本发明涉及生物细胞分离
技术领域：
，具体涉及一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法和无血清培养基。
背景技术：
：间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)来源于发育早期的中胚层，率先在骨髓中发现，后来研究发现间充质干细胞存在于多种组织中，如脂肪、脐带、脐带血、胎盘等。间充质干细胞阳性表达细胞表面标志物cd73、cd90、cd105，阴性表达cd19、cd34、cd14、cd45、hla-dr，是有别于造血系统的细胞，具有多向分化潜能，可以在特定条件下分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、韧带、神经、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，研究发现它还有治疗多种疾病的潜能，尤其是免疫调节以及组织修复方面，其来源广泛、获取方便，能够快速扩增，有显著临床应用优势。关于骨髓间充质干细胞(bmscs)的研究较多，但操作相对复杂、细胞数量少，应用受限，相比之下，脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstemcells，adscs)同样具有多项分化潜能，来源充足，分离方法更加容易，不存在伦理学问题，且含量更高(100g的脂肪组织中mscs数量约是100ml骨髓中的300倍)，可以分泌更多的细胞因子，在代谢调节方面有其他来源细胞无法比拟的优势，因此更能满足未来组织工程学的相关应用。然而目前，人源脂肪肝细胞的体外分离培养却一直是个难题，常用方法是采用机械法去除血管、胰蛋白酶加胶原酶消化法分离，但是此种方法分离效率低，脂肪干细胞无法充分释放，分离周期长，脂肪组织需要量大，且大部分方法不可避免的需要使用胎牛血清，容易引起外源性污染，细胞形态变异等，特别是动物血清内潜在动物源性内毒素或病毒将对人体健康构成极大的风险，这样培养出的干细胞不适于直接应用于临床。干细胞无血清培养基的出现，为解决这些问题提供了希望，但是现有市售无血清培养基存在成分复杂、细胞增殖不够理想、价格昂贵等缺陷，仍不能满足大量培养需求，要满足组织工程学应用，开发研究高效分离、培养原代脂肪间充质干细胞的方法及产品迫在眉睫。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法和无血清培养基，用以解决现有干细胞无血清培养基成分复杂、细胞增殖率低、价格昂贵的技术问题。为实现上述目的，本发明的技术方案一为：一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：①分离收集脂肪组织并清洗，向脂肪组织中加入混合消化酶溶液，37℃消化30-90min，加入培养基终止消化，吹打均匀后，1500-3000rpm离心10-30min，收集底部沉淀，得原代脂肪间充质干细胞，所述混合消化酶溶液为溶有胰蛋白酶和i型胶原酶的pbs缓冲溶液；②配制无血清培养基:向基础培养基中加入抗坏血酸、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生因子和人血白蛋白，配制成无血清培养基；③将原代脂肪间充质干细胞以步骤②的无血清培养基重悬，37℃、5％co2培养箱中培养。优选的，所述混合消化酶溶液中胰蛋白酶浓度为0.5-1.5wt.％，i型胶原酶浓度为0.5-1.5wt.％。优选的，所述无血清培养基中各组分浓度为抗坏血酸60-80mg/l，碱性成纤维细胞生长因子10-30μg/l、血小板衍生因子10-30μg/l和人血白蛋白4-8g/l。优选的，所述无血清培养基中组分浓度为抗坏血酸60mg/l，碱性成纤维细胞生长因子20μg/l、血小板衍生因子20μg/l和人血白蛋白5g/l.优选的，所述基础培养基为α-mem培养基。优选的，所述步骤③将原代脂肪间充质干细胞以步骤②的无血清培养基重悬前，将原代脂肪间充质干细胞以100μm的细胞滤筛过滤。本发明提供技术方案二：一种脂肪间充质干细胞的无血清培养基，所述无血清培养基为基础培养基中加入抗坏血酸、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生因子和人血白蛋白。优选的，所述无血清干细胞培养基中组分浓度为抗坏血酸60-80mg/l，碱性成纤维细胞生长因子10-30μg/l、血小板衍生因子10-30μg/l和人血白蛋白4-8g/l。优选的，所述无血清干细胞培养基中组分浓度为抗坏血酸60mg/l，碱性成纤维细胞生长因子20μg/l、血小板衍生因子20μg/l和人血白蛋白5g/l。