本发明涉及细胞生物学技术领域，更具体涉及一种冷冻外周血单个核细胞的复苏方法。
背景技术：
随着全国人口步入老龄化阶段，不良的生活方式和日益严重的环境污染等问题，导致我国癌症发病率一直居高不下。据统计，我国肿瘤发病率为：每10万人中有286人患癌，一生中有22％的概率患癌症；肿瘤死亡率为：每10万人有181人患癌死亡，一生中有13％的概率患癌症死亡，全国每天约1万人确诊癌症，每分钟约7人确诊患癌症。目前癌症的治疗手段主要有：手术治疗、放射治疗(放疗)和化学药物治疗(化疗)，但这些治疗手段很难完全根除肿瘤细胞，并且副作用较强，对机体本身伤害较大。随着现代分子生物学及基因工程改造技术的发展，以免疫细胞治疗为治疗手段的生物治疗方法迅速发展，已成为继手术治疗、放疗、化疗之后的第四大肿瘤治疗手段。并且，在2013年《sience》科学杂志公布癌症免疫治疗为科技创新首位。目前，免疫治疗的细胞主要来源于自体的外周血单个核细胞，外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)是指一群具有圆形细胞核的外周血细胞，由淋巴细胞(包括t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk自然杀伤细胞)、单核细胞(monocytes)、dc树突状细胞组成。
外周血中单个核细胞的纯化方式主要是利用密度梯度离心法进行分离。密度梯度离心法的原理为：血液中各种血液细胞，例如红细胞、粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、血小板及单个核细胞各成分的密度存在差异，在使用ficoll-hypaque(聚蔗糖一泛影葡胺)作为密度梯度分离液时，其各种成分会按照密度梯度重新分布聚集。由于血浆成分和血小板的密度稍低，进行密度梯度离心后悬浮于分离液的上层，红细胞及粒细胞的密度大，离心后沉淀于分离液的底部，而外周血单个核细胞的密度接近于ficoll-hypaque溶液，离心后位于离心管中部，呈现白色一层，故也称为白膜层，这样就可以大量获得单个核细胞。
目前，外周血单个核细胞的提取纯化手段和冻存方法较成熟，但冻存后的单个核细胞的复苏方法存在一系列问题，比如复苏后的细胞活力较差、回收率低，甚至会影响细胞形态及结构，导致单个核细胞受损。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供了一种显著提高细胞活率和回收率的冷冻外周血单个核细胞的复苏方法。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
提供一种冷冻外周血单个核细胞的复苏方法，该方法包括以下步骤：
1)准备清洗液：向无血清培养基中加入胎牛血清，颠倒混匀后，置入37℃水浴中预热，得到清洗液；
2)融化单个核细胞：在1分钟内将装有单个核细胞冻存液的冻存管从液氮中取出并转入37℃水浴中，快速晃动冻存管使单个核细胞冻存液融化，当冻存管中的单个核细胞冻存液为冰水混合物时，取出冻存管，停止水浴；
3)清洗单个核细胞：将步骤2)的冰水混合物逐滴加入到步骤1)的清洗液中，当冰水混合物完全加入到清洗液中后，缓慢颠倒3～5次混匀，得到细胞清洗混合液；清洗液可清洗单个核细胞并使其复苏，并且仅清洗一次就能达到较好的复苏效果，由此可以减少清洗次数，从而减小清洗液对单个核细胞的冲击，保持细胞状态良好；
4)离心并收集细胞：用离心机离心步骤3)的细胞清洗混合液，离心结束后，弃上清液，用37℃预热的无血清培养基重悬细胞，然后于37℃、5％co2中孵育。
优选地，在步骤1)和4)中，所述无血清培养基选自x-vivo15无血清培养基、kbm581无血清培养基和gt-t551无血清培养基中的任一种或多种。
更优选地，所述无血清培养基为x-vivo15无血清培养基。
优选地，在步骤1)中，所述清洗液中胎牛血清的体积分数为10～30％。
优选地，在步骤2)中，所述冰水混合物中冰的体积分数为5～10％。
优选地，所述装有单个核细胞冻存液的冻存管的冻存条件为：液氮冻存0～6个月。
优选地，在步骤3)中，所述冰水混合物与所述清洗液的体积比为1：7～12。
优选地，在步骤4)中，所述离心机的温度设置为37℃，速度设置为250g，时间设置为5～10min，升速加速度设置为3～5g/s，降速加速度设置为3～5g/s。
优选地，在步骤4)中，弃上清液后轻弹离心管管底3～5次，待单个核细胞松软后再重悬细胞。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明的复苏方法可以显著提高复苏的单个核细胞的活率至95％以上，显著提高复苏的单个核细胞的回收率至90％以上，对复苏后的单个核细胞的状态影响较小，并且对长期冻存的单个核细胞的复苏效果好。
附图说明
图1是对比例1与实施例1-3的单个核细胞复苏活率图；
