一种微粒载体的标记和鉴别方法及其应用与流程

文档序号:15457511发布日期:2018-09-15 01:31

本发明涉及核酸检测技术领域,具体涉及一种微粒载体的标记和鉴别方法及其应用。



背景技术:

作为基因和表达基因的载体,核酸检测是生物医学研究及应用中的一个重要方面。目前,主流的核酸检测技术有Northern blot、RT-PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片和二代测序技术。

Northern blot用于检测特异性的RNA,是最经典的基因表达检测方法,可定性或定量地检测基因的表达水平,但检测通量较低,且操作步骤繁琐,技术要求较高。

RT-PCR技术大体分为定性RT-PCR和定量的实时荧光定量RT-PCR两种,通常用于mRNA表达丰度的检测,可以通过定量比较内标RNA和目标RNA之间的信号强度,确定目的RNA分子的相对含量,实现对目标核酸分子的定量检测。

根据探针的种类,实时荧光定量RT-PCR使用与激发光检测装置耦联的PCR仪,在PCR过程中实时检测荧光信号。运用该项技术,可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。实时荧光定量RT-PCR的技术优点包括:1)被检测样本RNA起始浓度的线性范围宽;2)荧光监测反应灵敏度高,精确度高3)样品不需要进行扩增后分析,仅需要预先知道样本大致的丰度范围。实时荧光定量RT-PCR已得到广泛应用,取得了很大进展。在非典疫情期间,曾用于检测SARS冠状病毒。RT-PCR的检测灵敏度比Northern blot更高,需要的RNA样本量也较少。但由于其涉及两个连续的酶促反应体系,技术复杂度更高,这也对检测过程的控制提出的更高的要求。

Northernblot、RT-PCR、实时荧光定量PCR三个检测方案的通量较低,只适合少数几个核酸分子的同时检测。考虑到生物体系的是一个复杂的调控网络,任何一点的变化都会引起整个网络的适应性调整。为了实现对基因或基因表达的多重检测,近年来包括基因芯片和二代测序技术在内的高通量核酸检测方案得到了迅猛的发展。高通量核酸检测在技术上的突破,也为其临床应用带来了光明的前景。

二代测序技以一次平行测定几十万到几百万条DNA分子的序列,测序读长一般为40至100多个碱基。高通量的优势,使其能对一个物种的基因组或转录组进行全面而细致的分析。实验流程大体包括核酸样本制备、测序文库构建、测序反应和数据分析四个步骤。根据技术方案的独特性,目前的二代测序主要有大规模平行签名测序、聚合酶克隆、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序、DNA纳米球测序等。

基因芯片的技术原理是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段,将大量探针片段有序地固化于支持物的表面,制成高密度DNA微阵列,用于检测样品中是否有与之互补的序列。通过对玻片进行激光共聚焦扫描,测定微阵列上各点的荧光强度,推算待测样品中各种基因的表达水平。目前,基因芯片已被成功用于基因表达量的检测、基因诊断和药物筛选等生命科学领域。基因芯片技术的最大优点是分析通量高,还能检测两组样品中基因表达量的差异。但存在着灵敏度低、定量特异性差、需昂贵的仪器和信号分析软件、且在探针制备和杂交环节均存在相当的技术难度。



技术实现要素:

为了克服现有技术的上述不足,本发明的目的提供一种微粒载体的标记和鉴别方法及其应用,本发明利用人工合成的、带有一定量可检测基团的标记分子,实现了对微球载体的精准定量标记,显著提高了对同一类微球载体标记的稳定性和可区分度。并将该微粒载体的标记和鉴别方法应用于核酸和微生物的检测。

为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:

一种微粒载体的标记和鉴别方法,包括以下步骤:

1)获得一种微粒载体,所述微粒载体表面具有至少一种可偶联的基团;

2)获得至少一种可检测的标记分子,每种标记分子含有至少一种可独立检测的标记基团、以及至少一种可与微粒载体表面可偶联基团发生偶联的基团;

3)在一定的偶联条件下,使一定量的至少一种可检测的标记分子与一定量的微粒载体进行接触并偶联,使标记分子特异性地标记所述微粒载体;

4)通过检测与微粒载体偶联的标记分子,鉴别所述被标记的微粒载体的类型,所述标记分子的检测方式为定性检测或定量检测中的至少一种。

进一步地,所述微粒载体选自琼脂糖凝胶微珠、葡聚糖凝胶微珠、纤维素微珠、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酸酯脂质体复合微粒、壳聚糖微粒、金磁微粒、玻璃珠。

进一步地,所述微粒载体的直径为10纳米~1000微米。

进一步地,所述可偶联基团选自抗原分子、抗体分子、链亲和素、生物素。

进一步地,所述可检测的标记分子选自寡核苷酸分子、多肽分子、多糖分子、树形高分子、人工合成的高分子。

一种核酸分子的检测方法,包括以下步骤:

1)获得一种微粒载体,所述微粒载体表面具有至少一种可偶联的基团;

2)获得至少一种可检测标记分子,每种标记分子含有至少一种可独立检测的标记基团、以及至少一种可与微粒载体表面的可偶联基团进行偶联的基团;

3)获得一种捕获探针分子,该捕获探分子针含有一段特异性的核酸序列和至少一种可偶联的基团,所述核酸序列能够与被检测的目标核酸分子形成一定程度的互补配对,所述可偶联的基团可与微粒载体表面的可偶联基团发生偶联作用;

4)使可检测标记分子、捕获探针分子与微粒载体表面的可偶联基团偶联,获得一种能够特异性结合待测目标核酸分子的、且具有可检测标记的特异性检测载体;

5)对待测目标核酸分子进行可检测性标记;

6)在核酸杂交条件下,使步骤5)获得的被标记的待测目标核酸分子与步骤4)获得的特异性检测载体接触,使待测目标核酸分子与偶联于检测载体表面的捕获探针进行杂交,获得待测目标核酸分子与特异性检测载体的结合体;

7)获得步骤6)中的待测目标核酸分子与特异性检测载体的结合体,检测所述检测载体上的标记分子的种类和强度、以及待测目标核酸上的可检测标记的种类和强度,确定待测目标核酸分子的存在和含量。

进一步地,所述捕获探针选自寡聚核糖核酸分子、寡聚脱氧核糖核酸分子、同时含有核糖核酸和脱氧核糖核酸寡聚核酸分子。

进一步地,步骤4)中特异性检测载体的合成方法为:在一定的偶联条件下,首先使一定量的至少一种可检测标记分子与一定量的微粒载体进行接触并结合,使标记分子特异性地标记所述微粒载体;然后将一定量的捕获探针分子与一定量的被标记的微粒载体进行接触并结合,获得能够特异性结合目标核酸分子的特异性检测载体。