优选的，所述基础培养基为α-mem培养基。本发明所提供技术方案中，脂肪间充质干细胞的分离培养方法，关键在于混合消化酶的选择及无血清培养基的科学组成，胰蛋白酶和i型胶原酶科学配比，能高效分离获得大量脂肪间充质干细胞，进一步以含有多种细胞因子及其他营养成分的无血清培养基进行培养，促进脂肪间充质干细胞高效增殖，其中血小板衍生因子(pdgf)是一种重要的促有丝分裂因子，与细胞表面的特异性受体结合后可激活相应信号通路，促进胶原蛋白、非胶原蛋白和蛋白多糖的合成，促进细胞增殖；碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)作为一种强丝裂原，通过促进有丝分裂以及dna合成从而促进来源于中胚层和外胚层细胞的增殖，且其对于干细胞分化有抑制作用；抗坏血酸是一种重要的辅酶和抗氧化剂，可参与细胞内呼吸链作用，维持正常代谢进行，从而有利于细胞的存活，但浓度较高时会使干细胞分化；人血白蛋白为细胞生长提供所需的氨基酸类营养物质。本发明提供的无血清培养基组成中，通过巧妙选择抗坏血酸与细胞因子、营养组分作为组合，并进一步科学、合理配比，使之产生协同作用，从而高效促进脂肪间充质干细胞的增殖。本发明具有如下优点：本发明提供的脂肪间充质干细胞的分离培养方法，方法简单，能高效、快速分离脂肪间充质干细胞，所得细胞数量大，细胞形态好，减少了样本用量；提供的无血清培养基组分科学，配比优良，利于脂肪间充质干细胞的生长，大大提高了脂肪间充质干细胞增殖率。附图说明图1为实施例1中不同培养方法时间充质干细胞扩增结果数据图。图2为实施例1中本发明分离培养方法分离的脂肪间充质干细胞流式表型分析结果图。图3为实施例1中对比例中分离的脂肪间充质干细胞流式表型分析结果图。图4为实施例2中不同培养方法时间充质干细胞扩增结果数据图。图5为实施例2中本发明分离培养方法分离的脂肪间充质干细胞流式表型分析结果图。图6为实施例2中对比例中分离的脂肪间充质干细胞流式表型分析结果图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，实施例中涉及操作及方法，如何特殊说明，均为常规方法；所涉及的试剂，如无特殊说明，均为常规试剂，涉及的符号wt.％表示质量百分比。实施例1脂肪间充质干细胞的无血清培养基本实施例用于详细说明本发明提供的用于培养脂肪间充质干细胞的无血清培养基的组成，示例性组成如下表1所示。实施例2脂肪间充质干细胞的分离培养方法本实施例用于详细介绍脂肪间充质干细胞的分离培养方法包括以下步骤：①收集抽脂来源的脂肪组织，加入等体积的无菌pbs缓冲溶液进行清洗，放于离心机中800rpm/min，离心5min，离心完毕后将下层pbs缓冲溶液和底部沉淀用吸管吸出弃掉，保留上层漂浮的脂肪组织，若脂肪组织中红色较多，可再清洗一次；取清洗后的脂肪组织10ml，加入2ml1wt.％的胰蛋白酶溶液(将胰蛋白酶溶于无菌pbs缓冲溶液混合均匀配制而成)、2ml1wt.％的i型胶原酶溶液(将i型胶原酶溶于无菌pbs缓冲溶液混合均匀配制而成)和6ml无菌pbs，混匀后，放于37℃摇床中220转/分消化1h，加入α-mem培养基终止消化，吹打均匀后，2000rpm离心150min，收集底部沉淀，得原代脂肪间充质干细胞；②配制无血清培养基:向500mlα-mem基础培养基中加入抗坏血酸30mg、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)10μg、血小板衍生因子(pdgf)10μg和人血白蛋白2.5g，配制成无血清培养基，为防止污染，可按照常规用量再加入青霉素、链霉素，如青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml；③将原代脂肪间充质干细胞以步骤②的无血清培养基重悬，转入10cm2培养皿中，一般控制每个10cm2培养皿中培养20-40ml脂肪组织分离的脂肪间充质干细胞，置于37℃、5％co2培养箱中培养，培养4天后进行换液处理，当细胞90％融合后即可进行传代培养。本实施例同时设置对比例，对比例以普通常规方法分离培养脂肪间充质干细胞，与本发明方法的不同在于：步骤①中消化时加入2ml1wt.％的i型胶原酶溶液(将i型胶原酶溶于无菌pbs缓冲溶液混合均匀配制而成)和8ml无菌pbs缓冲溶液；培养基中不含上述生长因子及抗坏血酸，而是采用dmem基础培养基加入10％体积的fbs(即dmem+10％fbs)。采用下述方法检测本发明分离培养方法和对比例中经典培养方法对所得间充质干细胞的增殖效率及细胞表型的影响。