罗汉果单性结实雌株的培育方法与流程

本发明涉及罗汉果单性结实
技术领域：
。更具体地说，本发明涉及一种罗汉果单性结实雌株的培育方法。
背景技术：
：中药材罗汉果(siraitiaefructus)是葫芦科多年生宿根性藤本植物罗汉果(siraitiagrosvenorii)的干燥果实，具有提神生津、清热润肺、止咳定喘、滑肠通便等效用，是我国特有的药用和甜料经济作物，第一、二批均被国家卫生部、中医药管理局列为药食同源品种。现代药理、毒理研究表明，罗汉果具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗氧化、免疫调节、保护肝脏、降低血脂等多种作用，却无毒副作用。罗汉果果实主要有效成份为葫芦烷四环三萜皂苷，以甜苷ⅴ含量最高，约占总皂苷含量的20％，是世界上最强的非糖甜味物质之一，是罗汉果甜苷，万分之一浓度时为5％蔗糖甜度的425倍，高甜、低热、天然、保健，具有广阔的开发前景和市场空间。但是，罗汉果具有雌雄异株的发育生物学特点，且花粉粘重而不利于风媒传粉，野生大黑蜂减少而影响栽培品种的虫媒传粉，所以，栽培生产中，需要大量人工授粉，才能获得经济效益，而自然条件下罗汉果花粉寿命短，通常需要在开花当天上午完成授粉，劳动成本高，因此，罗汉果栽培生产中迫切需要解决“如何免除人工授粉”的难题。此外，罗汉果的种子中不含甜苷而含有大量的油脂，不仅影响口感，又增加了提取纯化的难度以及加工成本。虽然已有三倍体无籽罗汉果研究的报道，但因果实小、生长期短等原因，迄今尚无可应用于生产的三倍体优良品种。因此，如何免除人工授粉和实现果实无籽化，是罗汉果产业化发展中亟待解决的技术难题。单性结实是指子房不经受精而形成无籽果实的现象，与生长素信号、或赤霉素信号途径等有关。单性结实植株体具有结实率高、品质优良、果实无籽、无畸形果、可稳定遗传等优势，是食用、加工和生产中追求的重要目标。除了自然存在的可遗传的单性结实以外，还可以通过激素诱导、转基因技术等获得单性结实。申请号为201410244509.0的发明专利公开了利用激素cppu或2,4-d在罗汉果开花当天对罗汉果的子房壁进行处理，从而诱导罗汉果单性结实的方法，但激素处理技术要求较高，浓度难以控制，容易产生畸形果，需要较多劳动者力，还存在激素残留，影响健康，故生产上不宜推广采用。培育单性结实罗汉果新种质不仅能克服其生产中迫切需要解决的人工授粉的主要难题，也能解决授粉会带来果实有籽的难题，是罗汉果产业化发展和育种的最佳选择和热点前沿。目前，运用基因工程的方法，转入与内源激素代谢或信号转导相关的基因来诱导单性结实，从而获得无籽果实，已经成为植物遗传工程的主要手段，在番茄、茄子、草莓、树莓和甜瓜等物种中获得转基因单性结实植株，例如：iaam基因主要来源于根癌农杆菌和假单孢菌，编码色氨酸单加氧酶，可利用色氨酸合成吲哚乙酸，从而提高生长素含量，将iaam与子房或幼果特异启动子组成的嵌合基因导入植物体中，使用其在开花期和果实发育早期表达，可诱导茄子、番茄等以果实为主要收获对象的植物的单性结实。但目前还没有关于罗汉果转基因单性结实的报道。技术实现要素：本发明有一个目的是提供一种罗汉果单性结实雌株的培育方法，在植物双元表达载体pbi121-gus基础上，构建2a11-iaam的过量表达载体pbi121-2a11-iaam，并通过根癌农杆菌eha105介导，将其整合至罗汉果雌株的基因组中，促进基因iaam在罗汉果雌株中获得表达，从而得到罗汉果的单性结实雌株，为创制转基因单性结实罗汉果雌性种质，深入其遗传生理研究、品种培育等提供基础。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种罗汉果单性结实雌株的培育方法，将嵌合基因2a11-iaam整合至罗汉果雌株的基因组，使基因iaam在罗汉果雌株中获得表达，从而得到罗汉果单性结实雌株。