本发明涉及生物学领域，特别涉及一种含有人巨细胞病毒ul140基因的重组质粒、基因工程菌及其应用。
背景技术：
：巨细胞病毒感染是由人巨细胞病毒(hcmv)引起的常见病毒性感染之一。在新生儿、免疫低下和免疫抑制病人(如艾滋病、器官移植或肿瘤)可引起严重感染，甚至导致死亡。hcmv感染的发病情况与机体的免疫功能状态关系密切。原发性hcmv感染时，病毒在人体血液中以单核和多形核白细胞为载体，扩散至全身各个器官。hcmv在正常人群中传播极为广泛，很少导致明显疾病，大多数人呈潜伏感染。但这对免疫减弱或损伤的人群(免疫缺陷、器官移植、肿瘤、艾滋病病人和孕妇)构成极大威胁。因此，亟待建立新的诊断方法的研究，提高对潜伏感染、少量持续性感染和侵袭性hcmv感染的检测能力。细胞毒性t细胞(ctl)是肿瘤多肽疫苗诱导机体产生抗肿瘤反应的主要细胞，抗原诱导ctl反应经过3个基本反应：蛋白酶体降解抗原蛋白为多肽片段、抗原加工相关转运体将多肽片段转运至内质网、mhc-ⅰ类分子与抗原肽结合并提呈。人类白细胞抗原是人的主要组织相容性复合物，在移植排斥反应中起关键作用，降低hla的表达，可以延长移植物的存活时间(w.e保罗，fundamentalimmunology,2003)。hcmv可通过下调经典mhc-ⅰ和mhc-ⅱ类分子表达，抑制抗原提成细胞(apc)的抗原提呈功能和cd8+ctl对靶细胞的杀伤。mhc-ⅰ类分子的下降，会增加被nk细胞识别和杀伤的几率，但hcmv感染细胞可表达非经典的mhc-ⅰ类分子hla-g、hla-e、和mhc-ⅰ类分子同源物，与nk细胞的杀伤抑制性受体结合，抑制nk细胞对感染细胞的杀伤，逃避被机体免疫系统攻击。hcmv实验株与临床株相比缺少了ul/b′ul128-ul150，这簇基因虽然不是病毒的必须基因，但是对于人巨细胞病毒逃避免疫和感染上皮细胞、ec细胞有作用。人巨细胞病毒干扰mhc-ⅰ呈递抗原主要有两种途径：①干扰tap肽转运②固定插入内质网膜的hla重链。hcmvtb40/e-ul140蛋白bimas:hlapeptidebindingpredictions与mhc-ⅰ有非常高的亲和性。免疫细胞识别mhc-ⅰ呈递的抗原后，cd8+细胞毒性t细胞前体细胞与mhc-ⅰ呈递抗原结合活化为成熟ctl,有助于机体清除病毒感染的细胞，防止病毒的进一步传播。hegde等研究发现hcmvgpus3可在内质网中与mhc-ⅱ类分子的α和β链结合，抑制其由内质网向高尔基体转运，使其在细胞表面表达下降。hcmvgpus2可与hla-dr-α和hla-dm-α链结合并使其降解。hcmvgpus2和gpus3可以可溶性表达于细胞外，被未感染的apc细胞摄取，抑制未感染的apc细胞呈递抗原给cd4+t细胞。hla-g是一种非经典的mhc-ⅰ类分子，可分为hla1-6六种受体，hla-g的受体为白细胞免疫球蛋白受体1和2(lir1和lir2)，为抑制性受体。lir1表达于nk、t、b和粒细胞表面，lir2主要表达于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞表面。hla-g与lir结合，可抑制抗原提呈细胞的抗原提呈功能，可抑制hla-a2限制性的人巨细胞病毒诱导的ctl杀伤活性，可融性hla-g可抑制nk细胞对k562细胞株的杀伤活性，hcmv可通过诱导受感染细胞表达hla-g而逃避免疫应答。pet载体最初由studier及其同事构建。novagen开发的系列新的pet载体则使目的蛋白的克隆、检测以及纯化更加容易。pet32系列载体是设计用来克隆构建和高水平融合表达表达带有109个氨基酸trx标签的蛋白质序列。将基因插入到载体的多克隆位点，能够获得融合表达蛋白质。hcmv在与人类共进化的过程中，形成了多种分子机制逃避机体免疫系统的监视，从而在体内长期潜伏。gpus3是hcmv表达的一种即刻早期蛋白，可在内质网与hla-a，hla-b分子的α重链结合，阻碍mhc-ⅰ分子装配成熟及从内质网中转运至细胞膜表面(bullockgc,etal.2001)。hcmvgpus6在胞浆中可与tap结合，阻止抗原肽从胞浆转运至内质网，使mhc-ⅰ分子不能结合抗原肽，不能在细胞表面表达mhc-ⅰ分子和抗原肽复合体。hcmv可编码一种白细胞介素-10类似物cmvil-10，cmvil-10可降低ifn-γ的表达，导致mhc-ⅱ表达的分子降低。上述相关工作都为后续研究hcmv免疫逃逸提供了丰富的理论依据(julietv,etal.2002)。