃反应6-10h，减压蒸去过量的草酰氯或氯化亚砜，得到淡黄色油状中间体d；
步骤6中，将所述丙叉基穿心莲内酯溶于二氯甲烷中，随后降温至0℃，并加入三乙胺，在N2保护下，缓慢滴加中间体d的二氯甲烷溶液，然后体系在室温搅拌反应2-3h，得到式I化合物。
进一步地，所述丙叉基穿心莲内酯的合成方法为：将穿心莲内酯溶于有机溶剂中，加入2,2-二甲氧基丙烷和对甲苯磺酸吡啶反应后，蒸干，残留物用所述有机溶剂溶解，再依次用弱碱、水，饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，柱层析或重结晶，得丙叉基穿心莲内酯；所述的弱碱为碳酸氢钠或碳酸钠；有机溶剂为乙醚、二氯甲烷、甲苯、氯仿或丙酮。
进一步地，采用不同长度的中间体a，即n值的不同，与乙酰水杨酸酰氯在弱碱性条件下发生酰化反应，得到不同链长的中间体b。
本发明所述的阿司匹林衍生物或其异构体、前药、药学上可接受的盐、复盐、溶剂化物制备抑制乙酰肝素酶的制剂中的应用。
进一步地，所述抑制乙酰肝素酶的制剂通过抑制乙酰肝素酶的活性来抑制肿瘤的血管新生和转移，所述肿瘤包括肺癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌、乳腺癌或前列腺癌。
进一步地，所述应用，包括与其它治疗剂配伍联合用药，所述其它治疗剂选自以下药物或其衍生物或其盐中的任意一种或多种：长春新碱、阿霉素、秋水仙碱、依托泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、拓扑替康、硫代鸟嘌呤、马法兰、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、表阿霉素、阿克拉霉素、他莫昔芬、多沙唑嗪、坦索罗辛、氟吡啶、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、安普那韦、阿巴卡韦、利托那韦、沙奎那韦、罗非昔布、染料木素、阿糖胞苷、硼替佐米、格列卫、利妥昔单抗、吉西他滨、洛匹那韦。
进一步地，所述制剂的给药方式包括：口服、非胃肠道、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、透皮、颊、鞘内、颅内、鼻内或局部途径。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明化合物能显著抑制乙酰肝素酶的活性，是良好的乙酰肝素酶抑制剂。本发明化合物通过对乙酰肝素酶的活性抑制，从而抑制肿瘤的血管新生和转移，对各种肿瘤细胞具有非常强的抑制活性，可用于制备抗肿瘤的药物。
本发明化合物制备方法简单，操作简便，所得化合物纯度好，收率高。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
在下述实施例中更具体地解释本发明。然而，应当理解，这些实施例是为了举例说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。所有实施例中1H-NMR或13C-NMR核磁共振仪(Brucker公司)记录、化学位移以ppm表示，分离用硅胶均为200-300目(青岛海洋化工有限公司)，洗脱液的配比均为体积比。％如无特殊说明，均表示其质量百分含量。
实施例1
本实施例提供了丙叉基穿心莲内酯的制备，反应式为：
将4g穿心莲内酯加入100mL丙酮，搅拌至固体溶解，再向体系加入13mL 2,2-二甲氧基丙烷，加毕，搅拌5min，再向体系加入对甲苯磺酸吡啶0.14g，加毕，室温搅拌反应2h。反应完毕，将体系减压蒸馏，至无丙酮，残留物用二氯甲烷溶解，再依次用饱和碳酸氢钠溶液洗，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物柱层析(乙酸乙酯/环己烷＝3:7)，得白色固体4.3g，收率94％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ6.98(t,J＝8Hz,1H),5.04(d,J＝4Hz,1H),4.92(s,1H),4.62(s,1H),4.45-4.44(m,1H),4.28(d,J＝10Hz,1H),3.95(d,J＝10Hz,1H),3.50(dd,J1＝4Hz,J2＝8Hz,1H),3.18(d,J＝10Hz,1H),2.57–2.55(m,3H),2.43(d,J＝12Hz,1H),2.00–1.92(m,2H),1.8–1.77(m,6H),1.42(s,3H),1.37(s,3H),1.25(s,3H),0.97(s,3H).
