一种副猪嗜血杆菌OmpP2基因缺失株及其构建方法和应用与流程

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌ompp2基因缺失株，还涉及此副猪嗜血杆菌ompp2基因缺失株的构建方法和应用。

背景技术：

副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis,hps)隶属于巴斯德菌科(pasteurellaceae)嗜血杆菌属，是一种多形态的小杆菌，该菌不溶血，而且不具有运动性。显微镜下观察，该菌是革兰氏阴性菌，形态不一，从单个的球杆菌到长的、细长的，以至丝状的菌体。hps常引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜炎，由该菌引起的病又称为猪病。该菌于1922年由schermer和ehrlich首次分离出来的，但是直到1992才通过spf(specificpathogenfree，无特定病原体)猪证实hps的致病性以及不同血清型菌株之间的毒力差异。hps可以影响2周龄～4月龄猪，主要是断奶前后以及保育阶段的仔猪，通常见于5周龄～8周龄的猪，发病率可达40％，严重时死亡率达50％。

近几年，集约化密集养殖、无序引种的影响使得由hps引起的关节炎、心包炎、腹膜炎的报道越来越多，特别是一些免疫抑制性疾病如猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等经常与hps混合感染或继发感染，对全球的养猪业造成巨大的经济损失，也给副猪嗜血杆菌病的诊断和综合防治带来了巨大的困难。

关于hps的毒力基因或毒力岛及其致病机制研究越来越多，已确定的hps毒力因子主要包括脂多糖、转铁结合蛋白、神经氨酸酶，荚膜多糖、外膜蛋白、溶血素操纵子hhdba也被发现与毒力有一定的相关性，但仍需进一步研究证实。

外膜蛋白(outermembraneprotein，omp)是革兰氏阴性菌的特有结构，在细胞壁成分含量中占了一半以上，具有支持细胞结构、运输营养物质、结合噬菌体受体等功能。有研究表明omp与hps的毒力有关，而且从健康仔猪与患病猪中分离到的omp有差异性，从患有多发性浆膜炎和关节炎症状的病猪体内分离的omp基本相同。

hpsompp2基因对宿主细胞的毒力及其在宿主细胞中的致病作用尚不明确，因此，获得一种ompp2基因缺失的hps是十分必要的。cn103865834a公开了一种缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258-181643位核苷酸的双基因缺失株，构建hps不含抗性标记的双基因缺失菌株，并对其生物学特性及致病力等进行探讨，为进一步研制新型高效可提供高交叉保护效力的基因工程活疫苗打下基础。但在此专利中仍然没有明确ompp2基因与毒力的直接关系。

技术实现要素：

为了解决hpsompp2基因对宿主细胞的毒力及其在宿主细胞中的致病作用的问题，本发明构建了一株hps基因缺失株，是在hps1型lc株的基础上，利用同源重组技术，敲除掉ompp2部分基因而获得，该缺失菌株已于2017年10月11日送至中国典型培养物保藏中心保藏，命名为副猪嗜血杆菌lcδompp2(haemophilusparasuislcδompp2)，保藏编号：cctccno：m2017574，地址：中国武汉武汉大学。