构建含有ul140重组质粒的基因工程菌的发明将有助于研究ul140基因在人巨细胞病毒免疫逃避中的分子机制。一旦该分子机制被解锁，ul140基因可能会用作人巨细胞病毒感染的治疗靶点，可以为人类社会做出巨大贡献。但目前尚未有构建成功的含有ul140重组质粒的基因工程菌。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种含有人巨细胞病毒ul140基因的重组质粒。本发明的另一目的在于提供含有上述人巨细胞病毒ul140基因重组质粒的基因工程菌。本发明的又一目的在于提供上述含有巨细胞病毒ul140基因重组质粒的基因工程菌的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种含有人巨细胞病毒ul140基因的重组质粒，含有ul140基因片段，其中，ul140基因片段的核苷酸序列如seqidno：1所示。所述的含有人巨细胞病毒ul140基因的重组质粒的构建方法，通过常规方法将ul140基因片段插入到pet32a载体中获得。一种含有人巨细胞病毒ul140基因重组质粒的基因工程菌，转化有上述含有人巨细胞病毒ul140基因的重组质粒。所述的含有人巨细胞病毒ul140基因重组质粒的基因工程菌的构建方法，为将上述含有人巨细胞病毒ul140基因的重组质粒转化入原核表达工程菌中，获得含有人巨细胞病毒ul140基因重组质粒的基因工程菌。所述的基因工程菌优选为大肠杆菌；更优选为大肠杆菌bl21(de3)。所述的含有人巨细胞病毒ul140基因重组质粒的基因工程菌在ul140重组蛋白制备中的应用。一种ul140重组蛋白的制备方法，将上述含有人巨细胞病毒ul140基因重组质粒的基因工程菌经过活化培养和发酵培养，再加入诱导剂iptg进行诱导表达，得到ul140重组蛋白；具体为：将上述工程菌接种至含有氨苄青霉素(amp)抗性的lb液体培养基中进行活化培养，然后转接到含有氨苄青霉素抗性lb液体培养基中进行发酵培养，再加入诱导剂iptg进行诱导表达，得到ul140重组蛋白。所述的氨苄青霉素的终浓度为100μg/ml。所述的诱导表达的条件优选为：20℃诱导8h。所述的iptg的工作浓度为1mm/l。所述的ul140重组蛋白的制备方法，还包括将获得的ul140重组蛋白进行纯化的步骤。所述的纯化为采用亲和层析进行纯化。所述的含有人巨细胞病毒ul140基因重组质粒的基因工程菌在制备人巨细胞病毒ul140蛋白多克隆抗体中的应用；该工程菌可以表达出带有组氨酸标签的融合蛋白，可应用亲和层析纯化制备多克隆抗体。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本发明提供了一种含有pet32a-ul140重组质粒的基因工程菌，通过将ul140基因插入表达型载体pet32a中获得重组载体pet32a-ul140，之后将其热击转进表达菌bl21中构建了能表达聚组氨酸标签hcmvul140融合蛋白的工程菌株，菌株可表达获得对应的hcmvul140融合蛋白，该融合蛋白可应用亲和层析纯化制备多克隆抗体，从而有利于探究趋化因子蛋白hcmvul140如何规避宿主免疫系统的逃避机制，降低hcmv潜伏感染宿主细胞的数量提高机体的免疫识别。2、在本发明构建的pet32a-ul140重组质粒中，基因的表达是受t7噬菌体rna聚合酶调控的。载体的典型特点是带有pbr322的大肠菌素e1复制区，从而赋予宿主菌氨苄青霉素抗性。编码序列在多克隆位点插入，在t7lac启动子的控制之下，聚组氨酸标签的目的蛋白大量诱导表达，便于后续亲和纯化目的蛋白利于制作多克隆抗体，分析免疫逃逸机制。鉴于pet32a载体融合蛋白表达纯化的特性，已大量应用在病原微生物等抗原的大量制备，为探究ul140是如何逃避宿主免疫系统提供了理论基础。附图说明图1为pet32a-ul140重组质粒构造示意图。图2为pcr扩增产物电泳示意图；其中，泳道m为dnamarker；泳道1为ul140pcr扩增产物。图3为重组融合蛋白ul140(未纯化)的sds-page结果示意图；其中，泳道m为蛋白质marker；箭头所示为重组融合蛋白ul140(大小为40kd)。图4为重组蛋白的westernblot结果图；其中，泳道m为预染蛋白质marker；箭头所示为重组融合蛋白ul140(大小为40kd)。图5为重组融合蛋白ul140纯化的sds-page结果示意图；其中，泳道m为蛋白质marker；箭头所示为重组融合蛋白ul140(大小为40kd)。