图2是对比例1与实施例1-3的单个核细胞复苏回收率图；
图3是冻存于液氮1个月、3个月和6个月后单个核细胞复苏活率图；
图4是冻存于液氮1个月、3个月和6个月后单个核细胞复苏回收率图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
取15ml离心管一支，向其中添加8mlx-vivo15无血清培养基和2ml胎牛血清，上下颠倒混匀后，置入37℃水浴锅中预热，得到清洗液；在1分钟内将装有1ml单个核细胞冻存液的冻存管从-196℃液氮中取出并转入37℃水浴锅中，快速晃动冻存管使单个核细胞冻存液融化，当观察到冻存管中的单个核细胞冻存液为含有5～10％(体积分数)冰的冰水混合物时，取出冻存管，停止水浴，即停止融化操作，将冻存管转移至生物安全柜中；迅速将冰水混合物逐滴加入到清洗液中，并不停晃动离心管，当冰水混合物完全加入到清洗液中后，缓慢颠倒3～5次混匀，得到细胞清洗混合液；用离心机离心细胞清洗混合液，离心机的温度设置为37℃，速度设置为250g，时间设置为10min，升速加速度设置为4g/s，降速加速度设置为4g/s，离心结束后，迅速将离心管取出，吸取并去除上清后，轻弹离心管管底3～5次，待单个核细胞松软后，用37℃预热的x-vivo15无血清培养基重悬细胞，转移至t-175培养瓶，于37℃、5％co2中孵育，获得复苏的外周血单个核细胞，测试单个核细胞的复苏活率和回收率，结果如图1和2所示。
实施例2
取15ml离心管一支，向其中添加7mlkbm581无血清培养基和3ml胎牛血清，上下颠倒混匀后，置入37℃水浴锅中预热，得到清洗液；在1分钟内将装有1.4ml单个核细胞冻存液的冻存管从-196℃液氮中取出并转入37℃水浴锅中，快速晃动冻存管使单个核细胞冻存液融化，当观察到冻存管中的单个核细胞冻存液为含有5～10％(体积分数)冰的冰水混合物时，取出冻存管，停止水浴，即停止融化操作，将冻存管转移至生物安全柜中；迅速将冰水混合物逐滴加入到清洗液中，并不停晃动离心管，当冰水混合物完全加入到清洗液中后，缓慢颠倒3～5次混匀，得到细胞清洗混合液；用离心机离心细胞清洗混合液，离心机的温度设置为37℃，速度设置为250g，时间设置为5min，升速加速度设置为5g/s，降速加速度设置为5g/s，离心结束后，迅速将离心管取出，吸取并去除上清后，轻弹离心管管底3～5次，待单个核细胞松软后，用37℃预热的kbm581无血清培养基重悬细胞，转移至t-175培养瓶，于37℃、5％co2中孵育，获得复苏的外周血单个核细胞，测试单个核细胞的复苏活率和回收率，结果如图1和2所示。
实施例3
取15ml离心管一支，向其中添加9mlgt-t551无血清培养基和1ml胎牛血清，上下颠倒混匀后，置入37℃水浴锅中预热，得到清洗液；在1分钟内将装有0.9ml单个核细胞冻存液的冻存管从-196℃液氮中取出并转入37℃水浴锅中，快速晃动冻存管使单个核细胞冻存液融化，当观察到冻存管中的单个核细胞冻存液为含有5～10％(体积分数)冰的冰水混合物时，取出冻存管，停止水浴，即停止融化操作，将冻存管转移至生物安全柜中；迅速将冰水混合物逐滴加入到清洗液中，并不停晃动离心管，当冰水混合物完全加入到清洗液中后，缓慢颠倒3～5次混匀，得到细胞清洗混合液；用离心机离心细胞清洗混合液，离心机的温度设置为37℃，速度设置为250g，时间设置为7min，升速加速度设置为3g/s，降速加速度设置为3g/s，离心结束后，迅速将离心管取出，吸取并去除上清后，轻弹离心管管底3～5次，待单个核细胞松软后，用37℃预热的gt-t551无血清培养基重悬细胞，转移至t-175培养瓶，于37℃、5％co2中孵育，获得复苏的外周血单个核细胞，测试单个核细胞的复苏活率和回收率，结果如图1和2所示。
实施例4
用实施例1的方法复苏分别冻存于-196℃液氮1个月、3个月和6个月的冷冻外周血单个核细胞，测试单个核细胞复苏活率和回收率，结果如图3和4所示。由图3和图4可以看出，冻存的细胞经过复苏后，活细胞的比例可达95％以上，并且有超过90％的细胞被回收，其中冷冻1个月的细胞的复苏活率和回收率最高，冷冻3个月和6个月的细胞的复苏活率和回收率略有下降，说明本实施例的方法可有效复苏长期冻存的单个核细胞。
对比例1
用实施例1的方法复苏冷冻外周血单个核细胞，区别在于：用含有2ml胎牛血清和8mlrpmi1640基础培养基的清洗液清洗单个核细胞；离心机的速度设置为350g，升速和降速加速度均为0g/s，用添加fbs的rpmi1640培养基重悬细胞。测试复苏后的单个核细胞的复苏活率和回收率，结果如图1和2所示。
由图1和图2可以看出，实施例1-3中复苏后的单个核细胞的活率最高可达95％以上，单个核细胞的回收率最高可达90％以上，而对比例1中的复苏活率和回收率均不到80％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。