恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及ii型鲤疱疹病毒的检测技术，具体涉及恒温实时检测ii型鲤疱疹病毒的rpa试剂盒及其专用引物和探针，及在检测ii型鲤疱疹病毒的应用。

背景技术：

疱疹病毒性造血器官坏死病(herpesviralhaematopoieticnecrosis，hvhn)是金(鲫)鱼的一种高致病性病毒病，其病原为ii型鲤疱疹病毒(cyprinidherpesvirus2，cyhv-ii)，上述病害频发给鲫鱼养殖业造成了破坏性影响。鲤疱疹病毒属(cyprinivirus)属于有囊膜的含双链线性大dna基因组病毒，核衣壳成六边形，直径为175～200nm^[1-5]，cyhv-ii感染鲫鱼可引起其内脏组织、鳃和体表广泛性出血，导致鲫的死亡率高达90％以上。

cyhv-ii常规检测技术中，lamp技术反应原理复杂，引物设计繁琐，并且在引物设计时针对靶标序列所需要的保守区段较为严格，反应产物不均一，不利于后期的测序构建克隆，因此没有得到普遍应用；pcr技术耗时较长，成本较高，而且需要精密温度循环仪器，严重限制pcr技术在现场检测中的应用。近年来，恒温核酸扩增技术的出现解决pcr技术的局限性，且更加方便、迅速，是一种快速检测cyhv-ii的可行性技术手段。

重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepoly-meraseamplification，rpa)是恒温核酸扩增技术的一种，rpa利用t4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsx和uvsy、单链结合蛋白gp32和bsudna聚合酶三种酶在37～42℃对目标片段进行等温扩增，可以在20～40min完成数十亿的dna拷贝。rpa与荧光定量pcr技术(real-timepcr)相结合，rpa技术应用于诊断检测时，向反应体系中加入特异性的特定类型探针，可以达到实时荧光检测。进行检测时应用twistampexo探针，此探针携带一个荧光基团和一个荧光淬灭剂，分别与一个胸腺嘧啶结合，中间由一个四氢呋喃(thf)碱基隔开，当此结构完整时，荧光强度低。探针的3'端予以封闭，阻断以此寡核苷酸序列充当引物进行扩增。当探针与靶序列结合时，连接荧光基团和淬灭基团的thf碱基位点就会被核酸内切酶识别并酶解，下游的淬灭基团被释放，荧光强度增强；酶切后产生的游3'-oh作为dna聚合酶的靶点并扩增此探针，荧光强度也会随着其扩增而增强，检测时间也大大缩短。

技术实现要素：

为克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供恒温实时检测ii型鲤疱疹病毒的rpa试剂盒及其专用引物和探针，基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepoly-meraseamplification，rpa)与实时定量pcr技术(real-timepcr)结合，实现ii型鲤疱疹病毒(cyhv-ii)的快速检测。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

用于恒温实时检测ii型鲤疱疹病毒的rpa专用引物，是根据ii型鲤疱疹病毒目的基因设计的，且所述ii型鲤疱疹病毒目的基因序列为：

cccaggagaccagcagactgttgaacccgtaccttgccaccaagggacagcgggtcgatccgtctaacttgtacattcccgacggtatctttgtgacttacacgcctactggaccagaccccggagtggcgcacggtggcggttactattacagaccttcgctgcagggtttcggctctatgatggacgaggcggatacgttggacgatctgcaggccaacgttctgtatagcaatcagggtcagtggacgagactggcgttgt。

优选地，所述rpa专用引物的正向引物序列为cccaggagaccagcagactgttgaacccgtac；所述rpa专用引物的反向引物序列为gtatccgcctcgtccatcatagagccgaaacc。

本发明的第二方面，用于恒温实时检测ii型鲤疱疹病毒的探针，是根据ii型鲤疱疹病毒目的基因设计的，且所述ii型鲤疱疹病毒目的基因序列为：

cccaggagaccagcagactgttgaacccgtaccttgccaccaagggacagcgggtcgatccgtctaacttgtacattcccgacggtatctttgtgacttacacgcctactggaccagaccccggagtggcgcacggtggcggttactattacagaccttcgctgcagggtttcggctctatgatggacgaggcggatacgttggacgatctgcaggccaacgttctgtatagcaatcagggtcagtggacgagactggcgttgt。

优选地，所述探针序列为：

cactctggcgacgcgtttgtggttgaaccgcca(bhq1-dt)c(thf)g(fam-dt)ggaggcttcaaaggc(c3spacer)。

优选地，所述探针序列在第34个bp位置有一个(bhq1-dt)基团，在第36bp位置有一个(thf)基团，在38bp位置有一个(fam-dt)基团，尾部含有一个(c3spacer)修饰。

需要进一步说明的是，根据rpa引物设计原则，rpa对引物长度的要求是30～35bp，扩增产物在500bp之内时，扩增效率较高；由于引物个别碱基差异会对扩增效果产生影响，为快速、灵敏检测ii型鲤疱疹病毒，需要进行多次引物筛选。在本发明的优选实施例中，委托上海生物工程公司设计针对cyhv-ii目的基因的特异性引物序列和探针序列，然后通过在保守基因区域设计一系列梯度候选引物，并根据rpa凝胶检测结果从中选择最佳引物。