所述的副猪嗜血杆菌ompp2基因缺失株lcδompp2，相对于副猪嗜血杆菌lc株，缺失的序列见序列表中序列12。

所述的副猪嗜血杆菌ompp2基因缺失株lcδompp2，相对于副猪嗜血杆菌lc株，毒力降低。

一种副猪嗜血杆菌ompp2基因缺失株的构建方法，包括以下步骤：

(1)扩增ompp2基因上、下同源臂，得到基因片段ompp2up和ompp2down；

(2)扩增庆大霉素抗性基因，得到基因片段gm；

(3)将基因片段ompp2up与gm连接得到ompp2up-gm，再与ompp2down连接得到基因片段ompp2up-down；

(4)通过酶切将基因片段ompp2up-down连接到自杀性质粒pk18mobsacb中，得到重组质粒pk18-ompp2；

(5)重组质粒转化副猪嗜血杆菌，即得。

以hpslc株基因组为模板，以ompp2up-f和ompp2up-r、ompp2down-f和ompp2down-r为引物，进行pcr扩增，扩增条带经电泳图显示，大小约为500bp左右，与预期的目的片段478bp和525bp一致，将扩增产物回收。由于hps对庆大霉素(gm)敏感，因此用引物从质粒上扩增庆大霉素抗性基因以作为筛选标记，扩增产物经电泳图显示，条带约为750bp左右，大小与预期目的片段783bp一致，将扩增产物回收。将回收的ompp2up、ompp2down和gm片段通过overlappcr连接，将扩增产物回收。分别用bamhi和hindiii将回收片段与自杀质粒pk18mobsacb进行双酶切。目的片段回收，16℃过夜连接，连接产物转化e.colidh5α。将gm抗性基因pcr鉴定阳性的克隆扩大培养，提取质粒，用bamhi和hindiii双酶切鉴定。双酶切电泳图显示有两条带，一条带大于5000bp，另一条带大小约为1800bp，与预期的1749bp目的片段和pk18mobsacb质粒大小相符，将鉴定正确的重组质粒命名为pk18-ompp2。将重组质粒pk18-ompp2自然转化入lc株中，用gm(25μg/ml)抗性的tsa平板(含5％血清和0.001％nad)筛选转化子。挑取抗性平板上的单克隆到含有gm(25μg/ml)的tsb培养基(含5％血清和0.001％nad)中，过夜培养。以gm-f、gm-r为引物，扩增庆大霉素抗性基因，得到大于500bp的gm基因片段，扩增结果显示gm片段成功插入基因组中。设计一对引物ompp2-1、ompp2-2扩增缺失的ompp2片段，阳性转化子过夜培养菌液为模板进行pcr扩增反应，无扩增条带。以lc株作为对照，pcr扩增反应得到1194bp的条带。pcr产物电泳图显示已经成功缺失了ompp2基因全长。将筛选到的lz株ompp2基因缺失株在含有gm的tsa平板上盲传，用引物gm-f、gm-r和ompp2-1、ompp2-2对每一代都进行鉴定，鉴定结果显示连续传了5代都没有扩增出ompp2基因片段。

所述的构建方法，步骤(1)中扩增ompp2基因上、下同源臂的引物序列如下：

ompp2up-f：5'-ataggatccaccgcttgttctctgtattaagcgtatag-3'，

ompp2up-r：5'-gttgctgctgcgtaacataatgttcaccttaagttttt-3'，

ompp2down-f：5'-ccaagtaccgccacctaatctagatagttaggtactat-3'，

ompp2down-r：5'-ttaaagcttacaagcggtgctgaacagggtaaagtagc-3'。

所述的构建方法，步骤(2)中扩增gm的引物序列如下：

gm-f:5'-atgttacgcagcagcaacgatg-3'，

gm-r:5'-ttaggtggcggtacttgggt-3'。

所述的副猪嗜血杆菌ompp2基因缺失株lcδompp2在宿主细胞试验及致病性中的应用。

本发明的原理是基因的同源重组技术，通过外源dna与染色体dna之间的同源序列发生重组。我们通过自然转化的方法来实现同源重组。自然转化法是细菌感受态细胞摄取外源dna并将其稳定遗传的方法。副猪嗜血杆菌感受态细胞的建立受camp受体蛋白crp调控，camp浓度升高可以激活其受体蛋白crp。

与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：

1.本发明所用的材料为hps野生致病菌株lc株，该菌株是从发病猪中分离得到的一株血清1型菌株，对猪有较强的致病性，不仅能提供同源攻毒保护，还可为血清4型、5型、10型、12型、14型和15型hps等异源攻毒提供一定的交叉保护。因此，以该致病菌进一步构建的ompp2基因缺失株在研究hps分子机制方面有广阔的应用前景；