进一步地,步骤4)中特异性检测载体的合成方法为:在一定的偶联条件下,使一定量的至少一种可检测标记分子、一种捕获探针分子与一定量的微粒载体进行接触,使标记分子、捕获探针分子与微粒载体表面结合,获得能够特异性结合目标核酸分子的、且具有可检测标记的特异性检测载体。

本发明还提供了上述核酸分子的检测方法的应用,所述核酸分子的检测方法应用于基因表达检测。

基于上述核酸分子的检测方法,本发明还提供了一种核酸分子的检测试剂,该检测试剂包括微粒载体、可检测标记分子、捕获探针分子、以及相应的偶联缓冲液、杂交缓冲液和标记检测试剂,所述微粒载体表面具有至少一种可偶联基团,所述可检测标记分子含有至少一种可独立检测的标记基团、以及至少一种可与微粒载体的可偶联基团偶联的基团或分子,所述捕获探针分子能与微粒载体偶联且能与待测目标核酸分子杂交。

本发明还提供了一种微生物的检测方法,该检测方法包括以下步骤:

1)获得一种微粒载体,所述微粒载体表面具有至少一种可偶联的基团;

2)获得至少一种可检测的标记分子,每种标记分子含有至少一种可独立检测的标记基团、以及至少一种可与微粒载体的可偶联的基团进行偶联的基团;

3)获得一种捕获探针分子,该捕获探分子针含有一段特异性的核酸序列和至少一种可偶联的基团,所述核酸序列能够与被检测微生物所含的目标核酸分子形成一定程度的互补配对,所述可偶联的基团可与微粒载体表面的可偶联基团发生偶联作用;

4)使可检测标记分子、捕获探针分子与微粒载体表面结合,获得能够特异性结合被测微生物所含的目标核酸分子、且具有可检测标记的特异性检测载体;

5)获得被检测微生物所含有的目标核酸分子,进行可检测性标记;

6)在核酸杂交条件下,使步骤5)获得的被标记的核酸分子与步骤4)获得的特异性检测载体接触,使目标核酸分子与检测载体表面的捕获探针进行杂交,获得目标核酸分子与特异性检测载体的结合体;

7)获得步骤6)中的待测目标核酸分子与特异性检测载体的结合体,检测载体的标记分子的种类和强度、以及目标核酸分子上的可检测标记的种类和强度,确定被测微生物中所含核酸分子的存在及其含量,从而确定被检测微生物的存在及其数量。

进一步地,步骤4)中特异性检测载体的合成方法为:在一定的偶联条件下,首先使一定量的至少一种可检测的标记分子与一定量的微粒载体进行接触并结合,使标记分子特异性地标记所述微粒载体;然后将一定量的捕获探针分子与一定量的被标记的微粒载体进行接触并结合,获得能够特异性结合被测微生物所含目标核酸分子的特异性检测载体。

进一步地,步骤4)中特异性检测载体的合成方法为:在一定的偶联条件下,使一定量的至少一种可检测的标记分子、一种捕获探针分子与一定量的微粒载体进行接触,使标记分子、捕获探针分子与微粒载体表面结合,获得能够特异性结合被测微生物所含目标核酸分子、且具有可检测标记的特异性检测载体。

最后,本发明提供了所述的的微生物的检测方法的应用,所述微生物检测方法应用于临床病原微生物、食品微生物、农产品微生物、畜禽病源微生物的检测。

与现有技术相比,本发明的有益效果在于:

(1)本发明利用人工合成的、带有一定量可检测基团的标记分子,实现了对微粒载体的精准定量标记,显著提高了对同一类微粒载体标记的稳定性和可区分度。

(2)基于本发明的微粒载体的标记和鉴定方法,本发明也提供了一种核酸分子的检测方法和一种微生物的检测方法,能够对数十种已知的核酸分子和数十种已知的微生物进行快速、便捷的定性和定量检测,具有高通量、高精度、稳定性好的优点。

附图说明

图1为实施例1中检测微粒载体的荧光图像。

图2为实施例1中不同标记微粒所捕获的核酸样本的定量分析结果。

图3为实施例2中对微粒载体数量的优化分析结果。

图4为实施例2中对杂交温度的优化分析结果。

图5为实施例2中对杂交时间的优化结果。

图6为实施例2中对杂交体积条件的优化结果。

图7为实施例3中一种捕获探针对单一核酸样本的检测特异性研究结果。

图8为实施例3中一种捕获探针对混合核酸样本的检测特异性研究结果。

图9为实施例3中不同的microRNA类似物浓度与荧光强度的线性标准曲线。

图10为实施例4中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔氏菌、单增李斯特菌内参分子的标准曲线。

图11为实施例4中空肠弯曲杆菌、肠出血大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌内参分子的标准曲线。

图12为实施例5中乙肝病毒、丙肝病毒内参分子的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图,进一步阐述本发明。应当理解,这些实施例仅用于说明本发明而不能用于限制本发明的范围。可以从材料、方法和反应条件等方面对本发明所公开的内容进行改进,所有这些改进,均应落入本发明的范围之内。非特殊说明,本发明实施例所采用的试剂均为市售商品,本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人编著的《分子克隆:实验室手册》(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。

一种微粒载体的标记和鉴别方法,包括以下步骤:

1)获得一种微粒载体,所述微粒载体表面具有至少一种可偶联的基团;

2)获得至少一种可检测的标记分子,每种标记分子含有至少一种可独立检测的标记基团、以及至少一种可与微粒载体表面可偶联基团发生偶联的基团;

3)在一定的偶联条件下,使一定量的至少一种可检测的标记分子与一定量的微粒载体进行接触并偶联,使标记分子特异性地标记所述微粒载体;

4)通过检测与微粒载体偶联的标记分子,鉴别所述被标记的微粒载体的类型,所述标记分子的检测方式为定性检测或定量检测中的至少一种。

其中,所述微粒载体选自琼脂糖凝胶微珠、葡聚糖凝胶微珠、纤维素微珠、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酸酯脂质体复合微粒、壳聚糖微粒、金磁微粒、玻璃珠,优选为琼脂糖凝胶微珠;所述微粒载体的直径为10纳米~1000微米,优选为100纳米~200微米,更优选为10微米~100微米;所述可偶联基团选自抗原分子、抗体分子、链亲和素、生物素,优选为链亲和素;所述可检测的标记分子选自寡核苷酸分子、多肽分子、多糖分子、树形高分子、人工合成的高分子,优选为寡核苷酸分子、多肽分子、树形高分子,更优选为寡核苷酸分子;所述可独立检测的标记基团选自荧光基团、同位素、磷酸酶、抗原,优选为荧光基团。

基于上述微粒载体的标记和鉴别方法,本发明提出了一种核酸分子的检测方法,包括以下步骤:

1)获得一种微粒载体,所述微粒载体表面具有至少一种可偶联的基团;

2)获得至少一种可检测标记分子,每种标记分子含有至少一种可独立检测的标记基团、以及至少一种可与微粒载体表面的可偶联基团进行偶联的基团;