实施例2
本实施例提供了乙酰水杨酰氯的制备，反应式为：
将乙酰水杨酸(3.0g,16.65mmol)，30mL二氯甲烷加入到50mL单口烧瓶中，在N2保护下，室温搅拌溶解，然后加入草酰氯(4.22g,33.3mmol)，室温搅拌反应30min后，加入20-50μL DMF，室温搅拌反应6h，减压蒸去过量的草酰氯，得到淡黄色油状物，产率90％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(d,J＝8Hz,1H),7.62(t,J＝6Hz,1H),7.35(t,J＝6Hz,1H),7.15(d,J＝8Hz,1H),2.35(s,3H).
实施例3
本实施例提供了n＝0的式I化合物(化合物1)的制备，反应式如下：
将丙叉基穿心莲内酯(0.40g,1.02mmol)，10mL二氯甲烷加入到50mL单口烧瓶中，在N2保护下，室温搅拌溶解，然后将反应置于低温反应器中降温至0℃，随后加入三乙胺(0.56mL,4.0mmol)，接着逐滴滴加乙酰水杨酸酰氯(0.285g,1.5mmol)的二氯甲烷溶液10mL，混合物在室温搅拌反应1h。反应完全后，加入二氯甲烷稀释反应体系，然后依次用饱和NaHCO3溶液洗涤，水洗，合并水相，用二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，残渣经柱层析色谱分离纯化(EA:PE＝2:5)，得到白色固体化合物1，产率85％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.02(d,J＝8Hz,1H),7.62(t,J＝4Hz,1H),7.34(t,J＝4Hz,1H),7.14(d,J＝8Hz,2H),6.16(d,J＝4Hz,1H),4.87(s,1H),4.61(q,J＝10Hz,1H),4.54(s,1H),4.38(d,J＝12Hz,1H),3.95(d,J＝8Hz,1H),3.49(d,J＝12Hz,1H),3.18(d,J＝12Hz,1H),2.51(t,J＝10Hz,2H),2.42(d,J＝16Hz,3H),2.30(s,3H),1.98(t,J＝12Hz,2H),1.87(d,J＝8Hz,1H),1.73(t,J＝12Hz,3H),1.39(s,3H),1.36(s,3H),1.30–1.20(m,6H),0.85(s,3H).
实施例4
本实施例提供了n＝0的式II化合物(化合物2)的制备，反应式如下：
将实施例3制得的式I化合物(0.1g,0.2mmol)，70％乙酸水溶液3mL加入到25mL单口烧瓶中，在N2保护下，室温搅拌反应20min。反应完全后，将反应体系倾入烧杯中，加入水稀释反应体系，然后加入饱和NaHCO3溶液中和反应体系，直至体系无气泡产生，二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，残渣经柱层析色谱分离纯化(EA:PE＝3:1)，得到白色固体化合物2，产率93％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.01(d,J＝8Hz,1H),7.62(t,J＝4Hz,1H),7.34(t,J＝4Hz,1H),7.14(d,J＝8Hz,2H),6.14(d,J＝4Hz,1H),4.85(s,1H),4.61(q,J＝10Hz,1H),4.51(s,1H),4.38(d,J＝12Hz,1H),4.17(d,J＝12Hz,1H),3.46(t,J＝12Hz,1H),3.31(d,J＝8Hz,1H),2.81(s,2H),2.50-2.41(m,3H),2.30(s,3H),1.83(t,J＝8Hz,1H),1.80(m,5H),1.23(m,6H),0.62(s,3H).