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。一、质粒构建(1)ul140基因引物设计根据gennbank上公布的tb40/e(kf297339.1)病毒株基因组中ul140基因的序列全长576bp(核苷酸序列如seqidno：1所示，蛋白翻译产物如seqidno：2所示)，以该序列为模板，以pet32a载体(优宝生物有限公司)为克隆载体和表达载体，使用dnastar软件，选取合适的酶切位点进行引物设计。设计好的引物如下表：表1ul140引物设计表注：f(上游引物)；r(下游引物)。(2)ul140基因pcr根据已发表在genbank上的hcmvtb40/e-bac的基因序列(genbank：ef999921.1，引用文章(cloningandsequencingofahighlyproductice,endotheliotropicvirusstrainderivedfromhumancytomegalovirustb40/e))为模板，在以下反应体系中进行pcr：表2pcr反应体系表试剂名称体积(25μl)无菌ddh2o14.9μl5×pcrbuffer(withmg2+)5μldntp2μl模板1μl上游引物1μl下游引物1μlfastpfu酶0.1μlpcr扩增条件见下表：表3pcr反应条件设置表pcr产物经1％的琼脂糖凝胶分析，并通过胶回收试剂盒回收pcr产物。pcr产物回收步骤如下：①pcr产物经电泳后，在紫外条件下切取含目的条带的凝胶置于干净的1.5ml的ep管中；②在ep管中加入与凝胶等体积的xp2溶液；④将混有xp2溶液的凝胶块的1.5ml的ep管置于水浴锅中，57℃加热，每隔2～3min颠倒混匀，直至凝胶块完全融化即可；③待完全融化后的凝胶冷却，便可将其斡旋混匀并短暂离心，最后将其加入事先组装好的硅胶柱，室温，10000×g，离心1min，倾倒收集管中的废液；⑤再加入300μlxp2溶液到硅胶柱中，室温10000×g离心1min后，将收集管中的液体倒掉；⑥用700μlspw洗涤溶液洗涤硅胶柱，室温10000×g离心1min，将收集管中的液体倒掉；⑦重复6步骤一次；⑧空甩硅胶柱，室温12000×g离心2min，去除多余的spw洗涤溶液；⑨取出硅胶柱并将其放入到灭菌的1.5mlep管中，室温放置2min后，向硅胶柱中加入30μl事先已加热到65℃无菌ddh20，室温静置1min后，12000×g离心1min，取出已废弃的硅胶柱，ep管中手记的液体即为目的dna溶液；⑩检测回收的目的dna浓度及纯度，样品放于-20℃保存。实验结果：pcr扩增产物如图2所示，与预期大小结果一致，目的基因片段大小为576bp。(3)产物纯化试剂盒回收pcr产物①将pcr扩增后产物转移到一个干净的1.5mlep管，根据pcr扩增体系加入4～5倍的结合液cp，充分混匀；②将上一步所得溶液加入吸附柱ec中(吸附柱放入收集管中)，室温放置1min，10000×g，离心1min，倾倒收集管中的废液；③加入700μl漂洗液wb(先检查是否已加入无水乙醇)，10,000g离心1min，弃掉废液；④重复3步骤一次；⑤将吸附柱ec放回空收集管中，10000×g，离心1min，尽可能去除漂洗液，漂洗液中残留乙醇会抑制下游反应；⑥取出吸附柱ec，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加30～50μl洗脱缓冲液eb(洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2min，13000×g离心1min。如果需要较多量dna，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，离心1min。取出已废弃的硅胶柱，ep管中手记的液体即为目的dna溶液；⑦检测回收的目的dna浓度及纯度，以更好的用于后续实验。样品放于-20℃保存。