优选的是，所述的罗汉果单性结实雌株的培育方法，以农杆菌介导转化法将嵌合基因2a11-iaam整合至罗汉果雌株的基因组。优选的是，所述的罗汉果单性结实雌株的培育方法，所述农杆菌介导转化法的过程为：在雌株罗汉果的愈伤组织诱导过程中利用已转入植物表达载体pbi121-2a11-iaam的农杆菌进行侵染，并依次经过继代培养、增殖培养、生根培养得到罗汉果雌株幼苗，利用分子检测筛选获得基因iaam表达的罗汉果雌株幼苗，将其炼苗、移栽和鉴定后获得罗汉果单性结实雌株。优选的是，所述的罗汉果单性结实雌株的培育方法，所述农杆菌介导转化法的具体步骤包括：a、雌株罗汉果愈伤组织诱导过程的具体步骤包括：a1、将罗汉果雌株无菌叶片用灭过菌的打孔器打出多个直径为0.5cm的圆片，将圆片的背面和叶脉划伤，并接种至第一诱导培养基上，黑暗条件下预培养4天获得侵染用罗汉果叶盘，所述第一诱导培养基的配方为：ms+tdz0.7mg/l+iba0.5mg/l；a2、将经步骤a1诱导后的侵染用罗汉果叶盘浸泡至已转入pbi121-2a11-iaam的农杆菌菌液中，于28℃下150rpm振荡10min，所述农杆菌菌液的od600为0.3-0.5；a3、将步骤a2得到的罗汉果叶盘接种在第二诱导培养基上，黑暗条件下共培养3天，所述第二诱导培养基的配方为：ms+tdz0.7mg/l+iba0.5mg/l+as100μm；a4、将步骤a3得到的罗汉果叶盘用无菌水清洗、无菌滤纸吸干后接种至第三诱导培养基上，光照条件下选择培养两周得到愈伤组织，所述第三诱导培养基的配方为：ms+tdz0.7mg/l+iba0.5mg/l+kan5mg/l+cef300mg/l；b、继代培养的过程是将步骤a4中愈伤组织用无菌水清洗后接种至分化培养基上，在光照条件下继代培养至分化产生不定芽，所述分化培养基的配方为：ms+tdz0.7mg/l+iba0.5mg/l+ga30.5mg/l+芸苔素内酯0.5mg/l+kan5mg/l+cef100mg/l；c、将已分化产生不定芽的愈伤组织转接至增殖培养基，光照条件下进行增殖培养，所述增殖培养基的配方为：ms+6-ba0.5mg/l+iba0.2mg/l+kan5mg/l+cef100mg/l；d、增殖培养过程中不定芽长至2cm以上时，切下不定芽，并插入生根培养基中，关照条件下进行生根培养至长出不定根，所述生根培养基的配方为：ms+naa0.5mg/l+iba0.2mg/l+kan5mg/l+cef100mg/l。优选的是，所述的罗汉果单性结实雌株的培育方法，光照条件为：光照温度25±1℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d。优选的是，所述的罗汉果单性结实雌株的培育方法，所述农杆菌菌液的制备方法如下：从﹣80℃冰箱取出已转入植物表达载体pbi121-2a11-iaam的农杆菌菌液，在附加kan50μg/ml、rif20μg/ml的yeb固体平板上进行划线，28℃培养48h，然后挑取单菌落，接种到10ml附加kan50μg/ml、rif20μg/ml的yeb液体培养基中，在28℃、200rpm振荡培养48h，得到目的菌菌液，取目的菌菌液1ml加入50ml新配制的无抗生素的yeb液体培养基，同时加入100μm的as，在28℃、200rpm振荡培养6h，使得菌液od600为0.3-0.5。