本发明涉及生物医学领域中艾滋病的生物细胞治疗。
背景技术：
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)引起的传染病，在全球广泛流行，根据世界卫生组织(who)和联合国艾滋病规划署的有关报告，自1981年美国发现首例艾滋病病例以来，至今全球有208个国家和地区受到了艾滋病的严重威胁，约有4000万人感染了艾滋病，死亡人数已超过2000万，每天约有6000人成为艾滋病感染者，同时每天约有300多人死于艾滋病。在中国hiv感染者正处于高速增长期，目前已远超过100万。艾滋病已经成为继肿瘤、心脑血管疾病、结核病、糖尿病后又一个人类面临的重大感染性疾病，已成为全球关注的严重的公共卫生和社会问题。
从目前已用于临床的艾滋病治疗方法看，效果不那么理想：(1)hiv逆转录酶抑制剂：仅能防止尚未感染hiv的易感细胞感染，对已感染的细胞没有治疗作用，且毒副作用较多，包括腺粒体毒性、骨髓抑制、红细胞性贫血、粒细胞和血小板减少、胰腺炎，加之交叉耐药性的产生，这类药已不单独使用，主要做联合用药，且易产生耐药变株，导致临床疗效下降或失效。(2)hiv蛋白酶抑制剂：易产生药物性肝损伤、脂质代谢紊乱等毒副作用及耐药性。(3)hiv整合酶抑制剂：通过抑制hiv病毒dna与宿主细胞dna整合而发挥作用，与hiv逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联合同时使用对抗病毒有协同作用。(4)抑制hiv病毒进入抑制剂：包括阻断gp120与cd4结合、阻断hiv与辅助受体结合、作用于gp41膜亚单位及作用于t淋巴细胞表面cc趋化因子受体5(ccr5)来阻断hiv进入宿主细胞，但对肝和心脏有副作用。(5)细胞因子治疗：主要用于调节t细胞动态平衡。(6)hiv疫苗治疗：由于hiv的特殊性，如固有免疫不足以抵御hiv及其靶向破坏免疫系统，病毒突变迅速，导致至今尚未开发出真正安全有效的疫苗。(7)基因治疗：hiv基因治疗的研究从未间断，包括反义技术、rna诱饵、rna干扰、细胞内抗体、显性阴性突变体、自杀基因等，但进入ii期临床试验阶段的基因疗法几乎没有。(8)单克隆抗体被动免疫疗法：通过下调cd4+t细胞表面ccr5来降低hiv的易感性、延缓艾滋病的进展和减少hiv的扩散，中和单克隆抗体2g12、2f5和4e10应用于hiv感染者具有良好的耐受性和安全性，能延缓但不能阻止病毒的反弹(9)过继性免疫细胞治疗：体外大量培养hiv自体的cd4+t细胞时会导致病毒大量扩增，增加病毒感染的cd4+t细胞数量，而回输cd4+t细胞可能会增加体内病毒复制的场所，导致病毒载量反弹，总体上看，过继性免疫细胞治疗无明显的毒副作用，也未取得满意的治疗效果。
hiv进入人体后，首先被巨噬细胞吞噬，但hiv很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境，创造了适合其生存的条件，不但不被杀灭反而在其内繁殖。因为cd4是hiv的受体，所以经巨噬细胞内繁殖的hiv通过其囊膜蛋白gp120并在gp41的辅助下(gp41起着桥的作用，利用自身的疏水作用介导病毒囊膜与细胞膜融合)进入cd4+细胞(细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等)，在细胞内迅速增殖，每天产生109～1010病毒颗粒，并不断进入其他正常的和再生的cd4+细胞内复制，制造更多的病毒感染细胞，使外周血cd4+t细胞持续破坏、减少。hiv的gp120与cd4受体结合可直接激活受感染的细胞凋亡，甚至感染hiv的t细胞表达的囊膜抗原也可启动正常t细胞，通过细胞表面cd4分子交联间接地引起cd4+细胞的大量破坏，结果造成以cd4+t细胞缺损为中心的严重免疫缺陷，患者主要表现：外周淋巴细胞减少，t4/t8比例配置，对植物血凝素和某些抗原的反应消失，迟发型变态反应下降，nk细胞、巨噬细胞活性减弱，il2、γ干扰素等细胞因子合成减少。cd4+t细胞是最重要的免疫细胞，感染者一旦失去了大量cd4+t细胞，整个免疫系统就会遭到致命的打击，对各种疾病的感染都失去抵抗力。
