一株鸡源H9N2禽流感病毒冷适应株筛选方法及其应用与流程

文档序号:14983700发布日期:2018-07-20 20:39阅读:665来源:国知局

本发明涉及动物病毒学领域,本发明提供了一株鸡源h9n2禽流感病毒冷适应株(sd165)的筛选方法及其生物学特性,以及其在生物学上特别是在spf鸡免疫上的应用。



背景技术:

禽流感病毒(aiv)隶属于正粘病毒科a型流感病毒属,基因组分为8个节段。核酸总长度约为13.6kb,编码至少11个病毒蛋白。由于aiv负链、分节段的rna病毒性质,病毒很容易发生变异并不断的突破其感染宿主的种属障碍,引起新的流感流行。aiv据其致病性可分为高致病性aiv(highlypathogenicavianinfluenzavirus,hpalv)和低致病性aiv(lowpathogenicavianinfluenzavirus,lpaiv),感染家禽的hpaiv和lpaiv分别以h5和h9亚型为主。

h9n2亚型流感属于低致病性流感病毒,但它的危害却不容忽视。h9n2aiv在世界范围内广泛存在,在北美,h9n2aiv主要存在于海鸟和野鸭体内(kawaokaetal.1988;sharpetal.1993)。1966年,h9n2aiv开始在美国火鸡群中广泛暴发流行(hommeetal.1970),1981至1996年美国连续爆发过16次h9n2aiv感染火鸡群事件(alexander2000)。

h9n2亚型是目前我国鸡群中存在的aiv的主要亚型,占禽流感总发病率90%以上。h9n2亚型禽流感发病后虽然致死率不高(一般不超过30%),但常导致呼吸道症状,蛋鸡的产蛋下降,并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病,影响家禽生产性能;肉鸡感染后造成免疫抑制,容易造成继发感染和混合感染,从而给肉鸡养殖业造成巨大经济损失。众所周知,禽流感病毒变异非常快,因此及时的发现新的毒株研究其特性,并最终筛选出可以作为疫苗株的毒株是保证禽流感疫苗效果的最重要方式之一。

目前国内用来预防h9n2禽流感爆发的疫苗主要是灭活疫苗,由于灭活疫苗主要提供体液免疫,能够刺激机体产生抗体,但不能提供粘膜免疫保护,鸡群免疫后不能获得有效的细胞免疫,因此许多鸡场,免疫了h9疫苗,还是有零星发病。禽流感作为呼吸道疫病,病毒的入侵门户为上呼吸道;即使机体具有一定水平的血清抗体,如果上呼吸道没有粘膜抗体,鸡只照样能够感染病毒和发病,这是临床上高抗体水平鸡发病的主要原因之一。如果能够研发一种h9n2禽流感活疫苗,免疫后将会诱导机体产生粘膜免疫,大大改善目前养殖企业对h9n2禽流感的防控效果。



技术实现要素:

本发明的发明人提供了一株通过在10日龄的spf鸡胚上连续低温传代,获得的a/chicken/shandong/165/2013(h9n2)(简称sd165)禽流感病毒冷适应株,并提供了该毒株的全基因组序列,阐明流感病毒主要抗原保护蛋白ha基因片段与国内近几年流行的h9n2流行毒株在一个进化分支之内。从而为筛选h9n2病毒活疫苗备用毒株的供分子流行病学基础;同时提供了该冷适应毒株作为流感活疫苗株的试验数据和指标,以明确其作为h9n2流感活疫苗备用毒株的可行性。

发明人对该毒株进行了生物保藏,保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;其保藏编号为:cgmccno:14887,保藏日期为2017年11月21日,分类命名为n9h2亚型低致病性禽流感病毒冷适应株。

该病毒的全基因组序列测定表明,其ha基因隶属于h9-4.2.5.3like谱系,与近几年国内h9n2流行株同属于一个进化分支,可以用来作为h9n2禽流感活疫苗株的候选毒株。

本发明的一方面,提供了h9n2冷适应株(sd165)的获得方法,发明人采用的h9n2冷适应株(sd165)的获得方法如下:

低温条件下,在spf鸡胚上通过有限稀释法连续传代:

a/chicken/shandong/165/2013(h9n2)(简称sd165)是在9-10日龄spf鸡胚上连续传三代纯化病毒。

把sd165稀释1000-100000倍,在9-10日龄spf鸡胚上连续传代,把第一代接种sd165的20枚spf鸡胚放到30-37℃温箱培养,60-80h后无菌收集尿囊液,选择有血凝性且血凝效价高于24的鸡胚尿囊液继续接种10日龄spf鸡胚,培养箱温度降低为30-37℃。按照上面的程序,直到培养箱温度降低为20-30℃,收集血凝性最高的鸡胚尿囊液,在20-30℃连续传代8-12代,最后鸡胚血凝效价维持在29

优选的,把sd165稀释10000倍,在10日龄spf鸡胚上连续传代,把第一代接种sd165的20枚spf鸡胚放到35℃温箱培养,72h后无菌收集尿囊液,选择有血凝性且血凝效价高于24的鸡胚尿囊液继续接种10日龄spf鸡胚,培养箱温度降低为34.5℃。按照上面的程序,直到培养箱温度降低为25℃,收集血凝性最高的鸡胚尿囊液,在25℃连续传代10代,最后鸡胚血凝效价维持在29

把鉴定好的病毒在,无菌收集尿囊液并且分装在冻存管中在负70℃冰箱保存备用。

本发明的另一方面,公开了鸡源h9n2禽流感病毒冷适应株在制备用作防控h9n2亚型禽流感爆发的活疫苗株方面的应用。

本发明的有益效果在于:筛选h9n2病毒活疫苗备用毒株的供分子流行病学基础;同时提供了该冷适应毒株作为流感活疫苗株的试验数据和指标,以明确其作为h9n2流感活疫苗备用毒株的可行性。