3)获得一种捕获探针分子,该捕获探分子针含有一段特异性的核酸序列和至少一种可偶联的基团,所述核酸序列能够与被检测的目标核酸分子形成一定程度的互补配对,所述可偶联的基团可与微粒载体表面的可偶联基团发生偶联作用;

4)使可检测标记分子、捕获探针分子与微粒载体表面的可偶联基团偶联,获得一种能够特异性结合待测目标核酸分子的、且具有可检测标记的特异性检测载体;

5)对待测目标核酸分子进行可检测性标记;

6)在核酸杂交条件下,使步骤5)获得的被标记的待测目标核酸分子与步骤4)获得的特异性检测载体接触,使待测目标核酸分子与偶联于检测载体表面的捕获探针进行杂交,获得待测目标核酸分子与特异性检测载体的结合体;

7)获得步骤6)中的待测目标核酸分子与特异性检测载体的结合体,检测所述检测载体上的标记分子的种类和强度、以及待测目标核酸上的可检测标记的种类和强度,确定待测目标核酸分子的存在和含量。

其中,所述所述捕获探针选自寡聚核糖核酸分子、寡聚脱氧核糖核酸分子、同时含有核糖核酸和脱氧核糖核酸寡聚核酸分子,优选为寡聚脱氧核糖核酸分子;步骤4)中特异性检测载体的合成方法为:在一定的偶联条件下,首先使一定量的至少一种可检测标记分子与一定量的微粒载体进行接触并结合,使标记分子特异性地标记所述微粒载体;然后将一定量的捕获探针分子与一定量的被标记的微粒载体进行接触并结合,获得能够特异性结合目标核酸分子的特异性检测载体;或者步骤4)中特异性检测载体的合成方法为:在一定的偶联条件下,使一定量的至少一种可检测标记分子、一种捕获探针分子与一定量的微粒载体进行接触,使标记分子、捕获探针分子与微粒载体表面结合,获得能够特异性结合目标核酸分子的、且具有可检测标记的特异性检测载体。

上述核酸分子的检测方法应用于基因表达检测,如应用于制备核酸分子的检测试剂,该检测试剂包括微粒载体、可检测标记分子、捕获探针分子、以及相应的偶联缓冲液、杂交缓冲液和标记检测试剂,所述微粒载体表面具有至少一种可偶联基团,所述可检测标记分子含有至少一种可独立检测的标记基团、以及至少一种可与微粒载体的可偶联基团偶联的基团或分子,所述捕获探针分子能与微粒载体偶联且能与待测目标核酸分子杂交。

上述核酸分子的检测方法也可以应用于检测微生物,一种微生物的检测方法,包括以下步骤:

1)获得一种微粒载体,所述微粒载体表面具有至少一种可偶联的基团;

2)获得至少一种可检测的标记分子,每种标记分子含有至少一种可独立检测的标记基团、以及至少一种可与微粒载体的可偶联的基团进行偶联的基团;

3)获得一种捕获探针分子,该捕获探分子针含有一段特异性的核酸序列和至少一种可偶联的基团,所述核酸序列能够与被检测微生物所含的目标核酸分子形成一定程度的互补配对,所述可偶联的基团可与微粒载体表面的可偶联基团发生偶联作用;

4)使可检测标记分子、捕获探针分子与微粒载体表面结合,获得能够特异性结合被测微生物所含的目标核酸分子、且具有可检测标记的特异性检测载体;

5)获得被检测微生物所含有的目标核酸分子,进行可检测性标记;

6)在核酸杂交条件下,使步骤5)获得的被标记的核酸分子与步骤4)获得的特异性检测载体接触,使目标核酸分子与检测载体表面的捕获探针进行杂交,获得目标核酸分子与特异性检测载体的结合体;

7)获得步骤6)中的待测目标核酸分子与特异性检测载体的结合体,检测载体的标记分子的种类和强度、以及目标核酸分子上的可检测标记的种类和强度,确定被测微生物中所含核酸分子的存在及其含量,从而确定被检测微生物的存在及其数量。

上述微生物检测方法中捕获探针选自寡聚核糖核酸分子、寡聚脱氧核糖核酸分子、同时含有核糖核酸和脱氧核糖核酸寡聚核酸分子;步骤4)中特异性检测载体的合成方法为:在一定的偶联条件下,首先使一定量的至少一种可检测的标记分子与一定量的微粒载体进行接触并结合,使标记分子特异性地标记所述微粒载体;然后将一定量的捕获探针分子与一定量的被标记的微粒载体进行接触并结合,获得能够特异性结合被测微生物所含目标核酸分子的特异性检测载体;步骤4)中特异性检测载体的合成方法也可以为:在一定的偶联条件下,使一定量的至少一种可检测的标记分子、一种捕获探针分子与一定量的微粒载体进行接触,使标记分子、捕获探针分子与微粒载体表面结合,获得能够特异性结合被测微生物所含目标核酸分子、且具有可检测标记的特异性检测载体。

上述的微生物的检测方法可应用于临床病原微生物、食品微生物、农产品微生物、畜禽病源微生物的检测。

实施例1:核酸检测方案的实验流程

本发明提供的核酸检测方案包括六个操作步骤:微粒载体的荧光标记、捕获探针包载、核酸样本提取、核酸样本的荧光标记、液相杂交和杂交信号分析。现以3T3-L1细胞中microRNA-146b-5p(5’-ugagaacugaauuccauaggcu,核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)的表达水平检测为例,说明本发明提供的技术方案。

1、微粒载体的荧光标记:本实施例使用的微粒载体为购自GE Healthcare Bio-Sciences公司的琼脂糖微球(StreptavidinHigh Performance,17-5113-01),该微球表面偶联有可与生物素结合的链亲和素分子。用于荧光标记(荧光编码)琼脂糖微球的标记分子为人工合成的寡脱氧核糖核酸分子,其序列如SEQ ID NO:2所示,3'末端均含有生物素基团,使其能够与琼脂糖微球表面的链亲和素分子基团偶联。此外,这两个分子的5'-末端均具有可检测的荧光基团,标记分子1的荧光标记为:5’-Alexa488-aaaaaaaaaa-biotin,标记分子2的荧光标记为:5’-Texas Red-aaaaaaaaaa-biotin。

标记反应:在75μL的总反应体系中,加入一定量的琼脂糖微球(本实施例反应中,加入5×103个琼脂糖微球)。加入一定量的标记分子1和一定量的标记分子2,两者的总浓度为0.2pmol/μL(本实施例反应中,加入0.1pmol/μL的标记分子1和0.1pmol/μL标记分子2)。根据加入标记分子1和标记分子2的相对含量,可对不同的琼脂糖微球进行可识别的差异化编码。

2、捕获探针包载:根据microRNA-146b-5p的核酸序列,设计与其序列互补的捕获探针,捕获探针序列如SEQ ID NO:3所示。合成捕获探针,在其5'末端偶联生物素基团(capture-146b-5p:5’-biotin-aaaaaaaaaaagcctatggaattcagttctca),使其能够与琼脂糖微球表面的链亲和素基团偶联。