cd4+t细胞是t淋巴细胞的一种，平均寿命一般为7天左右，难以在体外长期传代扩增，作为cd4+t细胞缺乏的艾滋病的治疗。
技术实现要素：
为了构建一种能在体外长期传代培养、能产生细胞因子、能用于艾滋病治疗的hiv易感细胞株，本发明人提出了本发明。
本发明的目的是要提供一种hiv易感细胞株的构建方法。
本发明的目的是这样实现的：以免疫磁珠法分选cd4+t细胞和巨噬细胞，以sv40lt基因转染构建巨噬细胞株，继之将cd4+t细胞和巨噬细胞株同置于含cd4抗体、ifn-γ、刀豆蛋白a的预融合剂中，在ifn-γ和刀豆蛋白a的活化下，每1个cd4抗体中的iggfab段与均具有cd4表位的cd4+t细胞或巨噬细胞株结合，而cd4抗体中iggfc段与具有iggfc受体的巨噬细胞株结合，借助cd4抗体连接cd4+t细胞和巨噬细胞株，进而在聚乙二醇的作用下使两种细胞融合，经细胞融合培养基(hat)选择培养，获得能在体外长期培养、能产生细胞因子、能更易感于hiv的杂交瘤hiv易感细胞株。
本发明的待融合细胞经含有cd4抗体、ifn-γ、刀豆蛋白a的预融合剂的处理，待融合细胞被活化，依赖于cd4抗体的作用，其fab端同时或分别与表面均含有cd4分子的cd4+t细胞或巨噬细胞结合，且cd4抗体fc端又与具有fc受体的巨噬细胞结合，每1个cd4抗体的两个fab和1个fc分别结合cd4+t细胞和巨噬细胞，从而将两种细胞连接聚集以促使细胞融合。其中刀豆蛋白a与巨噬细胞膜上受体结合而易于膜的融合、ifn-γ的作用是活化巨噬细胞的iggfc受体，使其更易于结合iggfc，从而使cd4抗体、cd4+t细胞和巨噬细胞株形成结合物、拉近被融合细胞的距离、易于胞膜接触和融合，更易于在融合剂的作用下使两种细胞融合，经细胞融合培养基(hat)选择培养，获得能在体外无限扩增、更易感于hiv、使hiv从被巨噬细胞的吞噬到传递给cd4+t细胞的过程均在hiv易感细胞内完成，所以更适用于艾滋病体外免疫吸附治疗。
具体实施方式
图1是本发明的igg助融示意图。
图2是本发明的细胞融合实拍图。
图3是cd4+t细胞(株)与巨噬细胞株融合的示意图。
在图1中，1表示具有单克隆cd4抗体iggfab受体的cd4+t细胞(单克隆cd4抗体iggfab也可以接巨噬细胞)，2表示单克隆cd4抗体(igg)，3表示具有单克隆cd4抗体iggfc受体的巨噬细胞(巨噬细胞同时具有fab和fc受体)，通过单克隆cd4抗体将待融合的cd4+t细胞和巨噬细胞连接在一起，有利于在peg的作用下融合。
在图2中，融合细胞经hat筛选2周，倒置显微镜下拍摄(40x)，得到杂交瘤细胞克隆。
下面结合图1和图2，对本发明的实施方案作具体的描述。
1、cd4+t细胞和单核巨噬细胞的分离
参照有关文献，以密度梯度离心法从新鲜血液(新生儿脐带血或献血员血液)中分离单个核细胞，然后以免疫磁珠法分离cd4+t细胞和巨噬细胞。
2、巨噬细胞系(株)的准备
参照有关文献，构建sv40ltag-pcdna3.1(-)重组克隆并以脂质体转染法转染巨噬细胞，以g418筛选阳性克隆进行传代培养，鉴定巨噬细胞株的生物学特性；或购买单核-巨噬细胞株(系)，诱导为巨噬细胞系，进而扩增培养，观察代数，观察其吞噬病毒、细菌(真菌)、(鸡)红细胞或hiv的功能及其产生细胞因子的功能。
3、hiv易感细胞株的构建
(1)所用试剂和方法：①培养基及主要试剂：dmem培养基、hat选择培养基购自sigma公司，优级胎牛血清(fbs)购白天津市灏洋生物制品科技责任有限公司；dmso(--甲基亚砜)为国产分析纯试剂；②预融合剂：在dmem培养基中配入3.0％刀豆蛋白a、5.0μg/lifn-γ、与cd4+t细胞等效价的cd4抗体。其中刀豆蛋白a、ifn-γ的作用是活化巨噬细胞的iggfc受体，使其更易于结合iggfc，从而使cd4抗体、cd4+t细胞和巨噬细胞株形成结合物、拉近被融合细胞的距离、易于胞膜接触和融合。刀豆蛋白a还有活化cd4+t细胞、促其增殖的作用。刀豆蛋白a、ifn-γ、cd4抗体可商品购得，cd4抗体(单克隆抗体)可免疫动物制备或市售购得。