实施例5
本实施例提供了氯乙酰化丙叉基穿心莲内酯的制备，反应式为：
将丙叉基穿心莲内酯(0.4g，1.0mmol)，10mL二氯甲烷加入到50mL单口烧瓶中，在N2保护下，室温搅拌溶解，然后将反应置于低温反应器中降温至0℃，随后加入三乙胺(0.56mL,4.0mmol)，接着逐滴滴加氯乙酰氯(0.15mL,2.0mmol)的二氯甲烷溶液15mL，混合物在室温搅拌反应1h。反应完全后，加入二氯甲烷稀释反应体系，然后依次用饱和NaHCO3溶液洗涤，水洗，合并水相，用二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，残渣经柱层析色谱分离纯化(EA:PE＝1:3)，得到淡黄色油状化合物氯乙酰化丙叉基穿心莲内酯，产率80％。
实施例6
本实施例提供了n＝1，X＝C的式I化合物(化合物3)的制备，反应式为：
将化合物氯乙酰化丙叉基穿心莲内酯(0.20g，0.43mmol)，碘化钾(0.14g，0.86mmol)，10mL丙酮加入到25mL单口瓶中，在N2保护下，30℃搅拌反应2h。反应完毕后，减压蒸除丙酮溶剂，随后立即加入乙酰水杨酸(0.116g，0.645mmol)，三乙胺(0.23mL,1.72mmol)和10mL重蒸的THF，在N2保护下，室温搅拌反应16h。反应完全后，减压蒸除THF溶剂，残留物用二氯甲烷溶解，然后依次用饱和NaHCO3溶液洗涤，水洗，合并水相，用二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，残渣经柱层析色谱分离纯化(EA:PE＝1:3)，得到白色固体化合物3，产率50％。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.07(d,J＝7.6Hz,1H),7.61(t,J＝7.5Hz,1H),7.34(t,J＝7.5Hz,1H),7.13(d,J＝7.9Hz,1H),7.06(s,1H),6.04(s,1H),4.83(d,J＝23.7Hz,3H),4.56(dd,J＝9.2,6.4Hz,1H),4.47(s,1H),4.30(d,J＝11.4Hz,1H),3.95(d,J＝11.5Hz,1H),3.48(d,J＝7.6Hz,1H),3.17(d,J＝11.7Hz,1H),2.51–2.37(m,3H),2.33(d,J＝11.5Hz,3H),1.97(dd,J＝27.9,13.2Hz,2H),1.82(d,J＝11.0Hz,1H),1.75–1.63(m,3H),1.40(s,3H),1.36(s,3H),1.25(s,3H),1.19(s,3H),0.93(s,3H).13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ168.49,167.79,166.30,162.60,150.56,149.97,145.90,133.61,130.90,125.13,122.94,122.21,120.95,107.86,98.10,75.24,70.16,67.80,62.88,59.90,54.81,51.19,37.39,36.87,36.56,33.50,26.08,25.11,24.54,24.28,23.92,22.11,19.97,15.07.
实施例7
本实施例提供了n＝1，x＝C的式Ⅱ化合物(化合物4)的制备，反应式为：
将按实施例6方法制得n＝1的式I化合物(化合物3，0.1g,0.2mmol)，70％乙酸水溶液3mL加入到25mL单口烧瓶中，在N2保护下，室温搅拌反应20min。反应完全后，将反应体系倾入烧杯中，加入水稀释反应体系，然后加入饱和NaHCO3溶液中和反应体系，直至体系无气泡产生，二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，残渣经柱层析色谱分离纯化(EA:PE＝3:1)，得到白色固体化合物4，产率93％。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.06(d,J＝7.4Hz,1H),7.61(t,J＝7.1Hz,1H),7.34(t,J＝6.7Hz,1H),7.13(d,J＝7.8Hz,1H),7.06(s,1H),6.03(s,1H),4.81(dd,J＝22.7,13.8Hz,3H),4.56(s,1H),4.44(s,1H),4.30(d,J＝11.3Hz,1H),4.17(d,J＝11.0Hz,1H),3.46(s,1H),3.31(s,1H),2.90(d,J＝3.9Hz,1H),2.66(s,1H),2.43(m,3H),2.32(s,3H),1.95(t,J＝12.2Hz,1H),1.78(m,5H),1.24(s,6H),0.66(s,3H).13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ168.57,167.82,166.34,162.64,150.46,149.94,145.53,133.66,130.87,125.17,122.96,122.26,120.94,107.76,79.31,76.25,76.04,75.83,70.18,67.74,63.08,59.90,54.74,54.14,41.80,37.84,36.65,35.91,27.07,24.33,22.66,21.70,19.97,14.05.