优选的是，所述的罗汉果单性结实雌株的培育方法，包含嵌合基因2a11-iaam的植物表达载体pbi121-2a11-iaam的构建方法为：1)构建中间载体pbi121-2a11：将pmd-2a11质粒和pbi121-gus质粒分别用hindiii和xbai双酶切并分别回收得到线性的pbi121基因片段及2a11基因片段，将上述两个基因片段连接得到中间载体pbi121-2a11；2)构建pbi121-2a11-iaam载体：将pmd-iaam质粒和中间载体pbi121-2a11分别用xbai和xmai双酶切并分别回收得到线性的pbi121-2a11基因片段及iaam基因片段，将上述两个基因片段连接得到pbi121-2a11-iaam载体。优选的是，所述的罗汉果单性结实雌株的培育方法，所述分子检测的具体方法为：采用ctab法微量提取已生出不定根的罗汉果雌株幼苗的茎叶，利用设计出的三套特异引物进行pcr扩增检测，其中所述三套特异引物分别为：针对果实特异启动子2a11序列设计的特异引物对2a11f/r，序列依次为seqidno.1和seqidno.2所示；针对单性结实基因iaam序列设计的特异引物对iaamf/r，序列依次为seqidno.3和seqidno.4所示；同时跨部分目的基因iaam序列和部分启动子2a11序列设计的特异引物对aicf/r，序列依次为seqidno.5和seqidno.6所示。本发明至少包括以下有益效果：1)本发明运用基因工程的方法，使目的基因iaam在罗汉果雌株中获得表达，得到可以不通过人工授粉产生无籽果实的罗汉果雌株，该方法不仅克服了罗汉果实际生产中人工授粉难以及授粉会产生果实有籽的问题，也避免了使用激素诱导罗汉果单性结实容易产生畸形果，存在激素残留的问题，并且该方法获得的罗汉果单性结实雌株具有较高的结实率，且果实品质优良，该单性结实形状可稳定遗传；2)2a11启动子是来源于番茄的果实特异性表达启动子，具有良好的驱动外源基因组织特异性表达的启动子活性，本发明通过将2a11与目的基因iaam连接，促使iaam基因在罗汉果中获得更好的表达，从而培育罗汉果单性结实雌株；3)本发明利用叶盘转化法，以农杆菌为介导，将嵌合基因2a11-iaam整合至罗汉果雌株中，使基因iaam在罗汉果雌株中获得表达，该方法经典、转化效率高，相对其他方法，如，相比于基因枪转化法，对设备要求更简单、便宜、利于操作。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本发明的实施例2中载体构建的中间载体pbi121-2a11图谱；图2为本发明的实施例2中pbi121-gus和2a11质粒双酶切后的电泳图；图3为本发明的实施例2中pbi121-gus与2a11重组质粒的pcr检测产物电泳图；图4为本发明的实施例2中pbi121-2a11-iaam图谱；图5为15个转2a11-iaam基因抗性芽dna提取结果图；图6为特异引物对2a11f/r对15个pbi121-2a11-iaam抗性植株的检测结果图；图7为特异引物对iaamf/r对15个pbi121-2a11-iaam抗性植株的检测结果图；图8为特异引物对aicf/r对15个pbi121-2a11-iaam抗性植株的检测结果图。具体实施方式下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明涉及的试剂和材料中，tdz噻苯隆、iba吲哚丁酸、as乙酰丁香酮、ga3赤霉素、naa萘乙酸、6-ba6-苄氨基腺嘌呤、kan卡纳霉素、rif利福平、cef头孢霉素。实施例1：一种罗汉果单性结实雌株的培育方法，将嵌合基因2a11-iaam整合至罗汉果雌株的基因组，使基因iaam在罗汉果雌株中获得表达，从而得到罗汉果单性结实雌株。在本实施例中，将植物过量表达载体pbi121-2a11-iaam中嵌合基因2a11-iaam整合至罗汉果雌株的基因组，可以通过基因枪实现。实施例2：一种罗汉果单性结实雌株的培育方法，将嵌合基因2a11-iaam整合至罗汉果雌株的基因组，使基因iaam在罗汉果雌株中获得表达，从而得到罗汉果单性结实雌株。