本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种鹿源牛病毒性腹泻灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus，bvdv)是黄病毒科瘟病毒属的成员之一，与同属内的猪瘟病毒及羊边界病毒在血清学上存在着交叉反应。bvdv可引起牛、羊、猪和鹿等动物感染发病，临床表现为发热、黏膜溃疡、持续性感染，腹泻和生殖障碍等。鹿感染bvdv可造成母鹿流产，产死胎、弱胎、畸形胎，产下病毒血症仔鹿，使鹿发生顽固性腹泻和黏膜病，导致采食和营养吸收受阻，以至继发感染，严重影响幼鹿的发育和成鹿的生产性能，甚至使鹿大批死亡，给养鹿业造成严重的经济损失。在我国，杜锐等对吉林省的松原、长春、伊通、双阳4个地区的228份样品进行了检测，表明幼鹿感染粘膜病病毒的感染率为60～86.7％。目前，防制bvdv的有效手段还是疫苗接种，但国内还没有一种标准化的商业疫苗用于鹿的病毒性腹泻/粘膜病的防控。
病毒性腹泻/黏膜病在梅花鹿群中呈蔓延扩散的趋势，但针对梅花鹿病毒性腹泻/黏膜病专用疫苗在我国仍尚属空白，很多情况下使用牛源的疫苗进行替代，使用牛源的疫苗进行梅花鹿黏膜病的免疫效果也不尽如人意。同时，已经有报道证明，怀孕期的母畜进行bvdv弱毒疫苗的免疫可能会导致流产或者死胎。综上所述，应该创制一种具有自主知识产权的梅花鹿专用灭活疫苗，使梅花鹿病毒性腹泻/黏膜病免疫预防工作更加科学化。
技术实现要素：
为了填补梅花鹿病毒性腹泻/黏膜病专用疫苗的空白，本发明提供一种鹿源牛病毒性腹泻灭活疫苗及其制备方法。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株，该菌株已于2018年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.15283。
利用上述所得鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株制备的鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株灭活疫苗。
本发明还提供了上述鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株抗原液；
步骤二、将鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株抗原液加入bei进行灭活，bei终浓度为3～4mm，灭活时间为18～24h；
步骤三、将灭活后的鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株抗原液加入10％(w/v)硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％(w/v)；再将其与206佐剂按体积比1:1～1.2:1进行混合乳化反应10～20min，疫苗乳化转数为120～200r/min，获得鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株灭活疫苗。
作为优选的实施方式，在步骤一之前还包括以下步骤：鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株的传代与噬斑克隆纯化：将分离的鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株经mdbk细胞进行体外连续传代，至30代，其间每隔5代进行噬斑克隆纯化病毒，即f5、f10、f15、f20、f25代进行噬斑克隆纯化病毒。
作为优选的实施方式，鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株的传代与噬斑克隆纯化的具体过程如下：
取鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株病毒进行10倍系列稀释，稀释度范围为10-2～10-6，病毒稀释后接种长满80％单层的mdbk细胞的6孔细胞培养板，1ml/孔，吸附1h后弃病毒液，用无血清的dmem清洗3次，加入2×dmem与灭菌琼脂液的混合液，3ml/孔，室温冷却后置于37℃、5％co2培养箱中培养3～4d，观察噬斑，挑取单个噬斑保存并进行传代。
作为优选的实施方式，步骤一中，利用转瓶贴壁培养细胞制备鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株抗原液：
在转瓶中培养mdbk细胞，细胞长满90～100％单层时，以胰酶-edta细胞分散液消化传代，以1:3～1:5的比例分散至新的转瓶中，细胞生长液为含5～8％新生牛血清的dmem；当细胞生长至80～90％单层时，以感染剂量moi为0.01～0.05将鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株接种到mdbk细胞中，细胞维持液为含3％马血清的dmem，继续培养60～84h，当细胞病变达到80～90％时收获病毒液，-20℃保存备用。