捕获探针的包载反应如下:在100μL反应体系中,加入5×103个琼脂糖微球、终浓度10pM的内参核酸捕获探针,内参核酸捕获探针序列如SEQ ID NO:4所示(capture-reference:5’-biotin-aaaaaaaaaaagtcagtcagtcagtcagtcagtc)、终浓度40pM的capture-146b-5p捕获探针。

3、核酸样本提取:利用GIBCO公司的DMEM培养基培养3T3-L1细胞,培养液中含有10%的胎牛血清、100units/mL的青霉素和100μg/mL链霉素(Life Technologies),培养条件为37℃、5%CO2。利用Invitrogen的Trizol试剂,提取培养细胞的总RNA。

为了检测总RNA样本的质量,取一定量的RNA样本,上样到8%的变性PAGE凝胶上,进行电泳分离。观察18S、28S rRNA条带的完整性和含量的关系,确定所提取的总RNA样本的质量是否合格。对于检测合格的总RNA样本,利用NanoDrop 2000超微量分光光度计(NanoDrop Technologies)进行定量,储存于-80℃冰箱中备用。

4、核酸样本的荧光标记:利用Mirus公司的Label IT Cy5试剂盒,对获得的总RNA及参入的内参核酸,内参核酸序列如SEQ ID NO:5所示(reference DNA:5'-gactgactgactgactgactgact)进行荧光标记。按照试剂盒的说明书进行操作,步骤具体如下:1)取5μg总RNA样本,加入DNase/RNase-free去离子水至40μL,加入10×Labeling BufferA 5μL,Label IT Reagent 5μL,总反应体积为50μL;2)将反应体系置于37℃条件下孵育1小时;3)使用G50Microspin纯化柱纯化标记后的样本,用于随后的液相杂交反应。

5、液相杂交:在40μL的液相杂交体系中,加入一定量的被标记的琼脂糖微球,加入一定量标记的总RNA样本。使反应体系在一定的杂交温度下条件下孵育一定的时间,完成杂交反应。本实施例杂交反应加入的琼脂糖微球量为1×103,加入的总RNA样本量为400ng,杂交温度25℃,杂交时间为40分钟。

6、杂交信号分析:使用Perkin Elmer公司的Operetta High Content Screening andAnalysis系统,获得微球载体的杂交荧光图像。利用该系统的Columbus图像数据存储和分析系统(Columbus Image Data Storage andAnalysis system),分析获得的荧光图像,对目标核酸进行定性和定量分析。分析过程具体如下:

1)背景荧光的去除:在每个反应中,均包括一定量无任何包被的原始形态的参照微球,用于去除检测过程中产生的背景荧光信号。利用这些参照微球,确定各个荧光通道的背景值。在去除荧光背景的情况下,完成后续分析。

2)琼脂糖微球的荧光编码:通过计算每个微球A488荧光值与Texas Red荧光值的比值,确定该微球的荧光编码比值(A488/Texas Red)。以某种微球荧光编码的理论值为基准,确定位于该基准值附件的微球,作为该荧光编码微球的候选群体。获得每个候选群体中间80%的微球个体,用于后续分析。

3)目标核酸的荧光定量:检测每个编码微球的Cy5荧光值,减去背景荧光值、以及由于荧光干涉造成的误差荧光值,获得该微球目标核酸的荧光检测值。

4)目标核酸的相对和绝对定量:以参入的内参核酸分子的含量为基础,通过计算目标核酸分子Cy5荧光值与内参核酸分子荧光值的比值,计算目标核酸分子的相对表达量。也可以通过建立目标核酸分子与内参分子的校准曲线计算目标核酸分子的绝对含量。

分别加入不同相对含量的标记分子1和标记分子2时,微球载体的检测图像如图1所示,(图1中标志的Alexa为荧光染料Alexa488,图1中标志的Texas为荧光染料Texas Red,Alexa:Texas=4:1表示Alexa 488的浓度与Texas Red浓度之比为4:1),目标核酸分子定量检测结果如图2所示(图中A表示Alexa:Texas=4:1,B表示Alexa:Texas=2:1,C表示Alexa:Texas=1:2,D表示Alexa:Texas=1:4)。结果表明根据加入标记分子1和标记分子2的相对含量,可对不同的琼脂糖微球进行可识别的差异化编码,通过荧光检测不仅能区分具有不同荧光编码的琼脂糖微球,还能实现目标核酸分子的定性和定量分析。

实施例2:核酸检测方案的技术优化

为了建立稳定的液相杂交方案,本发明对杂交条件进行了系统优化。实验材料和实验过程具体如下。

A、微球载体:GE Healthcare Bio-Sciences公司的StreptavidinHigh Performance琼脂糖微球载体。

B、微球标记分子:

标记分子1:5’-Alexa 488-AAAAAAAAAA-biotin

标记分子2:5’-Texas Red-AAAAAAAAAA-biotin

C、检测核酸样本:以化学合成四种microRNA类似物,作为检测样本,其RNA序列如SEQ ID NO:6~SEQ ID NO:9所示。

mmu-miR-146b-5p:5’-ugagaacugaauuccauaggcu

mmu-miR-222-3p:5’-agcuacaucuggcuacugggu

mmu-miR-302a-3p:5’-uaagugcuuccauguuuugguga

mmu-miR-let-7d-5p:5’-agagguaguagguugcauaguu

D、捕获探针:以被检测microRNA的序列为基础,设计特异性影响的捕获探针,其序列如SEQ ID NO:10~SEQ ID NO:13所示。

Cap-miRNA146b:5’-biotin-aaaaaaaaaaagcctatggaattcagttctca

Cap-miRNA222:5’-biotin-aaaaaaaaaaacccagtagccagatgtagct

Cap-miRNA302a:5’-biotin-aaaaaaaaaatcaccaaaacatggaagcactta

Cap-miRNAlet7d:5’-biotin-aaaaaaaaaaaactatgcaacctactacctct

E、样本标记试剂:Mirus公司的Label IT Cy5试剂盒。

F、图像采集和数据分析:Perkin公司Operetta High Content Screening and Analysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统。

1、微球载体使用量的优化

按照实施例1描述的方案,用总浓度为0.2pmol/μL的四种标记分子的混合物,荧光编码四种琼脂糖微球。其中,用于包载Cap-miRNA146b捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载Cap-miRNA222捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包载Cap-miRNA302a捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载Cap-miRNA let7d捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

按照实施例1描述的方案,将四种捕获探针分别包载于琼脂糖微球表面。每种琼脂糖微球仅包载一种捕获探针,分别为Cap-miRNA146b、Cap-miRNA222、Cap-miRNA302a和Cap-miRNAlet7d。