实施例8
本实施例提供了n＝1、X＝N的中间体d(化合物d1)的制备，反应式为：
将化合物c1(4.66g,16.65mmol)，30mL二氯甲烷加入到50mL单口烧瓶中，在N2保护下，室温搅拌溶解，然后加入草酰氯(4.22g,33.3mmol)，室温搅拌反应30min后，加入20-50μL DMF，室温搅拌反应6h，减压蒸去过量的草酰氯，得到淡黄色油状物d1，产率80％。
实施例9
本实施例提供了n＝1、X＝N的式I化合物(化合物5)的制备，反应式为：
将丙叉基穿心莲内酯(0.40g,1.02mmol)，10mL二氯甲烷加入到50mL单口烧瓶中，在N2保护下，室温搅拌溶解，然后将反应置于低温反应器中降温至0℃，随后加入三乙胺(0.56mL,4.0mmol)，接着逐滴滴加按实施例8方法制得的d1(0.45g,1.5mmol)的二氯甲烷溶液10mL，混合物在室温搅拌反应1h。反应完全后，加入二氯甲烷稀释反应体系，然后依次用饱和NaHCO3溶液洗涤，水洗，合并水相，用二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，残渣经柱层析色谱分离纯化(EA:PE＝2:3)，得到淡黄色油状化合物5，产率82％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.03(s,1H),8.01(d,J＝8Hz,1H),7.59(t,J＝4Hz,1H),7.29(t,J＝4Hz,1H),7.13(d,J＝8Hz,2H),6.15(d,J＝4Hz,1H),4.85(s,1H),4.61(q,J＝10Hz,1H),4.51(s,1H),4.39(d,J＝12Hz,1H),4.31(t,J＝8Hz,2H),3.93(d,J＝8Hz,1H),3.48(d,J＝12Hz,1H),3.18(d,J＝12Hz,1H),3.13(t,J＝8Hz,2H),2.51(t,J＝10Hz,2H),2.42(d,J＝16Hz,3H),2.29(s,3H),2.03–1.98(m,2H),1.96(t,J＝12Hz,2H),1.86(d,J＝8Hz,1H),1.71(t,J＝12Hz,3H),1.36(s,3H),1.34(s,3H),1.34–1.28(m,6H),0.82(s,3H).
实施例10
本实施例提供了n＝1、X＝N的式Ⅱ化合物(化合物6)的制备，反应式为：
将按实施例9的方法制得的化合物5(0.1g,0.15mmol)，70％乙酸水溶液3mL加入到25mL单口烧瓶中，在N2保护下，室温搅拌反应30min。反应完全后，将反应体系倾入烧杯中，加入水稀释反应体系，然后加入饱和NaHCO3溶液中和反应体系，直至体系无气泡产生，二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，残渣经柱层析色谱分离纯化(EA:PE＝3:1)，得到淡黄色固体化合物6，产率65％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.03(s,1H),8.02(d,J＝8Hz,1H),7.58(t,J＝4Hz,1H),7.32(t,J＝4Hz,1H),7.14(d,J＝8Hz,2H),6.12(d,J＝4Hz,1H),4.87(s,1H),4.61(q,J＝10Hz,1H),4.54(s,1H),4.38(d,J＝12Hz,1H),4.26(t,J＝8Hz,2H),3.95(d,J＝8Hz,1H),3.49(d,J＝12Hz,1H),3.18(d,J＝12Hz,1H),3.14(t,J＝8Hz,2H),2.51(t,J＝10Hz,2H),2.42(d,J＝16Hz,3H),2.33(s,3H),2.04–1.99(m,2H),1.98(t,J＝12Hz,2H),1.85(d,J＝8Hz,1H),1.73(t,J＝12Hz,3H),1.35–1.29(m,6H),0.81(s,3H).