2.hpsompp2基因缺失后，获得的缺失株生长速度减慢，对小鼠的致病性降低；

3.hpsompp2基因缺失后，获得的缺失株对宿主细胞(猪肺泡巨噬细胞)的粘附和入侵能力减弱；

4.hpsompp2基因缺失株的构建方法也适用于hps其他基因缺失株的构建；

5.hpsompp2基因缺失株lcδompp2可以作为hpsompp2基因功能研究及致病机制研究的参考菌株。

附图说明

图1ompp2up和ompp2downpcr扩增结果，m：dl2000；1-6：ompp2up扩增结果；7-11：ompp2down扩增结果；

图2gm基因pcr扩增结果，m：dl2000；1-2：gm扩增结果；

图3重组自杀性质粒酶切鉴定结果；

图4重组质粒pk18-ompp2图谱；

图5hps基因缺失株pcr鉴定结果,a：引物hps-f/r扩增；b：引物gm-f/r扩增；c：引物ompp2-1/2扩增；d：引物ompp2up-f/down-r扩增m：dl2000/dl5000；1-4：hps基因缺失株；lc：hpslc株；

图6hps野生株与缺失株生长时间与od600nm的关系；

图7hps野生株与缺失株粘附猪肺泡巨噬细胞试验结果；

图8hps野生株与缺失株入侵猪肺泡巨噬细胞试验结果。

菌种保藏信息

保藏时间：2017年10月11日，

保藏单位：中国典型培养物保藏中心，

保藏编号：cctccno：m2017574，

保藏单位地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072

分类命名：副猪嗜血杆菌haemophilusparasuis。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1.hpsompp2基因上、下同源臂的扩增

根据genbank上公布的hpsh49菌株的ompp2基因序列(fj685759.1)设计引物，以hps血清1型lc株基因组为模板，扩增ompp2基因的上、下游同源臂。在上游同源臂的上游引物ompp2up5’-端加入bamhi酶切位点和uss序列，在下游同源臂的下游引物ompp2down5’-端引入hindiii酶切位点和uss序列。所述引物序列如下：

ompp2up-f：5'-ataggatccaccgcttgttctctgtattaagcgtatag-3'

(下划线代表bamhi酶切位点；斜体代表uss序列)

ompp2up-r：5'-gttgctgctgcgtaacataatgttcaccttaagttttt-3'

引物ompp2up-f和ompp2up-r扩增上游同源臂480bp。

ompp2down-f：5'-ccaagtaccgccacctaatctagatagttaggtactat-3'

ompp2down-r：5'-ttaaagcttacaagcggtgctgaacagggtaaagtagc-3'

(下划线代表hindiii酶切位点；斜体代表uss序列)

引物ompp2down-f和ompp2down-r扩增下游同源臂528bp。

将冻干的hps血清1型lc株在tsa平板(胰蛋白胨大豆琼脂培养基，购自美国bd公司，添加体积为5％的新生牛血清和0.001％的辅酶nad)上复苏2代后，挑取单菌落置于100μl灭菌水中，吹打混匀后，煮沸10min，反复冻融两次后，5000rpm离心5min，取上清作为模板，pcr扩增体系为50μl，反应体系如下：10×pcrbuffer5μl，2.5mmol/ldntp4μl，mgcl23μl，上游引物2μl，下游引物2μl，taqdnapolymerase1μl，模板4μl，ddh2o补充至50μl。

pcr扩增条件为：95℃预变性5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。扩增条带经1％琼脂凝胶电泳分析，大约为500bp左右，与预期的目的片段478bp和525bp一致(图1)，将扩增产物回收，纯化目的片段。

2.庆大霉素抗性基因(gm)的扩增

选用庆大霉素作为筛选标记，参考pfastbaci质粒上的gm抗性基因序列，设计可用于overlappcr扩增的引物扩增gm基因。引物序列如下：

gm-f:5'-atgttacgcagcagcaacgatg-3'

gm-r:5'-ttaggtggcggtacttgggt-3'

以pfastbaci质粒为模板，反应体系如下：10×pcrbuffer5μl，2.5mmol/ldntp4μl，mgcl23μl，上游引物2μl，下游引物2μl，taqdnapolymerase1μl，模板4μl，ddh2o补充至50μl。

pcr扩增条件为：95℃预变性5min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。扩增条带经1％琼脂凝胶电泳分析，大约为7500bp左右，与预期的目的片段783bp一致(图2)，将扩增产物回收，纯化目的片段。