按照实施例1描述的方案,利用Mirus公司提供的Label IT Cy5试剂盒,对化学合成的四种microRNA类似物分子(microRNA-146b、microRNA-222、microRNA-302a和microRNA-let7d)进行Cy5荧光标记。

按照实施例1描述的方案,在40μL的杂交体系中,加入四种等量的包载不同捕获探针的琼脂糖微球。如图3所示,每个反应中每种琼脂糖微球的加入量分别为1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103和7×103。向每个反应中加入四种等量的荧光标记的microRNA类似物,每种12.5ng。在25℃条件下孵育40分钟,完成杂交反应。

按照实施例1描述的方案,利用Perkin Elmer公司的Operetta High Content Screening andAnalysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统,获得并分析杂交后微球载体的荧光图像,获得的结果如图3所示。发现随着微球载体使用量的增加,每个微球载体捕获的目标核酸的杂交信号逐步降低,这与预期是相符的。根据这个实验结果,确定在后续实验中,每个杂交反应琼脂糖微球的使用量为2×103

2、杂交温度方案的优化

按照实施例1描述的方案,用总浓度为0.2pmol/uL的四种标记分子的混合物,荧光编码四种琼脂糖微球。其中,用于包载Cap-miRNA146b捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载Cap-miRNA222捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包载Cap-miRNA302a捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载Cap-miRNA let7d捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

按照实施例1描述的方案,将四种捕获探针分别包载于琼脂糖微球表面。每种琼脂糖微球仅包载一种捕获探针,分别为Cap-miRNA146b、Cap-miRNA222、Cap-miRNA302a和Cap-miRNAlet7d。

按照实施例1描述的方案,利用Mirus公司提供的Label IT Cy5试剂盒,对化学合成的四种microRNA类似物分子(microRNA-146b、microRNA-222、microRNA-302a和microRNA-let7d)进行Cy5荧光标记。

按照实施例1描述的方案,在40μL的杂交体系中,加入四种等量的包载不同捕获探针的琼脂糖微球,每种微球的数量为2×103。向每个反应中加入四种等量的荧光标记的microRNA类似物,每种12.5ng。利用三种不同的杂交温度方案进行杂交反应。其中a方案:在65℃条件下杂交10分钟,随后迅速将杂交温度降低至室温,继续杂交50分钟。b方案:室温杂交60分钟。c方案:在65℃条件下杂交10分钟;将杂交温度降低至55℃,杂交10分钟;将杂交温度继续降低至45℃,杂交10分钟;将杂交温度降低至35℃,杂交10分钟;将杂交温度降低至25℃,杂交10分钟;结束杂交过程。

按照实施例1描述的方案,利用Perkin Elmer公司的Operetta High Content Screening andAnalysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统,获得并分析杂交后微球载体的荧光图像如图4所示。发现不同的杂交方案对实验结果的影响不大。根据这个实验结果,确定采用室温(25℃)孵育方案。

3、杂交时间方案的优化

按照实施例1描述的方案,用总浓度为0.2pmol/μL的四种标记分子的混合物,荧光编码四种琼脂糖微球。其中,用于包载Cap-miRNA146b捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载Cap-miRNA222捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包载Cap-miRNA302a捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载Cap-miRNA let7d捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

按照实施例1描述的方案,将四种捕获探针分别包载于琼脂糖微球表面。每种琼脂糖微球仅包载一种捕获探针,分别为Cap-miRNA146b、Cap-miRNA222、Cap-miRNA302a和Cap-miRNAlet7d。

按照实施例1描述的方案,利用Mirus公司提供的Label IT Cy5试剂盒,对化学合成的四种microRNA类似物分子(microRNA-146b、microRNA-222、microRNA-302a和microRNA-let7d)进行Cy5荧光标记。

按照实施例1描述的方案,在40μL的杂交体系中,加入四种等量的包载不同捕获探针的琼脂糖微球,每种微球的使用量为2×103。向每个反应中加入四种等量的荧光标记的microRNA类似物,每种12.5ng。在25℃条件下将三个反应分别孵育10分钟、20分钟、30分钟和40分钟。

按照实施例1描述的方案,利用Perkin Elmer公司的Operetta High Content Screening andAnalysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统,获得并分析杂交后微球载体的荧光图像如图5所示。结果显示,随着孵育时间的延长,杂交信号逐步升高,这与预期是相符的。根据这个实验结果,确定后续采用25℃孵育40分钟的杂交方案。

4、杂交体积方案的优化

按照实施例1描述的方案,用总浓度为0.2pmol/uL的四种标记分子的混合物,荧光编码四种琼脂糖微球。其中,用于包载Cap-miRNA146b捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载Cap-miRNA222捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包载Cap-miRNA302a捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载Cap-miRNA let7d捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

按照实施例1描述的方案,将四种捕获探针分别包载于琼脂糖微球表面。每种琼脂糖微球仅包载一种捕获探针,分别为Cap-miRNA146b、Cap-miRNA222、Cap-miRNA302a和Cap-miRNAlet7d。

按照实施例1描述的方案,利用Mirus公司提供的Label IT Cy5试剂盒,对化学合成的四种microRNA类似物分子(microRNA-146b、microRNA-222、microRNA-302a和microRNA-let7d)进行Cy5荧光标记。

按照实施例1描述的方案,在40μL、60μL、80μL、100μL的杂交体系中,加入四种等量的包载不同捕获探针的琼脂糖微球,每种微球的使用量为2×103。向每个反应中加入四种等量的荧光标记的microRNA类似物,每种12.5ng。在25℃条件下孵育40分钟,完成杂交反应。

按照实施例1描述的方案,利用Perkin Elmer公司的Operetta High Content Screening andAnalysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统,获得并分析杂交后微球载体的荧光图像如图6所示。结果显示,杂交体积对信号检测的影响不大,确定后续研究的杂交体积为40μL。

实施例3:核酸检测方案的技术验证

为了验证本发明技术方案的灵敏度和特异性,本发明开展了核酸检测方案的技术验证研究。实验材料和实验过程具体如下。

A、微球载体:GE Healthcare Bio-Sciences公司的StreptavidinHigh Performance琼脂糖微球载体。

B、微球标记分子:

标记分子1:5’-Alexa 488-AAAAAAAAAA-biotin

标记分子2:5’-Texas Red-AAAAAAAAAA-biotin

C、检测核酸样本:以化学合成四种microRNA类似物,作为检测样本,其RNA序列如SEQ ID NO:6~SEQ ID NO:9所示。

mmu-miR-146b-5p:5’-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU

mmu-miR-222-3p:5’-AGCUACAUCUGGCUACUGGGU

mmu-miR-302a-3p:5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA

mmu-miR-let-7d-5p:5’-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU

D、捕获探针:以被检测microRNA的序列为基础,设计特影响的捕获探针,其序列如SEQ ID NO:10~SEQ ID NO:13所示。

Cap-miRNA146b:5’-biotin-aaaaaaaaaaAGCCTATGGAATTCAGTTCTCA

Cap-miRNA222:5’-biotin-aaaaaaaaaaACCCAGTAGCCAGATGTAGCT

Cap-miRNA302a:5’-biotin-aaaaaaaaaaTCACCAAAACATGGAAGCACTTA

Cap-miRNAlet7d:5’-biotin-aaaaaaaaaaAACTATGCAACCTACTACCTCT

E、样本标记试剂:Mirus公司的Label IT Cy5试剂盒。

F、图像采集和数据分析:Perkin公司Operetta High Content Screening and Analysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统。

