一种利用miR-203/SNAI2轴调节前列腺癌细胞在体外迁移的方法与流程

本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及microrna检测和治疗前列腺癌(pca)的方法。本发明提供了mir-203/snai2轴可作为pca的诊断和治疗靶点。

背景技术：

前列腺癌(pca)是如今全球第二常见男性癌症死亡的主要原因之一。pca的形成和发展是多步骤的过程，包括正常前列腺上皮癌变前的病变转变，高档前列腺上皮内瘤(pin)，局部侵袭性前列腺癌和远距离转移。广泛的研究表明，对特定基因包括微小rnas(mirnas)和长非编码rna(lncrnas)的解除管制，是pca的发病机制和进展的主要原因。尽管如此，与其他癌症相比，pca中mirna的表达模式和功能仍未被完全阐明，尽管有证据表明，在pca的肿瘤发生和化疗抵抗中，mirna表达的全球解除管制。确定mirnas在前列腺肿瘤形成和进展中的作用机制，对我们更好地了解前列腺癌的性质有重要作用，并且有助于确定治疗干预的潜在靶点。

microrna是一类长度约20-24个核苷酸序列的短小非编码mrnas，通过转录绑定3’-未翻译区(3’-utrs)抑制目标基因的表达。mirnas参与调控包括致癌在内的多种生理和病理过程。对mirnas的解除管制有助于多种癌症的发展，包括pca。例如，下调pca中的肿瘤抑制物，包括mir-101、mir-126*、mir-145、mir-146a、mir-224、mir-330、mir-34a、mir-200家族，发现与先进的临床分期、肿瘤转移和异位表达相关的致癌mirnas包括mir-221/222、mir-21、mir-141、mir-18a和mir-125b，这表明pca进展有更高的风险。

snai2编码了snail家族c2h2锌指转录因子，并参与了不同癌症的发展。snai2作为一种转录抑制因子，通过与e-box的结合来调节与dna的序列特异性的相互作用。该蛋白参与上皮间充质转移并控制干细胞，这揭示了这一转录因子在肿瘤转移中具有重要意义。snai2在包括前列腺在内的人体组织中广泛表达。在体内异种移植实验表明，snai2促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭，并介导了细胞周期蛋白d1诱导的肿瘤发生。pca中snai2的沉默抑制了多能性基因的表达，激活了特异性的转移抑制因子。在选择的pca细胞中，snai2的异位表达促进了它们的自我更新，并增加了转移潜能，使其具有高度恶性的特性。snai2可能是防止pca进展的分子方法的关键目标。然而，在前列腺癌的形成和发展过程中，mirnas与snai2之间的相互作用并没有得到很好的阐明。

越来越多的证据表明，mir-203参与多种生理和病理过程，包括上皮分化、癌细胞增殖、转化和凋亡。有趣的是，不同的文献表明，mir-203参与gsk-3β/β-cateninn通路。例如，anniezhang等人报道，mir-203抑制了与pik3ca、p38mapk、c-jun和gsk-3信号信号相关的肝癌的增殖。在黑素瘤细胞，β-catenin压制转录mir-203。

在本研究中，我们旨在系统地阐明mir-203/snai2在前列腺癌中的确切作用。我们表明，mir-20/snai2轴调控肿瘤发生，血管生成，具备干细胞能力，在前列腺癌转移可能通过调节gsk-3β/β-catenin信号通路。这些发现为mir-203和snai2在恶性细胞中的作用提供了新的见解。

技术实现要素：

本发明确定了mir-203/snai2轴在体外调节前列腺细胞的迁移。为了描述mir-203/snai2轴在前列腺癌进展过程中的作用，我们用psin-mir-203转染入du145和pc3细胞。transwell试验的目的是探讨mir-203对前列腺癌细胞迁移的影响。如图1a-c所示，mir-203减少了du145和pc3细胞的迁移(p<0.05)。与只转染psin-mir-203(p<0.05)相比，psin-mir-203和psin-snai2共同转染后细胞迁移能力增加。伤口愈合试验也显示相似的结果(图1d-g)。

附图说明

图1mir-203/snai2轴调节前列腺癌细胞在体外的迁移。a、b和c。由boyden小室检测法在转染了psin-mir-203或共转染了mir-203和snai2的的情况下，分别测定du145和pc3细胞迁移潜力的表达(a)和定量(b和c)。测量尺为：100μm。d、e、f和g。在感染上的psin-mir-203或psin-mir-203和psin-mir-203的感染，在48h后，用创面愈合试验(d和e)和定量的伤口面积(f和g)的百分率来描述。测量尺为：250μm。所有数据均通过t检验进行统计分析。不同的字母表示差异具有统计学意义p<0.05。

具体实施方式

1.细胞培养

5个前列腺癌细胞株(du145、pc3、22rv1、lncap和c4-2)和2个永生化和未转化的前列腺上皮细胞系(pz-hpv-7和rwpe1)从美国atcc获得。细胞按照atcc的标准手册进行培养。人类脐静脉内皮细胞（huvecs）购买于lifetechnologies(carlsbad，california，usa)，根据说明书进行培养。

2.半定量rt-pcr和qrt-pcr

半定量rt-pcr和qrt-pcr均按之前描述进行。引物序列如下：5´-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctagtg-3´(specificrtprimerformir-203)，5´-gtgcagggtccgaggt-3´(realtimepcr，mir-203，forward)，5´-gccgcgtgaaatgtttagg-3´(realtimepcr，mir-203，reverse)；5´-ctcgcttcggcagcaca-3´(realtimepcr，u6，forward)，5´-aacgcttcacgaatttgcgt-3´(realtimepcr，u6，reverse)。

3.transwell侵染检测

细胞(5×10⁴)悬浮于200μ1含1%fbs的基本培养基中并接种于transwell上室中。下室为500μl含10%fbs的培养基。孵化24h后，迁移的细胞用4%多聚甲醛固定(beyotime)15min，用0.1%结晶紫染色15min，用显微镜(olympus)拍照。然后用200μ1的醋酸(33%，v/v)消除染色的结晶紫，并用elisareader(moeculardevices，sunnyvaleca，usa)在od570测量吸光值。

4.伤口愈合实验

处理的细胞(1×10⁶)在6孔板中培养过夜。覆盖率达到到达90%时使用200μl枪头刮动细胞层，然后立即用含1%胎牛血清的生长培养基洗两次。在0、12、24和48h用显微镜捕捉这些板块的照片。

技术特征：

技术总结
本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及microRNA检测和治疗前列腺癌(PCa)的方法。本发明提供了miR‑203/SNAI2轴对前列腺癌的体外生物学特性的影响。具体的，在DU145和PC3细胞中表达miR‑203抑制SNAI2表达。miR‑203抑制了前列腺癌细胞的增殖、迁移、内皮细胞形成和肿瘤干细胞的形成。

技术研发人员：张志潜
受保护的技术使用者：天津科美生物技术有限公司
技术研发日：2018.02.06
技术公布日：2019.08.13