3.overlappcr

将回收纯化的ompp2up与gm通过overlappcr连接，反应体系如下：10×pcrbuffer10μl，2.5mmol/ldntp5μl，上游引物ompp2up-f2μl，下游引物gm-r2μl，fastpfudnapolymerase1μl，模板ompp2up、gm各2μl，ddh2o补充至50μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min，95℃45s，60℃1min，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min。扩增条带经1％琼脂凝胶电泳分析，大约为1200bp左右，与预期的目的片段1242bp一致，将扩增产物回收，纯化目的片段ompp2up-gm。

将回收纯化的ompp2up-gm与ompp2down通过overlappcr连接，反应体系同上。pcr扩增条件为：95℃预变性5min，95℃1min，60℃1min，72℃1min30s，35个循环，72℃延伸10min。扩增条带经1％琼脂凝胶电泳分析，出现大于1500bp左右，与预期的目的片段1749bp一致，将扩增产物回收，纯化目的片段ompp2up-down。

4.构建重组自杀性质粒pk18-ompp2

分别用bamhi和hindiii将自杀性质粒pk18mobsacb和回收纯化的ompp2up-down双酶切。目的片段回收，16℃水浴锅过夜连接，连接产物转化e.colidh5α。将gm抗性基因pcr鉴定阳性的克隆扩大培养，提取质粒，用bamhi和hindiii双酶切鉴定。双酶切电泳图显示有两条带，一条带大于5000bp，另一条带大小约为1800bp，与预期的1749bp目的片段和pk18mobsacb质粒大小相符(图3)，将鉴定正确的重组质粒命名为pk18-ompp2(图4)。5.重组质粒自然转化hpslc株

从活化的lc平板上挑取3个单菌落密集划线与tsa平板(添加体积为5％的新生牛血清和0.001％的辅酶nad)，37℃培养箱培养12～16h。用tsb液体培养基(添加体积为5％的新生牛血清和0.001％的辅酶nad)洗下菌苔，10倍稀释后，调od600nm＝0.6。取20μl菌液于1.5ml无菌离心管中，加入20μm的camp，混匀后静置10min；加入2～5μg重组自杀性质粒pk18-ompp2，轻轻混匀。将上述溶液转移至直径70mm的tsa平板(添加体积为5％的新生牛血清和0.001％的辅酶nad)上，37℃正置培养6h。用400μltsb液体培养基(添加体积为5％的新生牛血清和0.001％的辅酶nad)洗下培养物，取50μl涂布于gm(25μg/ml)抗性的tsa平板(添加体积为5％的新生牛血清和0.001％的辅酶nad)，37℃培养至长出转化子。

6.hpslc株ompp2基因缺失株的鉴定

挑取自然转化后长出的单克隆转化子到含有gm(25μg/ml)的tsb培养基(含5％血清和0.001％nad)中，过夜培养，用引物hps-f、hps-r扩增，得到821bp的条带(图5中a)，说明转化子为hps。用引物gm-f、gm-r扩增，得到大约750bp的庆大霉素抗性基因(图5中b)，用引物ompp2-1、ompp2-2扩增缺失的ompp2片段，无扩增条带，以lc株作为对照，pcr扩增反应得到1194bp的条带(图5中c)。用引物ompp2up-f、ompp2down-r扩增，得到1700bp左右的条带，而lc株扩增到大于2000bp的条带(图5中d)。pcr产物电泳图显示已经成功缺失了ompp2基因全长。

hps-f：5’-accagaagcaaacccagagc-3’，

hps-r：5’-acaccgcttgccataccctc-3’，

ompp2-1：5’-atgaaaaaaacactagtagcattagc-3’，

ompp2-2：5’-ttaccataatacacgtaaaccaaca-3’。

序列表中序列11，是用引物ompp2up-f和ompp2down-r扩增ompp2基因缺失株lcδ

ompp2的序列。

7.hps基因缺失株生长时间与od600nm关系的测定

将过夜培养的hpsompp2基因缺失株与野生株lc株按1％的比例转移至10mltsb培养基(含5％血清和0.001％nad)中，37℃180rpm振荡培养，将每小时取出的菌液测定od600nm，确定生长时间与od600nm的关系(图6)，结果发现缺失株生长速度要比野生株慢。