(4)pet32a质粒抽提①取出过夜培养好的含有pet32a质粒的dh5α菌液，并将菌体加到1.5mlep管中，12000×g室温离心1min，弃上清，重复步骤，将5ml菌液全部收集到1.5mlep管中；②吸净多余的上清后，加250μlsolutioni到ep管中，用移液器轻轻吹打菌体沉淀，待菌体重悬后，放于涡旋振器上，使其完全混匀；③再加入250μlsolutionii，轻轻地上下颠倒混匀数次，颠倒时间要把握好，控制在2min～5min之间，颠倒完之后，液体一般会透明澄清；④最后加入350μlsolutioniii，轻轻地上下颠倒混匀数次，至有白色沉淀形成，颠倒混匀次数不能过多，紧接着放于小型离心机中，室温，13000×g离心10min；⑤离心结束后，将移液枪把上清液转移到已标记好的硅胶柱中，硅胶柱放进2ml的离心管里，勿将白色沉淀物吸入硅胶柱中，放于小型离心机中，室温10000×g，离心1min；⑥倒掉收集管中的废液，吸取500μlhb溶液，加入到硅胶柱中，室温10000×g离心1min；⑦倒掉收集管中的废液，加700μldnawashbuffer到硅胶柱中，(先检查dnawashbuffer是否已加入无水乙醇)室温10000×g离心1min；重复8步骤一次；⑧室温13000×g离心2min，去除多余的dnawashbuffer；⑨取出硅胶柱将其放入到灭菌的1.5mlep管中，向硅胶柱中加入30μl～50μl事先已加热到65℃无菌ddh20，室温静置1～2min后，12000×g离心1min，于-20℃保存。(5)载体和目的基因的酶切及回收①pet32a载体和ul140基因pcr产物双酶切体系如下表：表4pcr产物双酶切体系表将抽提好的质粒与回收的pcr产物于37℃恒温水浴14min进行双酶切。②pet32a双酶切后需要胶回收，同步骤(2)。③目的ul140基因双酶切回收，具体步骤如下：ⅰ、根据双酶切体系加入4～5倍的结合液cp，充分混匀；ⅱ、将上一步所得溶液加入吸附柱ec中，室温放置1min，10000×g，离心1min，倒掉收集管中的废液；ⅲ、加入700μl漂洗液wb(先检查是否已加入无水乙醇)，10000×g，离心1min，弃掉废液；ⅳ、重复3步骤一次；ⅴ、将吸附柱ec放回收集管中，10000×g，离心1min，尽可能除去漂洗液，以免残留乙醇抑制下游反应；ⅵ、取出吸附柱ec，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加30～50μl洗脱缓冲液eb(洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中加热效果更好)；室温放置2min，13000×g离心1min。如果需要较多量dna，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，离心1min。取出已废弃的硅胶柱，ep管中手记的液体即为目的dna溶液；ⅶ、检测回收的目的dna浓度及纯度，以更好的用于后续实验。样品放于-20℃保存。(6)ul140双酶切回收产物与pet32a质粒双酶切回收产物连接反应连接反应体系如下表：表5连接反应体系表连接反应条件为：置于16℃连接仪中连接16h以上；获得重组质粒pet32a-ul140。(7)大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞的制备①从-80℃冰箱取出大肠杆菌bl21(de3)，于无抗性的lb固体培养基上划线接种，37℃培养12h；②在划线过夜后的lb平板上，挑取单菌落，接种于4mllb液体培养基中37℃培养过夜；③将培养得到产物次日按1％(v/v)的比例，接种于500mllb液体培养基中，37℃培养；④当培养物od600达0.5～0.6时，将培养物置冰上10～15min，8000r/min离心10min收集菌体；⑤用预冷的tbbuffer轻轻地将沉淀悬浮，8000r/min离心30min，如此重复洗涤2次；⑥用18.6ml预冷tbbuffer和1.4mldmso的轻轻将沉淀悬浮，-80℃保存备用。(8)重组质粒转化进大肠杆菌bl21(de3)①取重组质粒pet32a-ul1401μl加入bl21(de3)感受态细胞中，冰上静置30min；②将混有质粒的bl21(de3)感受态细胞放入恒温水浴锅中42℃90s热击；③热击后立即冰浴3min；④冰浴后加入800μlsob液体培养基(sob培养基配方：2％(w/v)tryptone、0.5％(w/v)yeastextract、0.05％(w/v)氯化钠、2.5mm氯化钾、10mm氯化镁)，37℃培养1h，取出后将培养物8000r/min离心5min，弃去上清，只留下约100μl菌液，吹打混匀后将其涂于lb平板(含1％(v/v)100μg/mlamp)，放置37℃培养箱中倒置过夜培养12～24h即可看到单菌落。