1、检测方案的特异性研究—单一样本检测

按照实施例1描述的方案,用总浓度为0.2pmol/uL的四种标记分子的混合物,荧光编码四种琼脂糖微球。其中,用于包载Cap-miRNA146b捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载Cap-miRNA222捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包载Cap-miRNA302a捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载Cap-miRNA let7d捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

按照实施例1描述的方案,将四种捕获探针分别包载于琼脂糖微球表面。每种琼脂糖微球仅包载一种捕获探针,分别为Cap-miRNA146b、Cap-miRNA222、Cap-miRNA302a和Cap-miRNAlet7d。

按照实施例1描述的方案,利用Mirus公司提供的Label IT Cy5试剂盒,对化学合成的四种microRNA类似物分子(microRNA-146b、microRNA-222、microRNA-302a和microRNA-let7d)进行Cy5荧光标记。

按照实施例1描述的方案,在四个40μL的杂交体系中,加入四种等量的包载不同捕获探针的琼脂糖微球,每种微球的使用量为2×103。向每个杂交体系中各加入一种荧光标记的microRNA类似物12.5ng。在25℃条件下孵育40分钟,完成杂交反应。

按照实施例1描述的方案,利用Perkin Elmer公司的Operetta High Content Screening andAnalysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统,获得并分析杂交后微球载体的荧光图像如图7所示。实验结果表明,单一样本检测时,一种捕获探针仅能捕获与其序列互补的microRNA类似物分子,具有较好的特异性。

2、检测方案的特异性研究—混合样本检测

按照实施例1描述的方案,用总浓度为0.2pmol/uL的四种标记分子的混合物,荧光编码四种琼脂糖微球。其中,用于包载Cap-miRNA146b捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载Cap-miRNA222捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包载Cap-miRNA302a捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载Cap-miRNA let7d捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

按照实施例1描述的方案,将四种捕获探针分别包载于琼脂糖微球表面。每种琼脂糖微球仅包载一种捕获探针,分别为Cap-miRNA146b、Cap-miRNA222、Cap-miRNA302a和Cap-miRNAlet7d。

按照实施例1描述的方案,利用Mirus公司提供的Label IT Cy5试剂盒,对化学合成的四种microRNA类似物分子(microRNA-146b、microRNA-222、microRNA-302a和microRNA-let7d)进行Cy5荧光标记。

按照实施例1描述的方案,在四个40μL的杂交体系中,加入四种等量的包载不同捕获探针的琼脂糖微球,每种微球的使用量为2×103。向每个反应中加入四种等量的荧光标记的microRNA类似物,每种12.5ng。在25℃条件下孵育40分钟,完成杂交反应。

按照实施例1描述的方案,利用Perkin Elmer公司的Operetta High Content Screening andAnalysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统,获得并分析杂交后微球载体的荧光图像。获得如图8所示的单一样本、混合样本的检测结果对比分析图,实验结果表明,混合样本并未影响本技术方案对目标分子的检测能力,混合样本检测时,一种捕获探针仅能捕获与其序列互补的microRNA类似物分子,具有较好的特异性。

3、检测方案的灵敏度研究

按照实施例1描述的方案,用总浓度为0.2pmol/uL的四种标记分子的混合物,荧光编码四种琼脂糖微球。其中,用于包载Cap-miRNA146b捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载Cap-miRNA222捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包载Cap-miRNA302a捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载Cap-miRNA let7d捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

按照实施例1描述的方案,将四种捕获探针分别包载于琼脂糖微球表面。每种琼脂糖微球仅包载一种捕获探针,分别为Cap-miRNA146b、Cap-miRNA222、Cap-miRNA302a和Cap-miRNAlet7d。

按照实施例1描述的方案,利用Mirus公司提供的Label IT Cy5试剂盒,对化学合成的四种microRNA类似物分子(microRNA-146b、microRNA-222、microRNA-302a和microRNA-let7d)进行Cy5荧光标记。

按照实施例1描述的方案,在40μL杂交体系中,加入四种等量的包载不同捕获探针的琼脂糖微球,每种微球的使用量为2×103。向每个反应中加入一种不同浓度的荧光标记的microRNA类似物,在25℃条件下孵育40分钟,完成杂交反应。

按照实施例1描述的方案,利用Perkin Elmer公司的Operetta High Content Screening andAnalysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统,获得并分析杂交后微球载体的荧光图像,由荧光图像得到的结果如图9所示。根据所建立的校准曲线(calibration curve),发现对不同microRNA类似物的检测灵敏度均达到了pM级,并且在一个较大的范围内具有很好的线性相关性。

实施例4:食品相关微生物的检测

为了实现食品相关微生物的定量检测,本发明开展了本实施例研究。实验材料及实验过程具体如下。

A、微球载体:GE Healthcare Bio-Sciences公司的StreptavidinHigh Performance琼脂糖微球载体。

B、微球标记分子:

标记分子1:5’-Alexa 488-aaaaaaaaaa-biotin

标记分子2:5’-Texas Red-aaaaaaaaaa-biotin

C、微生物特异性捕获探针,其序列如SEQ ID NO:14~SEQ ID NO:33所示:

沙门氏菌Cap-invA-1:5'-aaaaaaaaaagtgaaattatcgccacgttcgggcaa

沙门氏菌Cap-invA-2:5'-aaaaaaaaaatcatcgcaccgtcaaaggaacc

志贺氏菌Cap-ipaH-1:5'-aaaaaaaaaagttccttgaccgcctttccgataccgtc

志贺氏菌Cap-ipaH-2:5'-aaaaaaaaaagccggtcagccaccctctgagagtac

金黄色葡萄球菌Cap-femA-1:5'-aaaaaaaaaaaaaaaagcacataacaagcg

金黄色葡萄球菌Cap-femA-2:5'-aaaaaaaaaagataaagaagaaaccagcag

小肠结肠炎耶尔氏菌Cap-16s-1:5'-aaaaaaaaaaaataccgcataacgtcttcg

小肠结肠炎耶尔氏菌Cap-16s-2:5'-aaaaaaaaaacttcttctgcgagtaacgtc

单增李斯特菌Cap-prfA-1:5'-aaaaaaaaaagatacagaaacatcggttggc

单增李斯特菌Cap-prfA-2:5'-aaaaaaaaaagtgtaatcttgatgccatcag

空肠弯曲杆菌Cap-VS1-1:5'-aaaaaaaaaagatatgtatgattttatcttgc

空肠弯曲杆菌Cap-VS1-2:5'-aaaaaaaaaagaatgaaattttagaatgggg

肠出血大肠埃希氏菌Cap-efbE-1:5'-aaaaaaaaaaattgcgctgaagcctttg

肠出血大肠埃希氏菌Cap-efbE-2:5'-aaaaaaaaaacgagtacattggcatcgtg

副溶血性弧菌Cap-tlH-1:5'-aaaaaaaaaaaaagcggattatgcagaagcactg

副溶血性弧菌Cap-tlH-2:5'-aaaaaaaaaagctactttctagcattttctctgc

霍乱弧菌Cap-ompW-1:5'-aaaaaaaaaacaccaagaaggtgactttattgtg

霍乱弧菌Cap-ompW-2:5'-aaaaaaaaaagaacttataacccgcg

创伤弧菌Cap-vvhA-1:5'-aaaaaaaaaaccgcggtacaggttggcgca

创伤弧菌Cap-vvhA-2:5'-aaaaaaaaaacgccacccactttcgggcc

D、样本标记试剂:Mirus公司的Label IT Cy5试剂盒。

E、图像采集和数据分析:Perkin公司Operetta High Content Screening and Analysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统。

为了保持检测的准确性和稳定性,针对每种微生物设计了2个捕获探针分子,将每2个微生物(计4个捕获探针)作为一组进行检测,分组情况如下。

第一组:沙门氏菌Cap-invA-1,沙门氏菌Cap-invA-2,志贺氏菌Cap-ipaH-1,志贺氏菌Cap-ipaH-2;第二组:金黄色葡萄球菌Cap-femA-1,金黄色葡萄球菌Cap-femA-2,小肠结肠炎耶尔氏菌Cap-16s-1,小肠结肠炎耶尔氏菌Cap-16s-2;第三组:单增李斯特菌Cap-prfA-1,单增李斯特菌Cap-prfA-2,空肠弯曲杆菌Cap-VS1-1,空肠弯曲杆菌Cap-VS1-2;第四组:肠出血大肠埃希氏菌Cap-efbE-1,肠出血大肠埃希氏菌Cap-efbE-2,副溶血性弧菌Cap-tlH-1,副溶血性弧菌Cap-tlH-2;第五组:霍乱弧菌Cap-ompW-1,霍乱弧菌Cap-ompW-2,创伤弧菌Cap-vvhA-1,创伤弧菌Cap-vvhA-2。

按照实施例1描述的方案,用总浓度为0.2pmol/uL的四种标记分子的混合物,荧光编码四种琼脂糖微球。其中,用于包载沙门氏菌Cap-invA-1捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载沙门氏菌Cap-invA-2捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包志贺氏菌Cap-ipaH-1捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载志贺氏菌Cap-ipaH-2捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

用于包载金黄色葡萄球菌Cap-femA-1捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载金黄色葡萄球菌Cap-femA-2捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包小肠结肠炎耶尔氏菌Cap-16s-1捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载小肠结肠炎耶尔氏菌Cap-16s-2捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

用于包载单增李斯特菌Cap-prfA-1捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载单增李斯特菌Cap-prfA-2捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包空肠弯曲杆菌Cap-VS1-1捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载空肠弯曲杆菌Cap-VS1-2捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

用于包载肠出血大肠埃希氏菌Cap-efbE-1捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载肠出血大肠埃希氏菌Cap-efbE-2捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包副溶血性弧菌Cap-tlH-1捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载副溶血性弧菌Cap-tlH-2捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

用于包载霍乱弧菌Cap-ompW-1捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载霍乱弧菌Cap-ompW-2捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包载创伤弧菌Cap-vvhA-1捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载创伤弧菌Cap-vvhA-2捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

按照实施例1描述的方案,将内参核酸、微生物特异性的捕获探针分组包载于琼脂糖微球表面,每种琼脂糖微球仅包载一种捕获探针。

按照国家标准《SNT 1869-2007食品中多种致病菌快速检测方法PCR法》中所描述的技术方案,对食品中的微生物进行增菌并提取其中的核酸成分,用于本实施例研究。

按照实施例1描述的方案,利用Mirus公司提供的Label IT Cy5试剂盒,对获得的微生物核酸样本、以及参入的内参核酸(内参核酸序列如SEQ ID NO:6所示,reference DNA:5'-gactgactgactgactgactgact)样本进行Cy5荧光标记。

按照实施例一描述的方案,在一个40μL杂交体系中,加入一组四种等量的、包载不同捕获探针的琼脂糖微球,每种微球的使用量为2×103。向反应体系中加入上述获得的、相应的2种微生物荧光标记的核酸样本400ng,在25℃条件下孵育40分钟,完成杂交反应。

按照实施例1描述的方案,利用Perkin Elmer公司的Operetta High Content Screening andAnalysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统,获得并分析杂交后微球载体的荧光图像。利用目标核酸分子与内参分子的标准校准曲线(如图10和图11所示),计算目标核酸分子的含量。对两个捕获探针的检测结果进行均一化处理,获得检测样本中食品相关微生物的核酸含量如下:

沙门氏菌核酸含量:586pM

志贺氏菌核酸含量:264pM

金黄色葡萄球菌核酸含量:79pM

小肠结肠炎耶尔氏菌核酸含量:430pM

单增李斯特菌核酸含量:114pM

空肠弯曲杆菌核酸含量核酸含量:34pM

肠出血大肠埃希氏菌核酸含量:210pM

副溶血性弧菌核酸含量:46pM

霍乱弧菌核酸含量:25pM

创伤弧菌核酸含量:137pM

实施例5:临床病原微生物的检测

为了实现病原微生物的定量检测,本发明开展了本实施例研究。实验材料和实验过程具体如下。

A、微球载体:GE Healthcare Bio-Sciences公司的StreptavidinHigh Performance琼脂糖微球载体。

B、微球标记分子:

标记分子1:5’-Alexa 488-aaaaaaaaaa-biotin

标记分子2:5’-Texas Red-aaaaaaaaaa-biotin

C、病原微生物特异性捕获探针,其序列如SEQ ID NO:34~SEQ ID NO:37所示:

乙肝病毒Cap-HBV-1:5'-aaaaaaaaaaccggaaagcttgactttttcacc

乙肝病毒Cap-HBV-2:5'-aaaaaaaaaaccggaaagcttgtcaaaaagtt

丙肝病毒Cap-HCV-1:5'-aaaaaaaaaaacccaacactactcggctag

丙肝病毒Cap-HCV-2:5'-aaaaaaaaaaatcactcccctgtgaggaac

D、样本标记试剂:Mirus公司的Label IT Cy5试剂盒。

E、图像采集和数据分析:Perkin公司Operetta High Content Screening and Analysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统。