(一)cck-8测定细胞增殖以传代至第三代的脂肪间充质干细胞，按照1.0×105个/ml、2.0×105个/ml、4.0×105个/ml、8.0×105个/ml、1.6×105个/ml接种于96孔板，以细胞数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。分别将上述两种不同分离培养方法，传代至第三代的脂肪间充质干细胞，在96孔板每孔加入100μl浓度5×103个/ml的细胞悬液，每组设置3个复孔，放入培养箱中培养，1h后再每孔加入cck-8溶液10μl，继续培养，并随培养天数测定吸光度值，测定方式是酶标仪测450nm处的吸光度值，并用630nm的波长吸光度值为参比。结果如附图1所示，显示本发明提供的无血清培养基及培养方法与对比例中采用dmem+10％fbs培养的细胞相比，两组均在第3～6天开始对数生长，而本发明所用的无血清培养基，更能促进脂肪间充质干细胞的生长，检测结果显示每天检测时，本发明细胞数量均比对比组高10％以上。(二)流式细胞仪检测脂肪间充质干细胞的细胞表型分别将上述两种不同分离培养方法，选择第六代的脂肪间充质干细胞，用0.05wt.％胰蛋白酶消化，pbs洗2遍后，用小鼠抗人cd34-pe/cy7、cd45-fitc、hla-dr-pe/cy7、cd73-pe、cd90-fitc及cd105-pe抗体标记细胞表面抗原，每个待测样品约1×106个细胞，室温避光孵育30min，pbs缓冲溶液清洗2遍后，用流式细胞仪检测相关抗原表达情况。结果如附图2和3所示，本发明分离培养的脂肪间充质干细胞与对比例中采用经典方法分离的脂肪间充质干细胞均表达cd90、cd105、cd73，不表达或低表达hla-dr、cd34、cd45，细胞表型无差异。实施例2本实施例以手术脂肪组织作为分离对象，说明本发明脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：①收集手术脂肪组织5g，用无菌pbs缓冲溶液清洗直到无血色，用无菌剪刀剪成1mm3的组织块，加入1ml1wt.％的胰蛋白酶溶液(将胰蛋白酶溶于无菌pbs缓冲溶液混合均匀配制而成)、1ml1wt.％的i型胶原酶溶液(将i型胶原酶溶于无菌pbs缓冲溶液混合均匀配制而成)和8ml无菌pbs，混匀后，放于37℃摇床中250转/分消化1h，加入10ml的α-mem培养基终止消化，吹打均匀后，2000rpm离心15min，收集底部沉淀，得原代脂肪间充质干细胞；②配制无血清培养基:向500mlα-mem基础培养基中加入抗坏血酸35mg、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)10μg、血小板衍生因子(pdgf)10μg和人血白蛋白3g，配制成无血清培养基，为防止污染，可按照常规用量再加入青霉素、链霉素，如青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml；③将原代脂肪间充质干细胞以步骤②的无血清培养基重悬，转入10cm2培养皿中，置于37℃、5％co2培养箱中培养，培养4天后进行换液处理，当细胞90％融合后即可进行传代培养。本实施例同时设置对比例，对比例以普通常规方法分离培养脂肪间充质干细胞，与本发明方法的不同在于：步骤①中消化时加入1ml1wt.％的i型胶原酶溶液(将i型胶原酶溶于无菌pbs缓冲溶液混合均匀配制而成)和9ml无菌pbs缓冲溶液；培养基中不含上述生长因子及抗坏血酸，而是采用dmem基础培养基加入10％体积的fbs。采用实施例1相同的方法检测本发明分离培养方法和对比例中经典培养方法对所得间充质干细胞的增殖效率及细胞表型的影响。cck-8测定细胞增殖的结果见附图4所示，结果显示，本发明的无血清培养基及培养方法与对比例中采用dmem+10％fbs培养的细胞相比，两组均在第3～6天开始对数生长，而本发明所用的无血清培养基，更能促进脂肪间充质干细胞的生长，每次检测的细胞数量本发明组均比对比组高10％以上。流式细胞仪检测脂肪间充质干细胞的细胞表型的结果分别见附图5和6所示，结果显示，本发明分离培养的脂肪间充质干细胞与对比例中采用经典方法分离的脂肪间充质干细胞均表达cd90、cd105、cd73，不表达或低表达hla-dr、cd34、cd45，细胞表型无差异。实施例1及实施例2充分说明，本发明提供的脂肪间充质干细胞的分离培养方法，能高效、充分分离脂肪组织的间充质干细胞，且本发明提供的无血清培养基，对细胞增殖具有显著的促进作用。