(9)重组质粒鉴定①无菌操作下，挑取单菌落，接种于10mllb液体培养基(含1％(v/v)100μg/mlamp)中，37℃培养8h后提取质粒，把1％琼脂糖核酸凝胶电泳鉴定为阳性的pet32a-ul140重组质粒作为模板，进行pcr鉴定。表6pcr反应体系表试剂名称体积(20μl)无菌ddh2o14.9μl5×pcrbuffer(withmg2+)5μldntp2μl模板1μl上游引物1μl下游引物1μlfastpfu酶0.1μlpcr扩增条件见下表：表7pcr反应条件设置表pcr扩增结束后，反应产物跑1％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪拍照，并分析、保存实验结果。②双酶切鉴定(ⅰ)抽提重组质粒pet32a-ul140同步骤(4)；(ⅱ)重组质粒pet32a-ul140双酶切鉴定同步骤(5)。(10)质粒样品测序将可以双酶切出目的基因大小片段的质粒样品送公司测序，测序结果出来后，将测序结果与gennbank下载的ul140基因序列使用blast软件进行比对，分析比对结果。测序结果与下载序列匹配，可以进行下一步实验。二、ul140重组蛋白的原核表达(1)ul140重组蛋白的诱导表达鉴定①重组载体pet32a-ul140诱导表达条件优化：pet32a-ul140表达最佳诱导条件是：20℃、1％(v/v)浓度为1mm的iptg、8h。②重组蛋白ul140的鉴定ⅰ.把鉴定好的pet32a-ul140重组bl21(de3)菌按1％(v/v)接种于4mllb液体培养基(含1％(v/v)100μg/mlamp)中，37℃静止培养过夜。次日按1％(v/v)将活化的菌液接种于4mllb液体培养基(含1％(v/v)100μg/mlamp)中，37℃当菌液od600约为0.5时加入1％(100mm)iptg，20℃培养6h。8000r/min离心1min收集菌体，加入4×上样缓冲液(含dtt)，用漩涡震荡器混匀，沸水浴中煮沸10min，l0000r/min离心30s，取15μl上清，以12％分离胶5ml，8％浓缩胶2ml进行配胶进行sds聚丙烯酞胺凝胶电泳(sds-page)。表812％分离胶配制表试剂名称体积(总5ml)无菌ddh2o1.6ml30％丙烯酰胺贮存胶2.0ml分离胶缓冲液1.3ml10％sds50μl10％ap48μltemed2μl混匀后将试剂灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面水平，凝胶完全聚合需要30～60min；配置5％浓缩胶见下表：表95％浓缩胶配制表试剂名称体积(总5ml)无菌ddh2o3.4ml30％丙烯酰胺贮存胶830μl浓缩胶缓冲液630μl10％sds50μl10％ap85μltemed5μl将分离胶上的水倒去，并用滤纸吸干多余水份，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15～30min；ⅱ.westernblot步骤如下：①首先将细胞蛋白经12％sds-page凝胶电泳进行分离并转移至pvdf膜上；②用5％的脱脂奶粉室温封闭1h；③封闭完的pvdf膜与anti-his鼠抗(1:1000)4℃共孵育过夜；④用含有1/2000吐温的tbst洗3次，每次20min；⑤洗后的膜与荧光二抗山羊抗鼠(1:5000)4℃共孵育2～3h；⑥再用含有1/2000吐温的tbst洗3次，每次20min；⑦最后通过li-corodysseyfc成像系统进行曝光进行免疫印迹分析。实验结果：未纯化的重组融合蛋白ul140的sds-page结果如图3所示。组蛋白的westernblot结果如图4所示。三、ul140重组蛋白的纯化(1)超声波破菌①加入1l(1/20细胞生长体积)的1×pbs缓冲液重悬菌体，4℃，6,500×g，离心10min尽可能弃尽上清；②加入的50ml1×pbs缓冲液重悬菌体，采用超声波破碎仪进行破菌，破菌参数设置为：150w，工作15s，停5s，破碎30min～1h。③破菌完成后，10000×g，4℃离心15min以上，收集上清液体1.5ml，用移液枪吸100μl沉淀，加到1.5mlep管内，跑sds-page蛋白胶分析样品；其结果如图5所示，箭头所示为重组融合蛋白ul140，为40kd。④剩下的沉淀加入30ml的平衡缓冲液，37℃震荡1h，冰上0.22μm滤膜过滤备用。(2)ul140重组蛋白亲和层析纯化①10倍柱体积的ddh2o(0.22μm)清洗ni层析柱；②10倍柱体积的平衡缓冲液(0.22μm)清洗ni层析柱；③平衡泵泵入重组蛋白溶液；④分别用5倍柱体积5mm咪唑、50mm咪唑、100mm咪唑、150mm咪唑、200mm咪唑、500mm咪唑洗脱。