本发明的第三方面，恒温实时检测ii型鲤疱疹病毒的rpa试剂盒，包括上述rpa专用引物和上述探针。

优选地，恒温实时检测ii型鲤疱疹病毒的rpa试剂盒，还包括含有orf72质粒的阳性对照。

优选地，恒温实时检测ii型鲤疱疹病毒的rpa试剂盒，还包括含有无菌ddh2o的阴性对照。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明针对cyhv-ii病毒设计的rpa专用引物和探针能够获得需要的cyhv-ii目的基因，是运用rpa技术检测ii型鲤疱疹病毒的关键，目前没有针对ii型鲤疱疹病毒的rpa专用引物和探针，具有特异性。

(2)本发明用于检测ii型鲤疱疹病毒的rpa试剂盒可以快速且成功检测鲤疱疹病毒cyhv-ii，37℃时最快反应10min即可判断检测样品阳性还是阴性。

附图说明

图1为实施例2rpa检测的特异性评价效果；

图2为实施例3rpa检测的敏感性评价效果。

具体实施方式

下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述实施例。

实施例1用于恒温实时检测ii型鲤疱疹病毒的的rpa专用引物和探针设计与筛选

本实施例委托上海生物工程公司设计针对cyhv-ii目的基因的特异性引物序列和探针序列，其中：

正向引物序列为cccaggagaccagcagactgttgaacccgtac；

反向引物序列为gtatccgcctcgtccatcatagagccgaaacc。

探针序列为：

cactctggcgacgcgtttgtggttgaaccgcca(bhq1-dt)c(thf)g(fam-dt)ggaggcttcaaaggc(c3spacer)。

实施例2rpa检测的特异性评价

首先按照如下步骤提取cyhv-ii病毒，包括：

(1)加入适量pbs缓冲液混合均匀，以8000rpm离心5min，弃上清；

(2)加入1ml缓冲液和20μl蛋白酶在56℃水浴中保温3h；

(3)在8000rpm离心5min，取750μl上清液中于新离心管中，加入体积比为25:24:1的苯酚：氯仿：异戊醇，以50rpm的速度混合10min后以8000rpm离心5min，再取650μl上清液于新离心管中，重复上述操作且保证不吸入蛋白层；

(4)取600μl上清液于新离心管中，加入体积比为24:1的氯仿：异戊醇后以50rpm的速度混合10min，再8000rpm离心5min；

(5)取480μl上清液于新离心管中，加入40μl3mol/l的醋酸钠和960μl4℃乙醇，轻摇可见白色絮状物；

(6)在-20℃放置20-30min后以12000rpm离心10min，弃去上清液；

(7)用200ul75％的乙醇洗涤，14000rpm离心5min，弃上清；重复上述步骤一次后，晾干后用50ul的超纯水洗涤，于-20℃保存备用。

再按照以下组成和配比的反应体系进行rpa-realtimepcr反应，其中，上游引物2.1μl，下游引物2.1μl，荧光探针0.6μl，rehydrationbuffer29.5μl，病毒dna2μl，ddh2o11.2μl，总量为47.5μl。

然后，在最佳条件下用ii型鲤疱疹病毒dna进行检测上述rpa引物和探针的分子特异性，选取cyhv-ii的dna，ihhnv，wssv，gcrv102株，gcrv106株作为模板分析进行荧光定量pcr技术(real-timepcr)鉴别，实验结果如附图1所示，其中，1号样品为阳性cyhv-ii病毒样品，2-6分别为ihhnv，wssv，gcrv102株，gcrv106株和水。

实施例3rpa检测的敏感性评价

cyhv-ii病毒的提取方法同实施例2，然后取cyhv-ii的dna进行倍数稀释，每个稀释度进行rpa荧光定量pcr扩增，其中，1和2为阳性dna样品，且2为稀释10倍的阳性dna样品，3为阴性对照水。实验结果如附图2所示，1号阳性样品在第5个循环(4min左右)就可以检测到明显条带，在第10个循环就可以观察到显著性实验结果(8min左右)；2号样品在第10个循环(8min左右)可以检测到明显条带，在第15个循环可以观察到显著性实验结果(16min左右)；3号阴性样品无非特异性扩增条带。

实施例4恒温实时检测ii型鲤疱疹病毒的rpa试剂盒效果评价

通过cyhv-ii常规检测技术如普通荧光定量pcr、pcr、lamp^[2、6、7]与本发明恒温实时检测ii型鲤疱疹病毒的rpa试剂盒采用rpa-荧光定量pcr检测cyhv-ii，从反应时间、反应温度、仪器和反应步骤进行测试和说明，如表1所示。

表1检测cyhv-ii技术对比数据

从表1中的对比数据可以看出，rpa与荧光定量pcr技术(real-timepcr)相结合，用于诊断检测cyhv-ii时，向反应体系中加入特异性的特定类型探针，可以达到实时荧光检测。进行检测时应用本发明中含有专用引物和探针的rpa试剂盒，其中，探针在第34个bp位置有一个(bhq1-dt)基团，在第36bp位置有一个(thf)基团，在38bp位置有一个(fam-dt)基团，尾部含有一个(c3spacer)修饰。当探针与靶序列结合时，连接荧光基团和淬灭基团的thf碱基位点就会被核酸内切酶识别并酶解，下游的淬灭基团被释放，荧光强度增强；酶切后产生的游3'-oh作为dna聚合酶的靶点并扩增此探针，荧光强度也会随着其扩增而增强，检测时间也大大缩短，10min之内即可获得检测结果；而且rpa技术的如下三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶在常温下有活性，可以快速且成功检测鲤疱疹病毒cyhv-ii，37℃时最快反应10min即可判断检测样品阳性还是阴性。

参考文献：

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以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

序列表

<110>上海海洋大学

<120>恒温实时检测ii型鲤疱疹病毒的rpa试剂盒及其专用引物和探针

<130>20180201

<141>2018-02-01

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>264

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>