8.hpsompp2基因缺失株的小鼠攻毒试验

挑取2～3个本发明的hps基因缺失株和对照亲本株lc株单克隆，分别密集划线于在tsa培养基上(含5％血清和0.001％nad)培养，调至活菌数为10⁷、10⁸、10⁹cfu/ml后，分别腹腔接种6周龄雌性balb/c小鼠，每组10只，0.2ml/只，对照组相同途径相同剂量注射pbs。一般接毒后12h开始发病，以接毒后7d为一个观察周期，统计各组小鼠的死亡数，按reed-muench氏法计算ld50。表1为统计数据。计算公式为：

lgld50＝距离比×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数

表1小鼠攻毒试验死亡数统计数据

根据公式计算，hps野生株的ld50为10^8.5cfu/ml，hps缺失株的ld50为10^9.09cfu/ml。本发明的hps基因缺失株毒力较野生株下降。

9.hpsompp2基因缺失株在宿主细胞中的应用

9.1hps野生株与缺失株菌液的制备

分别将hpsompp2基因缺失株与野生株lc株密集划线于tsa平板(含5％血清和0.001％nad)，37℃培养12h，分别用无菌的1640培养基冲洗，稀释至活菌数为10⁷cfu/ml。9.2粘附试验

10⁵的猪肺泡巨噬细胞接入24孔板，37℃co2培养箱培养过夜，吸出培养液，无菌pbs冲洗两次，分别接入hpsompp2基因缺失株与野生株lc株，1ml/孔，空细胞对照接入1ml无菌的1640培养基，37℃co2培养箱培养3h，无菌pbs冲洗5次，加入200μl胰酶消化，37℃作用5min，加入800μl冷却的去离子水，刮下细胞，反复吹吸，吸取100μl用去离子水系列稀释，涂板，37℃生长24～48h，试验重复三次。生长出的菌数即为胞内菌数，粘附的细菌数＝总细菌数-胞内菌数。hps野生株lc株粘附的细菌数为1.5×10⁶cfu/ml，hpsompp2基因缺失株粘附的细菌数为1.0×10⁶cfu/ml(图7)。

9.2入侵试验

10⁵的猪肺泡巨噬细胞接入24孔板，37℃co2培养箱培养过夜，吸出培养液，无菌pbs冲洗两次，分别接入hpsompp2基因缺失株与野生株lc株，1ml/孔，空细胞对照接入1ml无菌的1640培养基，37℃co2培养箱培养3h，无菌pbs剧烈冲洗5次，加入培养基(含青霉素g5μg/ml和庆大霉素100μg/ml)，37℃co2培养箱培养3h，杀死细胞外和细胞表面粘附的hps，无菌pbs冲洗三次，加入200μl胰酶消化，37℃作用5min，加入800μl冷却的去离子水，刮下细胞，反复吹吸，吸取100μl用去离子水系列稀释，涂板，37℃生长24～48h，tsa平板上细菌计数，试验重复三次。hps野生株lc株入侵的细菌数为9.2×10⁴cfu/ml，hpsompp2基因缺失株入侵的细菌数为4.0×10⁴cfu/ml(图8)。

通过上述的hpsompp2基因缺失株的小鼠攻毒试验，发现hps基因缺失株毒力较野生株下降，hpsompp2基因缺失株对宿主细胞粘附试验和入侵试验，表明ompp2基因缺失后，hps粘附和入侵宿主细胞的能力显著减弱，说明ompp2基因对hps的毒力有很大的影响。因此，该hpsompp2基因缺失株lcδompp2可以用于hpsompp2基因功能研究及致病机制研究，在研究hps分子机制方面有广阔的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一种副猪嗜血杆菌ompp2基因缺失株及其构建方法和应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>38

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<400>11

ggatccaccgcttgttctctgtattaagcgtatagatattttaatgtatgtacatctctt60

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acatttttagaaaaaaggttataaatctttatttgctatgagttttttatttttaaatca180

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<213>副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis)

<400>12

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