实施例11
本实施例提供了n＝1、X＝O的中间体d(化合物d2)的制备，反应式为：
将化合物c2(4.7g,16.65mmol)，30mL二氯甲烷加入到50mL单口烧瓶中，在N2保护下，室温搅拌溶解，然后加入草酰氯(4.22g,33.3mmol)，室温搅拌反应30min后，加入20-50μL DMF，室温搅拌反应6h，减压蒸去过量的草酰氯，得到淡黄色油状物d2，产率85％。
实施例12
本实施例提供了n＝1、X＝O的式I化合物(化合物7)的制备，反应式为：
将丙叉基穿心莲内酯(0.40g,1.02mmol)，10mL二氯甲烷加入到50mL单口烧瓶中，在N2保护下，室温搅拌溶解，然后将反应置于低温反应器中降温至0℃，随后加入三乙胺(0.56mL,4.0mmol)，接着逐滴滴加按实施例11方法制得的酰氯d2(0.285g,1.5mmol)的二氯甲烷溶液10mL，混合物在室温搅拌反应1h。反应完全后，加入二氯甲烷稀释反应体系，然后依次用饱和NaHCO3溶液洗涤，水洗，合并水相，用二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，残渣经柱层析色谱分离纯化(EA:PE＝1:2)，得到淡黄色油状化合物7，产率75％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.01(d,J＝8Hz,1H),7.61(t,J＝4Hz,1H),7.35(t,J＝4Hz,1H),7.16(d,J＝8Hz,2H),6.16(d,J＝4Hz,1H),4.87(s,1H),4.59(q,J＝10Hz,1H),4.54(s,1H),4.38(d,J＝12Hz,1H),4.29(t,J＝8Hz,2H),4.21(t,J＝8Hz,2H),3.95(d,J＝8Hz,1H),3.45(d,J＝12Hz,1H),3.18(d,J＝12Hz,1H),2.45(t,J＝10Hz,2H),2.41(d,J＝16Hz,3H),2.30(s,3H),2.16–2.12(m,2H),1.98(t,J＝12Hz,2H),1.87(d,J＝8Hz,1H),1.69(t,J＝12Hz,3H),1.39(s,3H),1.36(s,3H),1.32–1.21(m,6H),0.83(s,3H).
实施例13
本实施例提供了n＝1、X＝O的式Ⅱ化合物(化合物8)的制备，反应式为：
将按实施例12的方法制得的化合物7(0.1g,0.15mmol)，70％乙酸水溶液3mL加入到25mL单口烧瓶中，在N2保护下，室温搅拌反应30min。反应完全后，将反应体系倾入烧杯中，加入水稀释反应体系，然后加入饱和NaHCO3溶液中和反应体系，直至体系无气泡产生，二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤，减压蒸发溶剂，残渣经柱层析色谱分离纯化(EA:PE＝3:1)，得到淡黄色固体化合物8，产率83％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.03(d,J＝8Hz,1H),7.62(t,J＝4Hz,1H),7.32(t,J＝4Hz,1H),7.15(d,J＝8Hz,2H),6.16(d,J＝4Hz,1H),4.87(s,1H),4.59(q,J＝10Hz,1H),4.54(s,1H),4.38(d,J＝12Hz,1H),4.30(t,J＝8Hz,2H),4.19(t,J＝8Hz,2H),3.95(d,J＝8Hz,1H),3.49(d,J＝12Hz,1H),3.18(d,J＝12Hz,1H),2.53(t,J＝10Hz,2H),2.42(d,J＝16Hz,3H),2.30(s,3H),2.16–2.12(m,2H),1.96(t,J＝12Hz,2H),1.87(d,J＝8Hz,1H),1.73(t,J＝12Hz,3H),1.29–1.18(m,6H),0.82(s,3H).