为了保持检测的准确性和稳定性,针对每种微生物设计了2个捕获探针分子,按照实施例1描述的方案,用总浓度为0.2pmol/uL的四种标记分子的混合物,荧光编码四种琼脂糖微球。其中,用于包载乙肝病毒Cap-HBV-1捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=4:1,用于包载乙肝病毒Cap-HBV-2捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=2:1,用于包载丙肝病毒Cap-HCV-1捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:2,用于包载丙肝病毒Cap-HCV-2捕获探针的琼脂糖微球的荧光编码为:标记分子1的浓度/标记分子2的浓度=1:4。

按照实施例1描述的方案,将内参核酸、病原微生物特异性的捕获探针分组包载于琼脂糖微球表面,每种琼脂糖微球仅包载一种捕获探针。

获得来源于乙型肝炎患者、丙型肝炎患者来源的组织样本,按照常规的技术方案,提取其中的核酸成分。

按照实施例1描述的方案,利用Mirus公司提供的Label IT Cy5试剂盒,对获得的核酸样本、以及参入的内参核酸(内参核酸序列如SEQ ID NO:6所示,reference DNA:5'-gactgactgactgactgactgact)样本进行Cy5荧光标记。

按照实施例1描述的方案,在一个40μL杂交体系中,加入四种等量的包载不同捕获探针的琼脂糖微球,每种微球的使用量为2×103。向反应体系中加入上述获得的荧光标记的核酸样本400ng,在25℃条件下孵育40分钟,完成杂交反应。

按照实施例1描述的方案,利用Perkin Elmer公司的Operetta High Content Screening andAnalysis系统和Columbus图像数据存储和分析系统,获得并分析杂交后微球载体的荧光图像。利用目标核酸分子与内参分子的标准校准曲线(如图12所示),计算目标核酸分子的含量。对两个捕获探针的检测结果进行均一化处理,获得病原关微生物的核酸含量如下:

甲肝病毒核酸含量:125pM

丙肝病毒核酸含量:178pM

以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的应用范围包括且不限于以下方面。

1、临床病原微生物的检测,包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌、立克次体、螺旋体;还包括耐药基因的检测、细胞因子的检测、肿瘤标志物的检测和人类基因表达谱的检测。

2、食品相关微生物的检测,包括:1)菌落总数的检测;2)大肠菌群的检测;3)致病菌的检测,如沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、创伤弧菌、肉毒梭菌、乳酸菌等的检测;4)霉菌及酵母菌的检测;5)病毒的检测,如肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马芷克氏病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒,猪水泡病毒的检测。

3、农产品相关微生物的检测包括:1)菌落总数的检测;2)大肠菌群的检测;3)致病菌的检测,如沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、创伤弧菌、肉毒梭菌、乳酸菌等的检测;4)霉菌及酵母菌的检测;5)病毒的检测,如肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马芷克氏病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒,猪水泡病毒的检测。

4、畜禽病源微生物的检测,具体包括以下微生物类型和种类:

一类是动物病原微生物的检测,包括口蹄疫病毒、高致病性禽流感病毒、猪水泡病病毒、非洲猪瘟病毒、非洲马瘟病毒、牛瘟病毒、小反刍兽疫病毒、牛传染性胸膜肺炎丝状支原体、牛海绵状脑病病原、痒病病原。

二类是动物病原微生物的检测,包括猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、狂犬病病毒、绵羊痘/山羊痘病毒、蓝舌病病毒、兔病毒性出血症病毒、炭疽芽孢杆菌、布氏杆菌。

三类是动物病原微生物的检测,包括:

1)多种动物共患病病原微生物:低致病性流感病毒、伪狂犬病病毒、破伤风梭菌、气肿疽梭菌、结核分支杆菌、副结核分支杆菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、致病性链球菌、李氏杆菌、产气荚膜梭菌、嗜水气单胞菌、肉毒梭状芽孢杆菌、腐败梭菌和其他致病性梭菌、鹦鹉热衣原体、放线菌、钩端螺旋体。

2)牛病病原微生物的检测,所述病原微生物包括牛恶性卡他热病毒、牛白血病病毒、牛流行热病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒腹泻/粘膜病病毒、牛生殖器弯曲杆菌、日本血吸虫。

3)绵羊和山羊病病原微生物的检测,所述病原微生物包括山羊关节炎/脑脊髓炎病毒、梅迪/维斯纳病病毒、传染性脓疱皮炎病毒。

4)猪病病原微生物的检测,所述病原微生物包括日本脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪丹毒杆菌、猪支气管败血波氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪密螺旋体。

5)马病病原微生物的检测,所述病原微生物包括马传染性贫血病毒、马动脉炎病毒、马病毒性流产病毒、马鼻炎病毒、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、假皮疽组织胞浆菌、溃疡性淋巴管炎假结核棒状杆菌。

6)禽病病原微生物的检测,所述病原微生物包括鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒、小鹅瘟病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽白血病/肉瘤病毒、禽网状内皮组织增殖病病毒、鸡传染性贫血病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡减蛋综合征病毒、禽痘病毒、鸡病毒性关节炎病毒、禽传染性脑脊髓炎病毒、副鸡嗜血杆菌、鸡毒支原体、鸡球虫。

7)兔病病原微生物的检测,所述病原微生物包括兔粘液瘤病病毒、野兔热土拉杆菌、兔支气管败血波氏杆菌、兔球虫。

8)水生动物病病原微生物的检测,所述病原微生物包括流行性造血器官坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、马苏大麻哈鱼病毒、病毒性出血性败血症病毒、锦鲤疱疹病毒、斑点叉尾鮰病毒、病毒性脑病和视网膜病毒、传染性胰脏坏死病毒、真鲷虹彩病毒、白鲟虹彩病毒、中肠腺坏死杆状病毒、传染性皮下和造血器官坏死病毒、核多角体杆状病毒、虾产卵死亡综合症病毒、鳖鳃腺炎病毒、Taura综合症病毒、对虾白斑综合症病毒、黄头病病毒、草鱼出血病毒、鲤春病毒血症病毒、鲍球形病毒、鲑鱼传染性贫血病毒。

9)蜜蜂病病原微生物的检测,所述病原微生物包括美洲幼虫腐臭病幼虫杆菌、欧洲幼虫腐臭病蜂房蜜蜂球菌、白垩病蜂球囊菌、蜜蜂微孢子虫、跗腺螨、雅氏大蜂螨。

10)其他动物病病原微生物的检测,所述病原微生物包括犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒、猫泛白细胞减少综合症病毒、水貂阿留申病病毒、水貂病毒性肠炎病毒。

以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉尚码生物科技有限公司

<120> 一种微粒载体的标记和鉴别方法及其应用

<160> 37

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ugagaacuga auuccauagg cu 22

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ugagaacuga auuccauagg cu 22

<210> 7

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<212> RNA

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<212> RNA

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<212> RNA

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<212> DNA

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再多了解一些
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