(2)待融合的cd4+t细胞和巨噬细胞系的准备：将分选的cd4+t细胞和巨噬细胞系分别以dmem培养液(基础培养基)调整总细胞数为1×108～2×108，用于细胞融合，并以台盼兰染色、相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。
(3)融合前处理：按cd4+t细胞∶巨噬细胞系＝1∶1的比例，先将cd4+t细胞悬液加入离心管中，1000r/m离心5min，弃去上清，加入2ml预融合剂，混匀，37℃1小时，转入加有巨噬细胞系悬液并经离心、去上清的离必管中，混匀，37℃1小时，1000r/m离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀(此时cd4抗体iggfab段先与cd4+t细胞的cd4受体结合，之后未结合的iggfab段和iggfc段再与巨噬细胞的cd4受体、fc受体结合，形成结合物)。
(4)细胞融合：在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后无菌条件下将预热的1000μl的35％peg3000在60s内沿管壁滴加到融合管中，同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25ml基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，转置56℃水浴放散抗体5分钟(除去结合的抗体)，立即以1500r/m离心5min，弃去上清，加入50mlhat培养基，适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
(5)hiv易感细胞株的筛选：观察96孔板细胞生长情况，7-10天后仅有细胞融合的hiv易感细胞株能够生长分裂，此时弃去hat培养基，更换完全培养基。细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清，选择生长状态良好的hiv易感细胞株的培养孔，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，37℃，5％co2培养箱内培养约1周，显微镜下观察细胞生长情况，待细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，取细胞或培养上清检测hiv易感细胞株的特性，并进行hiv易感细胞株的冻存。
(6)hiv易感细胞株的生物学特性
(a)hiv易感细胞株能在体外长期传代培养
将hiv易感细胞株作扩增培养，培养3个月，传代15代，细胞仍呈贴壁生长，随机取5个细胞培养瓶，分别消化贴壁细胞，以台盼兰染色，用相差显微镜检查，计数100个细胞，活细胞数分别为93％、88％、91％、92％、89％；而未融合的正常cd4+t细胞的寿命通常为1周，巨噬细胞的寿命为2-3周，最长不超过75天。
(b)hiv易感细胞株易于清除胞外的hiv，使胞外hiv显著地减少
为了比较hiv易感细胞株、单核巨噬细胞系、cd4+t细胞(cd3单抗刺激扩增)各自清除hiv的功效，本发明设计了简易的测试方法：分别取5支(共20支)灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管，吸取细胞浓度均为90％的cd4+t细胞(i)、单核巨噬细胞系(ii)、cd4+t细胞和单核巨噬细胞系等量混合细胞株(iii)、hiv易感细胞株(iv)至200mm刻度。另取5例艾滋病患者的血浆，各约13～15ml，检测其hiv-1p24的含量，称为滤前血浆hiv-1p24的含量。然后将每例患者的血浆各自平分放入分别装有cd4+t细胞(i)、巨噬细胞系(ii)、cd4+t细胞和巨噬细胞系等量混合细胞株(iii)、hiv易感细胞株(iv)的血沉管。5-10分钟后血浆从血沉管下端缓慢渗出，分别收集流出液，并检测其hiv-1p24的含量。
检测方法根据hiv-1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(od)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性。
检测结果(表1)发现，5例aids血浆各自滤过装有cd4+t细胞(i)、巨噬细胞系(ii)、cd4+t细胞和巨噬细胞系等量混合细胞株(iii)、hiv易感细胞株(iv)的血沉管后，其中的hiv被不同程度的清除。例如：编号为1的aids血浆，滤前血浆中hivp24抗原的含量为316.5pg/ml，当滤过装有cd4+t细胞(i)柱时，其滤液的hivp24抗原含量检测值为278.5pg/ml，被清除了38pg/ml(316.5-278.5＝38)，其清除率为12.01％(38/316.5＝12.01％)；当滤过hiv易感细胞株(iv)柱时，其滤液的hivp24抗原含量检测值为199.7pg/ml，被清除了116.8pg/ml(316.5-199.7＝116.8)，其清除率为36.9％(116.8/316.5＝36.9％)，依次计算，滤过cd4+t细胞(i)后的平均清除率为16.74％、滤过巨噬细胞系(ii)后的平均清除率为17.92％、滤过cd4+t细胞和巨噬细胞系等量混合细胞株(iii)后的平均清除率为19.23％、滤过hiv易感细胞株(iv)后的平均清除率为36.33％。
表1aids血浆分别滤过cd4+t细胞、巨噬细胞系、易感细胞株后的p24检测结果(pg/ml)
上述实验表明，虽然cd4+t细胞(i)、单核巨噬细胞系(ii)、cd4+t细胞和巨噬细胞系等量混合细胞株(iii)、hiv易感细胞株(iv)对hiv均有吞噬或吸附作用，但hiv易感细胞株对于hiv的吞噬、吸附作用具有特殊的效果(p＜0.01)
(c)hiv易感细胞株能在长期培养中分泌cd4+t细胞因子
取5例艾滋病(aids)患者的血浆，各1.0ml，与0.5ml浓度为1010/ml的hiv易感细胞株混合，加5.0ml细胞培养液；另取1.0ml正常血浆，与5.5ml细胞培养液混合(空白对照)，均在37℃连续培养4周，然后从第2周开始，每周分别取更换的细胞培养液，进行cd4+t细胞因子检测，从检测结果(表2)可知，在第2、3、4周的培养液中，ifn-γ、il-2、il-4的平均检测值(μg/l)分别为2.7、2.8、2.9、2.7、2.8、2.8、2.7、2.7、2.8，相应各组均为p＞0.05，而空白对照未检出相应的细胞因子，未转化的正常cd4+t细胞在1周内死亡，于第2周时已死亡的cd4+t细胞无法产生细胞因子，只有hiv易感细胞株能在体外长期培养，并在培养过程中产生细胞因子，而这些细胞因子具有重要的生理功能，所以，本申请能为cd4+t细胞因子的体外制备、以用于相关疾病的治疗奠定基础。
表2hiv易感细胞株体外长期培养过程产生的细胞因子检测结果(μg/l)
(7)hiv易感细胞株的应用
(a)用于制备细胞因子：使寿命约为1周的cd4+t细胞转化为能在体外长期培养、并在培养过程中产生ifn-γ、il-2、il-4等cd4+t细胞因子，所以，本申请能为cd4+t细胞因子的体外制备、以用于相关疾病的治疗奠定基础，特别是以破坏cd4+t细胞为病理特征的艾滋病患者，可取含hiv的患者自身血浆与hiv易感细胞株在体外长期培养、不断提取培养液中的细胞因子，用于艾滋病的治疗。
(b)用于基于体外循环hiv截留的艾滋病免疫吸附治疗：hiv易感细胞株经体外传代扩增后，收获细胞，制备hiv易感细胞吸附柱，在建立的体外循环装置中，艾滋病患者的静脉血液被引出体外，并分离为血浆和血细胞，血浆经过hiv易感细胞吸附柱时，其中的hiv被吸附柱中的hiv易感细胞吸附，清除hiv后的血浆与血细胞汇合后回输体内，如此可降低艾滋病患者体内的hiv病毒载量，且无药物的副作用。