作为优选的实施方式，步骤一中，利用微载体悬浮培养技术制备鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株抗原液：
在转瓶中培养mdbk细胞，细胞长满90～100％单层时，以胰酶-edta细胞分散液消化，接种入细胞培养反应器，细胞接种密度为1×106～3×106个/ml，微载体的加入量为3～5g/l，细胞生长液为含5～8％新生牛血清的dmem，搅拌速度为40～100r/min，温度为36℃，ph为7.2～7.4；当微载体上70～80％汇满细胞后，弃生长液，加入含2～3％马血清的dmem，按moi0.01～0.05接种病毒，接毒48～72h后，细胞病变达到80～90％时，收获病毒液，-20℃保存备用。
本发明的有益效果是：
本发明应用mdbk细胞从疑似发病梅花鹿的脾脏分离到一株病毒，经中和试验、间接免疫荧光试验和rt-pcr试验证明分离的病毒为bvdv，经全基因序列测定证明该毒株为bvdv1型病毒，命名为鹿源bvdvjl05株。在此基础上使用mdbk细胞对鹿源bvdvjl05株病毒进行传代并进行噬斑克隆纯化病毒。经检测鹿源bvdvjl05株病毒含量达107.2tcid50/ml以上，且无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染，符合制苗用病毒要求。将病毒经bei灭活后与206佐剂混合乳化，制备3批疫苗，经安全性和效力检验证明，该疫苗对梅花鹿安全，攻毒保护率可达100％，为梅花鹿病毒性腹泻/粘膜病的防控奠定了基础。
附图说明
图1为鹿源bvdvjl05株荧光鉴定结果。
图2为鹿源bvdvjl05株rt-pcr鉴定结果。
图3为鹿源bvdvjl05株全基因系统进化树。
图4鹿源bvdvjl05株灭活动力学曲线。
具体实施方式
实施例1鹿源牛病毒性腹泻病毒jl05株的分离、获得
本发明所用毒株鹿源牛病毒性腹泻病毒(bvdv)jl05株分离自疑似发病梅花鹿的脾脏。该分离毒接种mdbk细胞可产生明显的细胞病变，使用bvdv阳性抗体进行中和试验和间接免疫荧光试验进行检测；根据genbank发表的bvdv全基因序列，设计合成特异性引物如下：
bu：5′-tcgacgctttggaggaca-3′；
bd：5′-ccatgtgccatgtacag-3′。
目的片段大小为186bp，用于bvdv的rt-pcr检测。结果表明，该分离毒为bvdv，荧光鉴定结果如图1所示，pcr鉴定结果如图2所示。
根据genbank发表的bvdv全基因序列，设计合成特异性引物，用于分离鹿源bvdvjl05株的全基因扩增，引物见表1。经序列扩增和拼接，结果鹿源bvdvjl05株的全长为12290bp，经全基因序列的比对分析表明，该鹿源bvdv分离毒属于bvdv1型，如图3所示，将该分离毒株命名为鹿源牛病毒性腹泻病毒(bvdv)jl05株。该分离病毒株已送交北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmccno.15283，保藏时间为2018年1月11日。
表1bvdv全基因组扩增引物列表
实施例2鹿源bvdvjl05株的传代与噬斑克隆纯化
将分离的鹿源bvdvjl05株经mdbk细胞进行体外连续传代，至30代。其间每隔5代进行噬斑克隆纯化病毒(即f5、f10、f15、f20、f25代进行噬斑克隆纯化病毒)。即取鹿源bvdvjl05株病毒进行10倍系列稀释，稀释度范围为10-2～10-6，病毒稀释后接种长满80％单层的mdbk细胞的6孔细胞培养板，1ml/孔，吸附1h后弃病毒液，用无血清的dmem清洗3次，加入2×dmem与灭菌琼脂液的混合液，3ml/孔，室温冷却后置于37℃、5％co2培养箱中培养3～4d，观察噬斑，挑取噬斑较少孔内的单个噬斑保存并进行传代。
实施例3制苗用抗原液的制备
1、利用转瓶贴壁培养细胞制备鹿源bvdvjl05株抗原
在转瓶中培养mdbk细胞，细胞长满90～100％单层时，以胰酶-edta细胞分散液消化传代，以1:3～1:5的比例分散至新的转瓶中，细胞生长液为含5～8％新生牛血清的dmem。当细胞生长至80～90％单层时，以感染剂量(moi)为0.01～0.05将本发明的鹿源bvdvjl05株接种到mdbk细胞中，细胞维持液为含3％马血清的dmem，继续培养60～84h，当细胞病变达到80～90％时收获病毒液，-20℃保存备用。
2、利用微载体悬浮培养技术制备鹿源bvdvjl05株抗原