实施例14
本实施例提供了本发明对乙酰肝素酶抑制剂生物活性的研究。
本实施例采用乙酰肝素降解检测试剂盒(insight，INS-26-4-0000-10)检测化合物对乙酰肝素酶的抑制作用。严格按照试剂盒的说明操作，在50μL生物化乙酰肝素与31mIU/L的人重组乙酰肝素酶的反应体系中，加入不同浓度的化合物溶液(1、5、15、30、60、120、180、240)每孔的反应体积为100μL。在37℃条件下，孵育45min；将反应产物转移到孔的显色板中，在37℃条件下，孵育45min；洗板。每孔加入辣根酶标记的卵白素和100μL的辣根酶底物，在37℃条件下，孵育30min后显色；加入100μL的终止液使反应终止，酶标仪检测值。每个药物的浓度做三个平行孔。应用GraphPadPrism 5软件计算IC50值。
实验结果如下表1。
表1乙酰肝素酶抑制剂生物活性的研究
由表1可知，化合物1、化的3、化合物6和化合物8均能有效地抑制乙酰肝素酶的活性，且与阿司匹林相比，抑制活性更高，其中化合物1的抑制效果最好，IC50值达到5.32μM，是良好的乙酰肝素酶抑制剂。
实施例15
本实施例提供了本发明的抗肿瘤活性实验。
本实施例中，药理学实验采用前列腺肿瘤细胞(PC-3)，乳腺癌细胞(MCF-7，MDA-MB-231)和肺癌细胞(A549)，待细胞生长至对数生长期时用胰酶消化细胞，10wt％FBS的培养液中和胰酶后，800g，5min离心收集细胞，除去上层液体，用含有10％FBS的RPMI-1640培养液重悬细胞沉淀，并调节细胞浓度至4×104/mL，在96孔培养板中加入细胞悬液100μL，使每孔细胞数为4×103个，设空白组(不含细胞和药品)和对照组(含有细胞，但无药品)。37℃，5％CO2条件下培养24h，使细胞贴壁，重新进入生长周期。设置5组药品的浓度梯度，每组5个复孔，药物终浓度设为100，50，25，12.5，6.25ng/mL(脂溶性药物3mg用1mL EtOH溶解为30mg/mL的母液，再根据需要用细胞培养液进行稀释，使EtOH的含量不超过1％)，加入药物前，更换细胞培养液，将对应浓度的药物同细胞培养液混合均匀后添加入96孔板对应的细胞中(每孔100μL)；对照组加入相同体积的培养液。在37℃，5％CO2条件下培养继续培养48h后更换新的细胞培养液并在每孔中加入10μL CCK-8细胞增殖检测试剂，37℃，5％CO2条件下孵育3h后，在450nm波长下用酶标仪测定对应吸光度值(A值)。阳性对照药采用临床上抗肿瘤药物紫杉醇(泰素)和阿司匹林为对照药品。
生长抑制率＝(对照组的A值-实验组的A值)/(对照组-空白组)的A值×100％。
实验结果如下表2。
表2乙酰肝素酶抑制剂对不同肿瘤细胞的抑制效果
由表2可知，本发明化合物1、化合物3、化合物6和化合物8对肿瘤细胞具有明显的抑制作用，并且比阿司匹林对肿瘤细胞的抑制作用更强。其中，化合物1和化合物6对MDA-MB-231和PC-3肿瘤细胞的抑制作用，与临床使用的抗肿瘤药物泰素相当。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变化和变型。因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴。