本发明涉及一种光果甘草悬浮细胞培养方法，特别涉及一种能够长时效抑制光果甘草悬浮细胞培养过程中的褐化现象，培养光果甘草悬浮细胞的方法。本发明属于细胞培养技术领域。
背景技术：
甘草(glyrrhlzauralensisfisch)属于豆科(leguminosae)植物、蝶形花科亚科，在我国主要分布于东北、华北和西北。中国主要有有乌拉甘草(glycyrrhizauralensisfisch.)、胀果甘草(glycyrrhizainflatebat.)、光果甘草(glycyrrhizaglabral.)、粗毛甘草(glycyrrhizaasperapall.)、圆果甘草(glycyrrhizasquamulosafranch.)、胀果甘草(glycyrrhizainflatabatal.)、刺果甘草(glycyrrhizapallidifloramaxim.)、云南甘草(glycyrrhizayunnanensischengf.)和无腺毛甘草(glycyrrhizaeglandulosax.y.li)八个品种。甘草中已知的化合物有400多种，其中三萜皂苷类和黄酮类是甘草中的主要活性代谢产物。甘草中三萜皂苷类的主要成分为甘草酸和其糖苷配基物甘草次酸类，它们主要的生理活性为：抗菌、抗炎症、抗过敏等。黄酮类化合物是一种对植物自身发育及抗病等方面发挥重要作用的一类多酚类化合物，具有抗氧化自由基、抗肿瘤等功效。某些黄酮类物质在甘草中存在种属特异性，如而乌拉尔甘草中特异含有甘草香豆素，光甘草定只在光果甘草中含有，光甘草定具有抗氧化、抗肿瘤等生物活性，在化妆品中因其能抑制酪氨酸酶的活性被作美白的功效原料。
甘草被广泛使用，市场需求量逐年增大，严重的采挖导致了产地的生态环境严重破坏。虽然近些年通过人工种植，使得市场对甘草的需求有一定的缓解作用，但是受气候、地域、成材时间较长(几年)和种植管理水平等因素，市场上的甘草药材品质存在明显差异。
植物细胞工程培养技术具有可延续、可控制悬浮细胞的生长周期，可放大进行工业化生产等优势，是解决甘草资源紧张和实现工业化生产甘草次生代谢产物的途径之一。但是光果甘草悬浮细胞在培养过程中，由于受到了来自液体培养基渗透压和摇床或者搅拌所引起的液体剪切作用，对悬浮细胞有机械损伤作用，导致光果甘草悬浮细胞容易出现褐化现象，直接影响光果甘草悬浮细胞的生长，直至悬浮细胞出现死亡(李雅丽，甘草细胞放大培养的过程工程研究，2012)。植物悬浮细胞发生褐化，主要是细胞中的酚类代谢物被多酚氧化酶(ppo)催化生成醌类物质，醌类物质经非酶促反应产生有色物质，导致细胞褐变直接影响细胞内其它酶的生物活性，影响悬浮细胞的正常代谢。植物悬浮细胞培养出现褐化现象，严重时会造成培养容器中的所有悬浮细胞死亡。所以，有效控制光果甘草悬浮细胞发生褐化反应势在必行。
目前，在甘草悬浮细胞培养体系中，减轻褐化现象的方法主要有：(1)调整培养液中蔗糖的浓度，调整培养过程中摇床的转速(李雅丽(2012)，甘草细胞放大培养的过程工程研究，华中科技大学博士学位论文)；(2)在液体培养基中添加抗褐化剂l-半胱氨酸和抗坏血酸(李雅丽(2012)，甘草细胞放大培养的过程工程研究.华中科技大学博士学位论文)；(3)添加吸附剂，如活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)等(骆从艳，王园姬，李超鹏，陈文(2010)，光甘草定抑制酪氨酸酶及体外抗氧化活性的研究，中药材33(11):1776-1780)。这些方法在短时间培养(10天以内)，能有效的抑制甘草悬浮细胞褐化现象的发生，但是对于长时间培养(12-20天)甘草悬浮细胞的褐化现象不能有效抑制。培养过程中进行换液及补充抗褐化剂会增加操作的污染率，加大了工作量不利于进行放大培养。吸附剂添加到培养液中，会吸附培养体系中的激素，导致培养基中的激素浓度降低，同时吸附剂抗褐化效果不显著，生物量(细胞湿重)积累变化不显著。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种能够显著长时间抑制光果甘草悬浮细胞培养(大于10天)过程中出现褐化现象的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种长时效抑制光果甘草悬浮细胞培养过程中出现褐化现象的方法，包括以下步骤：
(1)光果甘草种子细胞的获得
选用固体培养基上连续继代培养，生长状态良好的光果甘草愈伤组织细胞作为悬浮培养的种子细胞；
所述的固体培养基为含有0.5mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、0.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、0.5mg/l萘乙酸(naa)、30g/l蔗糖、4g/l结冷胶、1g/lpvp(4000)和0.5g/l酸水解酪蛋白的ms培养基，用hcl和koh调整ph为5.8-6.0；
(2)光果甘草种子细胞的悬浮培养
将步骤(1)得到的光果甘草种子细胞转入液体培养基中，在培养条件为避光，培养温度为25℃，摇床转速为100rpm的条件下培养获得光果甘草悬浮细胞；
其中，所述的液体培养基为含有0.5mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、0.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、0.5mg/l萘乙酸(naa)、20g/l乳糖以及1mm抗坏血酸钙的ms液体培养基，用hcl和koh调整ph为5.8-6.0。
其中，优选的，所述的ms培养基中包含以下终浓度的各物质：1.65g/lnh4no3、1.90g/lkno3、0.17g/lkh2po4、0.1807g/lmgso4·7h2o、0.332g/lcacl2、22.3mg/lmnso4·4h2o、6.20mg/lh3bo3、0.83mg/lki、8.60mg/lznso4·7h2o、0.25mg/lna2moo4·2h2o、0.025mg/lcuso4·5h2o、0.025mg/lcocl2·6h2o、27.8mg/lfeso4·7h2o、37.3mg/lna2-edta·2h2o、100mg/l肌醇、0.50mg/l烟酸、0.50mg/l维生素b6、0.10mg/l维生素b1和2.0mg/l甘氨酸。
其中，优选的，步骤(2)中将步骤(1)得到的光果甘草种子细胞按照固液比1:100(m:v)转入液体培养基中。
其中，优选的，步骤(2)中所述培养的时间为12-20天。
其中，优选的，所述的液体培养基用0.22μm亲水性滤膜抽滤除菌。
一种用于长时效抑制光果甘草悬浮细胞培养过程中褐化现象的培养基也在本发明的保护范围之内，所述的培养基为液体培养基，所述的培养基为含有0.5mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、0.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、0.5mg/l萘乙酸(naa)、20g/l乳糖以及1mm抗坏血酸钙的ms液体培养基，用hcl和koh调整ph为5.8-6.0。
其中，优选的，所述的ms培养基中包含以下终浓度的各物质：1.65g/lnh4no3、1.90g/lkno3、0.17g/lkh2po4、0.1807g/lmgso4·7h2o、0.332g/lcacl2、22.3mg/lmnso4·4h2o、6.20mg/lh3bo3、0.83mg/lki、8.60mg/lznso4·7h2o、0.25mg/lna2moo4·2h2o、0.025mg/lcuso4·5h2o、0.025mg/lcocl2·6h2o、27.8mg/lfeso4·7h2o、37.3mg/lna2-edta·2h2o、100mg/l肌醇、0.50mg/l烟酸、0.50mg/l维生素b6、0.10mg/l维生素b1和2.0mg/l甘氨酸。
其中，优选的，所述的培养基用0.22μm亲水性滤膜抽滤除菌。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
采用本发明的方法培养，能长时效的抑制光果甘草悬浮细胞培养过程中出现褐化现象。长时间(20天)抑制光果甘草悬浮细胞褐化的效果良好，同时细胞生物量积累明显增加。此外，本发明方法操作简单，获得的甘草悬浮细胞分散性好，生长状态好，为光果甘草细胞的放大培养提供了一种有效的技术手段。
附图说明
图1为不同碳源条件下光果甘草悬浮细胞褐化程度的比较；
图2为不同抗褐化剂抑制光果甘草悬浮细胞褐化程度的比较；
图3为不同抗褐化剂对光果甘草悬浮细胞生物增长量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一种长时效抑制光果甘草悬浮细胞培养褐化现象的方法的建立
1、光果甘草种子细胞的获得
选用固体培养基上连续继代培养，生长状态良好的光果甘草愈伤组织细胞作为悬浮培养的种子细胞；
固体培养基为ms(murashige-skoog)培养基，即以ms培养基为基础，添加以下质量体积浓度(终浓度)的物质：0.5mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、0.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、0.5mg/l萘乙酸(naa)、30g/l蔗糖、4g/l结冷胶、1g/lpvp(4000)和0.5g/l酸水解酪蛋白，用hcl和koh调整ph为5.8-6.0。
所述ms培养基中包含以下终浓度的各物质：1.65g/lnh4no3、1.90g/lkno3、0.17g/lkh2po4、0.1807g/lmgso4·7h2o、0.332g/lcacl2、22.3mg/lmnso4·4h2o、6.20mg/lh3bo3、0.83mg/lki、8.60mg/lznso4·7h2o、0.25mg/lna2moo4·2h2o、0.025mg/lcuso4·5h2o、0.025mg/lcocl2·6h2o、27.8mg/lfeso4·7h2o、37.3mg/lna2-edta·2h2o、100mg/l肌醇、0.50mg/l烟酸、0.50mg/l维生素b6、0.10mg/l维生素b1和2.0mg/l甘氨酸。
2、碳源的筛选
将上述准备好的疏松愈伤组织种子细胞按照固液比1:100(每100ml液体培养基，接种1g愈伤组织细胞)转入液体培养基中，培养条件为避光，培养温度为25℃，摇床转速为100rpm。
所述的液体培养基与上述固体培养基的区别在于：1)不添加结冷胶、pvp(4000)和酸水解酪蛋白；2)碳源改为20g/l蔗糖、20g/l果糖、20g/l葡萄糖或20g/l乳糖；3)加入1mm的抗坏血酸钙，其余成分与上述固体培养基相同。液体培养基用0.22μm亲水性滤膜抽滤除菌。
通过连续监测培养液od420吸光值，结果显示：以蔗糖为碳源连续培养至第12天，培养液od420的吸光值相对于第一天增加了101.50％±6.63，以果糖为碳源组其培养液褐化程度增加了138.31％±15.22，以葡萄糖为碳源组其培养液褐化程度增加了102.92％±19.36，以乳糖为碳源组其培养液褐化程度增加了90.00％±14.87。因此，果糖为碳源组的悬浮细胞褐化程度是四种碳源组中最严重的(图1)。以葡萄糖为碳源组到从第10天后，与蔗糖为碳源组相比悬浮细胞褐化程度相当，没有显著差别(图1)。以乳糖为碳源组的悬浮细胞褐化程度从第6天开始直到第12天成下降趋势，与蔗糖相比能显著的改善光果甘草悬浮细胞的褐化现象，特别是到第12天乳糖为碳源组的悬浮细胞褐化程度比蔗糖组的极显著降低(图1)。所以，四种碳源中乳糖改善光果甘草悬浮细胞褐化现象的效果最好最稳定。(*p<0.05,**p<0.01)。
3、抗褐化抑制剂的筛选
将上述准备好的疏松愈伤组织种子细胞按照固液比1:100(每100ml液体培养基，接种1g愈伤组织细胞)转入液体培养基中，培养条件为避光，培养温度为25℃，摇床转速为100rpm。
所述的液体培养基与上述固体培养基的区别在于：1)不添加结冷胶、pvp(4000)和酸水解酪蛋白；2)碳源改为20g/l乳糖；3)加入1mm的抗坏血酸钙或抗坏血酸，其余成分与上述固体培养基相同。液体培养基用0.22μm亲水性滤膜抽滤除菌。另设不添加抗褐化抑制剂的培养基作为对照。
通过连续监测培养中od420吸光值，结果显示：对照组不添加任何抗褐化剂，悬浮细胞褐化现象从第2天到第8天不严重，第8天到第18天褐化现象逐步增加变严重。添加抗褐化剂抗坏血酸组，悬浮细胞褐化程度从第2天到第8天，相对于对照组抑制效果明显，从第10天后抑制褐化效果降低，悬浮细胞褐化程度增加比对照组还严重。添加抗坏血酸钙组，对悬浮细胞褐化现象的抑制能力逐步增强，从第10天开始抑制悬浮细胞褐化的能力表现出最强且稳定。当培养至第18天后，对照组(不添加褐化剂)，第18天褐化程度相对于第一天增加了16.84％±1.55；添加1mm抗坏血酸组，第18天褐化程度相对于第一天增加了19.41％±2.25；添加1mm抗坏血酸钙(抗坏血酸衍生物)组，第18天褐化程度相对于第一天增加了9.38％±1.16。添加抗坏血酸钙组悬浮体系的褐化程度比对照组下降了44.33％，比抗坏血酸组下降了51.69％(图2)。
通过邻苯二酚比色法测定第18天悬浮细胞中多酚氧化酶的活力(ppo)，结果显示：对照组中ppo为98.63±13.03u/g，添加1mm抗坏血酸组的悬浮细胞中的ppo为81.37±9.36u/g，添加抗坏血酸钙组的悬浮细胞的ppo为61.50±11.07u/g。添加了抗坏血酸钙组的悬浮细胞中的ppo活力比对照组减少了37.67％，比添加了抗坏血酸组的悬浮细胞中的ppo活力减少了24.44％。
甘草悬浮细胞连续培养18天后，过滤并吸干掉培养液，进行湿重称量比较抗褐化剂对悬浮细胞生物增长量的影响。结果显示：悬浮细胞连续培养18天后，对照组悬浮细胞湿重为1.64±0.10g，生物量增长了64.0％；添加抗坏血酸组悬浮细胞湿重为2.71±0.28g，生物量增长了171.0％；添加抗坏血酸钙组悬浮细胞湿重为5.02±0.43g，生物量增长了402.0％。添加抗坏血酸钙组悬浮细胞连续培养18天的生物增长量，比对照组高出528.13％，比添加抗坏血酸组高出135.09％。从以上结果可以得出，添加抗褐化剂抗坏血酸钙能长时间抑制悬浮细胞褐化现象，并且能促进悬浮细胞生物量的增加(图3)。
综合以上，以乳糖为碳源，抗坏血酸钙为抗褐化剂的悬浮培养体系，对悬浮细胞长时间培养的褐化现象抑制效果最好，同时能提高悬浮细胞的生物增长量，所获得的光果甘草悬浮细胞生长状态好，分散均匀，是一种优秀的长时效抑制植物悬浮细胞褐化现象的培养体系。