实施例3本实施例以手术脂肪组织作为分离对象，说明本发明脂肪间充质干细胞的分离培养方法中，混合酶溶液的高效消化，方法步骤及实验设置如下：①收集手术脂肪组织20g，用无菌pbs缓冲溶液清洗直到无血色，用无菌剪刀剪成1mm3的组织块，平均分成a、b和c组，共3组，a组加入1ml1wt.％的胰蛋白酶溶液(将胰蛋白酶溶于无菌pbs缓冲溶液混合均匀配制而成)、1ml1wt.％的i型胶原酶溶液(将i型胶原酶溶于无菌pbs缓冲溶液混合均匀配制而成)和8ml无菌pbs；b组加入1ml1wt.％的胰蛋白酶溶液(将胰蛋白酶溶于无菌pbs缓冲溶液混合均匀配制而成)和9ml无菌pbs；c组加入1ml1wt.％的i型胶原酶溶液(将i型胶原酶溶于无菌pbs缓冲溶液混合均匀配制而成)和9ml无菌pbs；混匀后，三组均放于37℃摇床中250转/分消化40min，然后加入10ml的α-mem培养基终止消化，吹打均匀后，分别以2000rpm离心15min，收集底部沉淀，并以10mlα-mem培养基重悬，对所得脂肪间充质干细胞计数，结果如下：组别abc细胞数/个6.3×1041.6×1043.9×104上述结果表明，以本发明分离培养方法中的混合消化酶溶液作为消化液，相比于单一消化酶，消化效率大大提高，且比两组单一消化酶的效果之和高出约14.5％，进一步经重复，该结果具有显著性差异。②配制无血清培养基:向500mlα-mem基础培养基中加入抗坏血酸35mg、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)10μg、血小板衍生因子(pdgf)10μg和人血白蛋白3g，配制成无血清培养基，为防止污染，可按照常规用量再加入青霉素、链霉素，如青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml；③将原代脂肪间充质干细胞以步骤②的无血清培养基重悬，转入10cm2培养皿中，置于37℃、5％co2培养箱中培养，培养4天后进行换液处理，当细胞90％融合后即可进行传代培养。实施例4本实施例旨在研究无血清培养基的组成对细胞增殖的影响。采用，以实施例1所述方法分离培养的脂肪间充质干细胞传代至第三代，以α-mem基础培养基重悬后，吹打均匀，平均分至d、e、f、g、h、i共6个离心管中，2000rpm离心15min，然后向各离心管中分别加入10ml如下的培养基：d管加入本发明的无血清培养基(500mlα-mem基础培养基中加入抗坏血酸35mg、bfgf10μg、pdgf10μg和人血白蛋白3g，青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml；e管加入的培养基组成为：500mlα-mem基础培养基中加入抗坏血酸35mg，青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml；f管加入的培养基组成为：500mlα-mem基础培养基中加入bfgf10μg、pdgf10μg，青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml；g管加入的培养基组成为：500mlα-mem基础培养基中加入人血白蛋白3g，青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml；h管加入的培养基为：500mlα-mem基础培养基中加入50mlfbs，青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml；i管加入的培养基为：α-mem基础培养基，青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml；对各管细胞以对应的培养基重悬，并调整细胞密度5×103个/ml，在96孔板每孔加入100μl浓度的细胞悬液，每组设置3个复孔，放入培养箱中培养，24h、48h及72h后，分别在每孔加入cck-8溶液10μl，并放于培养箱中孵育1h,，测定吸光度值并进行归一化处理，测定方式是酶标仪测450nm处的吸光度值，并用630nm的波长吸光度值为参比。以i组增值率为100％计，d、e、f、g及h组的细胞增殖结果见下表所示：24h48h72hd163％185％177％e152％173％169％f131％160％149％g147％152％165％h139％158％147％i100％100％100％上述数据可见，本发明提供的无血清培养基，对细胞增殖率相比添加10％血清的h组提高40％-60％，相比只添加抗坏血酸、单生长因子或人血白蛋白的组别，细胞增殖率也大大提高。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12