在转瓶中培养mdbk细胞，细胞长满90～100％单层时，以胰酶-edta细胞分散液消化，接种入细胞培养反应器，细胞接种密度为1×106个/ml～3×106个/ml，微载体的加入量为3～5g/l，细胞生长液为含5～8％新生牛血清的dmem，搅拌速度为40～100r/min，温度为36℃，ph为7.2～7.4。当微载体上70～80％汇满细胞后，弃生长液，加入含2～3％马血清的dmem，按moi0.01～0.05接种病毒，接毒48～72h后，细胞病变达到80～90％时，收获病毒液，-20℃保存备用。
3、制苗用抗原液的检验
按照《中华人民共和国兽药典》附录进行纯净性检验，抗原液应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒，每毫升鹿源牛病毒性腹泻病毒含量不低于107.2tcid50。
实施例4鹿源bvdvjl05株抗原液灭活及灭活效果检验
1、鹿源bvdvjl05株灭活
取实施例3中制备的抗原液，加入bei，终浓度分别为1mm、3mm和5mm，使其充分混合，然后置于37℃进行灭活，加入bei前(0h)及加入bei后30min，1h，2h，4h，8h，12h，18h，24h，30h分别收集样品(50ml/次)，取样后加入终浓度分别为0.1mol/l、0.3mol/l和0.5mol/l的硫代硫酸钠中和bei1小时，中和后的样品用于病毒效价测定，绘制灭活动力学曲线(如图4所示)。确定bei终浓度为3～4mm，灭活18～24h为病毒适宜灭活条件。
2、鹿源bvdvjl05株灭活效果检验
鹿源bvdvjl05株灭活后要进行灭活效果检验以确保病毒灭活彻底。
取生长良好长满90％单层mdbk细胞的转瓶4个，其中2瓶接种步骤1所制备的灭活病毒液25ml，其余1瓶为阴性对照，另1瓶为阳性对照，于37℃培养5d；观察cpe，如检测瓶和阴性对照瓶无cpe，而阳性对照瓶出现典型的bvdv病变，进行第二次盲传；收获转瓶内液体，冻融后接入相应的方瓶内，每瓶15ml，于37℃培养5d；观察cpe，如未观察到bvdv细胞病变，则认为病毒液灭活完全。
经检验，步骤1所制备的灭活病毒液，其病毒灭活完全。
实施例5鹿源bvdvjl05株灭活疫苗制备
将实施例4中灭活的病毒液(抗原液的病毒含量不低于107.2tcid50/ml)加入10％(w/v)硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％(w/v)；然后将制苗用病毒液与206佐剂按体积比1:1～1.2:1进行混合乳化，将抗原液缓慢加入206佐剂中，疫苗乳化转数为120r/min～200r/min，抗原液加完后继续乳化10～20min，获得灭活疫苗，共制备3批灭活疫苗，批号分别为lbv01、lbv02和lbv03。按照《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
实施例6鹿源bvdvjl05株灭活疫苗超剂量接种安全性试验
6-9月龄bvdv阴性梅花鹿共20只，分为4组，每组5只。1-3组分别接种3批实施例5所制备的鹿源bvdvjl05株灭活疫苗，每批疫苗接种梅花鹿5只，每只接种剂量为4ml(2头份)；第4组为对照组，接种mdbk细胞液4ml。注苗后14天，1～3组每只鹿再次接种相同批次，相同剂量的灭活疫苗作为二免，对照组接种4mlmdbk细胞液。每次疫苗接种后连续14天定点测量试验鹿直肠温度，并进行临床观察，主要包括鹿的精神状态、食欲、行为等。结果表明，试验鹿接种2倍剂量鹿源bvdvjl05株灭活疫苗，首次免疫和二次免疫后，试验鹿体温均正常，疫苗接种组和对照组试验鹿精神状态及食欲均良好，注苗部位吸收良好，未见不良反应。试验结果说明本发明鹿源bvdvjl05株灭活疫苗对梅花鹿是安全的。
实施例7鹿源bvdvjl05株灭活疫苗效力试验
试验共使用6-9月龄健康bvdv阴性梅花鹿10只，试验分为2组，每组5只动物。第1组(免疫组)免疫接种实施例5所制备的鹿源bvdvjl05株灭活疫苗(批号为lbv01)，每只鹿接种2ml疫苗，颈部肌肉注射；第2组为对照组，接种2mlmdbk对照细胞培养液，每只鹿接种2ml。首次免疫后14天，每组再次接种相同批次和剂量的灭活疫苗，对照组每只鹿接种2mlmdbk对照细胞培养液，二次免疫后二周，2组动物均使用bvdvjl02株效检用强毒(病毒效价为106.5tcid50/ml)攻击，每只鹿攻击剂量为5ml病毒液，鼻内喷雾接种。动物接种强毒后，每天观察临床症状，包括食欲、精神状态等；每天测定直肠体温；每2天采血用于白细胞计数和病毒分离，连续14天。
结果表明，该灭活疫苗接种梅花鹿后，对强毒攻击可产生较好的保护作用，免疫鹿均未出现bvdv相关临床症状，保护率为100％。而对照组5只鹿攻毒后均表现为体温明显升高，伴有白细胞减少，且病毒分离为阳性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>吉林农业大学
<120>鹿源牛病毒性腹泻灭活疫苗及其制备方法
<141>2018-02-07
<160>10
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