在本实施例中，将嵌合基因2a11-iaam整合至罗汉果雌株的基因组，是以农杆菌介导转化法将植物表达载体pbi121-2a11-iaam整合至罗汉果雌株的基因组实现。所述农杆菌介导转化法的过程为：在雌株罗汉果的愈伤组织诱导过程中利用已转入植物表达载体pbi121-2a11-iaam的农杆菌进行侵染，并依次经过继代培养、增殖培养、生根培养得到罗汉果雌株幼苗，利用分子检测筛选获得基因iaam表达的罗汉果雌株幼苗，将其炼苗、移栽和鉴定后获得罗汉果单性结实雌株。其中，所述农杆菌介导转化法的具体步骤包括：a、雌株罗汉果愈伤组织诱导过程的具体步骤包括：a1、将罗汉果雌株无菌叶片用灭过菌的打孔器打出多个直径为0.5cm的圆片，将圆片的背面和叶脉划伤，并接种至第一诱导培养基上，黑暗条件下预培养4天获得侵染用罗汉果叶盘，所述第一诱导培养基的配方为：ms+tdz0.7mg/l+iba0.5mg/l；需要说明的是，步骤a1使用的罗汉果雌株的获得方法如下：取种植于广西药用植物园实验基地的已开花的罗汉果雌株，选取幼嫩带有腋芽的罗汉果茎段，用75％酒精消毒30s，0.1％hgcl2消毒10min，无菌蒸馏水冲洗5次，之后用无菌滤纸吸干茎段表面水分，并将茎段接种于ms培养基中，置于恒温光照培养箱进行组织培养，设置温度为25±1℃，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，由此获得。a2、将经步骤a1诱导后的侵染用罗汉果叶盘浸泡至已转入植物表达载体pbi121-2a11-iaam的农杆菌菌液中，于28℃下150rpm振荡10min，所述农杆菌菌液的od600为0.3-0.5；a3、将步骤a2得到的罗汉果叶盘接种在第二诱导培养基上，黑暗条件下共培养3天，所述第二诱导培养基的配方为：ms+tdz0.7mg/l+iba0.5mg/l+as100μm；a4、将步骤a3得到的罗汉果叶盘用无菌水清洗、无菌滤纸吸干后接种至第三诱导培养基上，光照条件下选择培养两周得到愈伤组织，所述第三诱导培养基的配方为：ms+tdz0.7mg/l+iba0.5mg/l+kan5mg/l+cef300mg/l；b、继代培养的过程是将步骤a4中愈伤组织用无菌水清洗后接种至分化培养基上，在光照条件下继代培养至分化产生不定芽，所述分化培养基的配方为：ms+tdz0.7mg/l+iba0.5mg/l+ga30.5mg/l+芸苔素内酯0.5mg/l+kan5mg/l+cef100mg/l；c、将已分化产生不定芽的愈伤组织转接至增殖培养基，光照条件下进行增殖培养，所述增殖培养基的配方为：ms+6-ba0.5mg/l+iba0.2mg/l+kan5mg/l+cef100mg/l；d、增殖培养过程中不定芽长至2cm以上时，切下不定芽，并插入生根培养基中，关照条件下进行生根培养至长出不定根，所述生根培养基的配方为：ms+naa0.5mg/l+iba0.2mg/l+kan5mg/l+cef100mg/l。其中，愈伤组织诱导培养过程、继代培养过程、增殖培养过程以及生根培养过程中，光照条件为：光照温度25±1℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d。其中，所述农杆菌菌液的制备方法如下：从﹣80℃冰箱取出已转入pbi121-2a11-iaam的农杆菌菌液，在附加kan50μg/ml、rif20μg/ml的yeb固体平板上进行划线，28℃培养48h，然后挑取单菌落，接种到10ml附加kan50μg/ml、rif20μg/ml的yeb液体培养基中，在28℃、200rpm振荡培养48h，得到目的菌菌液，取目的菌菌液1ml加入50ml新配制的无抗生素的yeb液体培养基，同时加入100μm的as，在28℃、200rpm振荡培养6h，使得菌液od600为0.3-0.5。