(3)ul140纯化重组蛋白的鉴定ul140重组蛋白的亲和层析纯化鉴定同步骤二(1)②。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>暨南大学<120>含有人巨细胞病毒ul140基因的重组质粒、基因工程菌及其应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>576<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ul140基因<400>1tcacagggtctgatgaagctgccaagagtcgtggctgtggcgcagcgcgttctgtacggc60gcgtttcaccgctttctgcatggccgctaccacgtcgggtgggagcggctccggcggaag120ctcgatgagcagttgctgcgagtctcggcgctcggtgtccgccgtttcgtcggacgtggc180gtaaaaaaccgaggtggttgcccagtcgtccacgctgtcgacggcctctgtcagtgccgg240gttgtcaaaaccgccatcggacgcgggtgataaaagaacgtacgatgacacgctgttagt300acgactctcgtcgtcgctctgggaacgacgtgatggacgacggtagatgacctcgtcttg360ccacgcgtcgaagcggtcgcagcagcgctggatccaagcgcagcgaagcagcttacggaa420cacgtcgttgttccaaaagtagagcataaagagaaagaaaagtagcgtaataatgaagcc480gaaaacgacgagggtcggcagggcactaccgccgctgccgttttttgtgtcgtgcgggtg540cacggtggtagtggcgttagtctgagctggggtcat576<210>2<211>191<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ul140蛋白<400>2metthrproalaglnthrasnalathrthrthrvalhisprohisasp151015thrlysasnglyserglyglyseralaleuprothrleuvalvalphe202530glypheileilethrleuleuphepheleuphemetleutyrphetrp354045asnasnaspvalphearglysleuleuargcysalatrpileglnarg505560cyscysaspargpheaspalatrpglnaspgluvaliletyrargarg65707580proserargargserglnseraspaspgluserargthrasnserval859095sersertyrvalleuleuserproalaseraspglyglypheaspasn100105110proalaleuthrglualavalaspservalaspasptrpalathrthr115120125servalphetyralathrseraspgluthralaaspthrgluargarg130135140aspserglnglnleuleuilegluleuproprogluproleupropro145150155160aspvalvalalaalametglnlysalavallysargalavalglnasn165170175alaleuarghisserhisaspsertrpglnleuhisglnthrleu180185190<210>3<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ul140引物-f<400>3cgggaattcatgaccccagctcagactaacg31<210>4<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ul140引物-r<400>4gcgcggaagcttctatcacagggtctgatgaagctgc37当前第1页12