附图说明

图1:ha基因的系统进化树

图2sd165和sd165野生型病毒免疫后鸡群不同表现

具体实施例

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。

实施例1:h9n2冷适应株(sd165)的获得方法

a/chicken/shandong/165/2013(h9n2)(简称sd165)是在9-10日龄spf鸡胚上连续传三代纯化病毒。

把sd165稀释10000倍,在10日龄spf鸡胚上连续传代,把第一代接种sd165的20枚spf鸡胚放到35℃温箱培养,72h后无菌收集尿囊液,选择有血凝性且血凝效价高于24的鸡胚尿囊液继续接种10日龄spf鸡胚,培养箱温度降低为34.5℃。按照上面的程序,直到培养箱温度降低为25℃,收集血凝性最高的鸡胚尿囊液,在25℃连续传代10代,最后鸡胚血凝效价维持在29

实施例2:测定h9亚型aiv的性质及免疫效果

1.遗传演化分析:该病毒的全基因序列如说明书中所示,发明人参考已发表的h9亚型aiv序列资料,设计并合成了aiv基因组8个基因片段(pb2、pb1、pa、ha、na、np、m、ns)的rt-pcr引物。分别扩增h9亚型aiv各基因片段。该病毒的全基因组序列测定表明,其ha基因隶属于h9-4.2.5.2like谱系,与近几年国内h9n2流行株同属于一个进化分支,可以用来作为h9n2疫苗株的候选毒株之一,其具体的基因进化树见附图1,发明人分析是采用的分析软件是dnastar7.0。

2.病毒在鸡胚中的生长特性25℃,该病毒在鸡胚中可高滴度生长,血凝效价稳定在29左右,sd165野生病毒不复制;在30℃,sd165血凝价可以达到28,sd165野生病毒血凝价可以达到24;37℃,冷适应株sd165不能复制,鸡胚尿囊液没有血凝性,sd165野生病毒可以很好复制,血凝效价稳定在29左右(表)1。

表1sd165和sd165野生病毒在不同温度条件下在spf鸡胚上的复制能力(lg2)

eid50测定:种毒按10倍倍比稀释,将各稀释度分别接种4枚spf鸡胚,25℃继续孵化48h,通过测定感染鸡胚尿囊液的血凝活性来判断其是否感染,利用reed-muench法计算eid50(reed,etal,1938)。该病毒对鸡胚的半数感染量(eid50)为10-8.25/ml,结果表明该病毒在鸡胚上很容易增值,这是可以制作疫苗的条件之一。

3.sd165安全性检测:用含有106eid50的sd165和sd165野生病毒点眼滴鼻方式,分别免疫10只7日龄spf鸡,连续观察10d。sd165免疫组,没有任何异常症状,sd165野生病毒免疫组,3d后有轻微呼吸道,没有死亡(表2)。免疫后3d,5d分别剖检每个组的3只,发现sd165野生病毒免疫组肺、气管、扁桃体和胸腺出现轻微出血(图2),sd165免疫组和对照组没有任何异常病变。这说明,sd165免疫鸡是安全的。

表2sd165和sd165野生病毒免疫后鸡群不同表现

4.spf鸡体内产生较高抗体:用含有103.5eid50/50ul的sd165,通过点眼滴鼻方式,免疫7dspf鸡,2周采集血清,检测血清h9抗体滴度,抗体在2周达到较高滴度,sd165在免疫后第二周抗体就就达到了9(lg2)(表3)。所以sd165冷适应病毒株制作油苗在spf鸡上很容易引起免疫应答。

表3疫苗株免疫spf鸡14天后采集血清检测抗体结果

5.该病毒制成疫苗后在spf鸡上免疫保护效果分析:

sd165,先免疫7dspf鸡,通过点眼滴鼻方式,免疫7dspf鸡10只,对照组10只同样方式和剂量免疫pbs,2周后用同源和异源h9亚型野毒株进行攻毒,攻毒后第3天和第5天采集试验组和对照组鸡的鼻咽拭子和腔拭子,使用9-10日龄spf鸡胚进行病毒滴定,结果表明,该疫苗株无论对同源还是异源野毒攻击,都能产生较好的免疫保护效果,同源野毒保护效果达到80-90%,异源保护效果达到70-90%(表4)。

表4sd165对spf鸡的免疫保护结果

注:ck/sd/wf1/2015是2015年从山东潍坊发病的商品肉鸡分离的一株h9n2禽流感病毒。其具体的基因组序列如说明书中所示,说明书中序列表按照pb2,pb1,pa,ha,np,na,m,ns的顺序顺次排列为1-8。

综上所述,通过该毒株生物学性质的测定可可以看出:25℃条件下,sd165,在10日龄鸡胚中高滴度增殖,而且其血凝素蛋白(ha)抗原性好;该冷适应株对spf鸡安全性好;sd165在spf鸡体内产生较高抗体,免疫后,能够有效抵抗同源和异源h9禽流感野毒的攻击。因此sd165可以作为h9n2流感活疫苗侯选毒株。

实施例3:保藏信息

保藏时间:2017年12月21日

保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc

保藏编号:cgmccno:14887。

保藏单位地址:中国科学院微生物研究所

分类命名:h9n2流感病毒ck/sd/165/2013

a/chicken/shandong/165/2013

以上所述,仅为本发明专利较佳的实施例,但本发明专利的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明专利所公开的范围内,根据本发明专利的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都属于本发明专利的保护范围。

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