其中，pbi121-2a11-iaam的构建方法为：1)构建中间载体pbi121-2a11：将pmd-2a11质粒和pbi121-gus质粒分别经hindiii和xbai双酶切并分别回收得到线性的pbi121基因片段及2a11基因片段，将上述两个基因片段连接得到中间载体pbi121-2a11；2)构建pbi121-2a11-iaam载体：将pmd-iaam质粒和中间载体pbi121-2a11分别经xba和xmai双酶切并分别回收得到线性的pbi121-2a11基因片段及iaam基因片段，将上述两个基因片段连接得到pbi121-2a11-iaam载体。植物表达载体pbi121-2a11-iaam的构建过程具体方法如下：1)载体和目的片段质粒提取将保存于-80℃冰箱的pbi121-gus菌液接种到含kan50μg/ml的lb液体培养基中，37℃恒温，200rpm过夜振荡培养。用无菌接种环在超净工作台挑取上述菌液，并于含kan50μg/ml的lb固体培养基上划线培养得出单菌落。用无菌枪头挑取单菌落进行扩大培养。pmd-2a11和pmd-iaam菌液的扩大培养方法同上，其中lb培养基中加入的抗生素和抗生素浓度为amp50μg/ml。按照sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒(sangon)说明书对上述扩大培养后的菌液进行质粒抽提，并取3μl质粒dna样品用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，观察质粒dna提取的质量及完整性，用超微量紫外分光光度计测定dna的浓度及纯度。2)pbi121-gus与2a11的连接由于iaam基因序列内含hindⅲ限制性酶切位点，所以载体构建中，先连接启动子2a11，再连接目的基因iaam。pmd-2a11质粒和pbi121-gus质粒双酶切反应使用xbai和hindⅲ限制性内切酶，反应条件为37℃2h，酶切反应体系见表1。将上述酶切反应产物分别进行切胶回收目的片段和载体片段，并检测回收片段的质量和浓度。配制连接反应体系：10×t4dnaligasebuffer2.5μl，目的基因4.5μl，载体1.5μl，t4dnaligase(350u/μl)1.5μl，加水至总体积20μl，16℃水浴连接过夜。将连接产物转化dh5α感受态细胞，常规涂板于含有iptg、x-gal和的kan(50μg/ml)的lb固体平板培养基上(按《分子克隆》中相应说明操作)，培养过夜，随机挑取转化平板的白色单菌落于加有kan50μg/ml的lb液体培养基上中，37℃恒温，200r/min摇床培养过夜；通过菌液pcr鉴定阳性克隆，将阳性克隆的菌斑提取质粒，酶切检测再次确定阳性克隆菌斑，得到具有目的基因的中间表达载体pbi121-2a11。表1pmd-2a11和pbi121-gus质粒双酶切反应体系选择hindiii和xbai分别对pbi121-gus和pmd-2a11进行酶切，分别切去pbi121-gus的camv35s启动子回收大片段线性化植物双元表达载体，切去pmdt载体回收小片段2a11，将2a11连接进pbi121-gus载体后的图谱见图1。其中，2a11质粒的双酶切结果得出1300bp左右的目的片段和2700bp左右的pmd19tsimplevector片段见图2，其中图2中m表示dl15000dnamarker；1-6为pbi121-gus的双酶切；7为2a11质粒对照；8-9为2a11双酶切。将2a11与线性化pbi121-gus连接后，转化感受态大肠杆菌dh5α，涂板，在蓝白筛选平板上挑取8个菌斑，经过pcr检测产物的电泳见图3，其中图3中m表示dl2000dnamarker；1-8表示重组质粒菌斑，这8个菌斑全为阳性，选择1，2，3号菌斑做双酶切验证，结果均为阳性。3)iaam和中间载体pbi121-2a11的连接pmd-iaam质粒和pbi121-2a11质粒双酶切反应使用xbai和xmai限制性内切酶，反应温度条件为37℃，反应体系见表2，连接方法同步骤2)。得到嵌合表达载体pbi121-2a11-iaam。设计引物对(跨启动子和目的基因全长)ai1f和ai1r，用于后续pcr检测。采用ai1f(见表3序列编号seqidno.7)和ai1r(见表3序列编号seqidno.8)引物对一次性扩增出包含2a11和iaam基因的序列，做t克隆，送去华大基因测序公司测序，测序所得序列在genbank数据库进行blast比对、分析，证实无误后用于后续实验。表2pmd-iaam和pbi-2a11质粒双酶切反应体系iaam基因与中间载体pbi121-2a11连接转化后挑取8个菌斑，经过pcr检测和双酶切验证得出2个阳性菌斑。测序所得序列在genbank数据库进行blast比对，结果显示启动子片段2a11基因序列和目标基因片段iaam基因序列与已报道的2a11和iaam基因序列，同源性都为99％，可编码相应蛋白序列。最终构建好的植物表达载体pbi121-2a11-iaam图谱见图4。为了说明本发明的农杆菌介导法转化过程中，罗汉果叶盘对抗生素kan的敏感性、对抗生素cef的抑菌性以及农杆菌侵染菌液的浓度和时间影响，发明人做了下述试验以此确立了实施例2中用农杆菌介导转化法将目的基因转入罗汉果雌株中的进行组织培养的相关参数。具体实验方法如下：一、抗生素kan敏感性试验分别配制含有不同浓度kan(0、2、4、6、8、10、13、16、20、30mg/l)的愈伤组织诱导培养基，将预培养4d的罗汉果叶盘进行接种，每个试验接种8瓶，每瓶接种10个叶盘。置于恒温光照培养箱，设置培养条件为：温度25±1℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d，培养25d后记录叶盘生长情况。罗汉果叶盘对抗生素kan的敏感性试验结果如表4，可见，罗汉果叶盘的持绿率和出芽率随着kan浓度的增加而降低，同时芽的分化和生长也随之缓慢直至停止萎蔫。罗汉果叶盘的持绿率自kan浓度高于4mg/l起开始下降，而出芽率在kan浓度低于6mg/l时均维持在较高水平，过高的kan浓度会影响转化细胞的正常生长分化，浓度过低又难以起到筛选作用，由此可判断，罗汉果叶盘分化出芽过程对抗生素kan的选择为5mg/l。表4罗汉果叶盘对抗生素kan的敏感性试验二、抗生素cef抑菌试验分别配制含有不同浓度cef(0、50、100、200、300、400、500mg/l)的愈伤组织诱导培养基，将经过相同预培养和共培养操作的罗汉果叶盘用无菌水清洗以后进行接种，每个试验接种8瓶，每瓶接种10个叶盘。置于恒温光照培养箱，设置培养条件为：温度25±1℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d，培养两周后记录叶盘生长情况。由表5可知，罗汉果叶盘的污染率和出芽率随着cef浓度的增加而降低，且cef的浓度为300～500mg/l时，污染率为0，抑菌效果最佳，同时在此浓度范围内，cef浓度为300mg/l时，罗汉果叶盘的出芽率相对较高。过低的cef浓度难以抑菌，过高的cef浓度又会抑制出芽，由此可判断，抗生素cef抑制罗汉果叶盘感染农杆菌的最佳浓度为300mg/l。表5抗生素cef对农杆菌的抑制试验三、农杆菌侵染菌液浓度的确立取3ml振荡培养后的农杆菌菌液，于紫外分光光度计下测定od600值，并稀释为不同od600(0.1、0.3、0.5、0.7)的菌液，分别对预培养4d的罗汉果叶盘进行相同时间的侵染，将侵染后的叶盘接种至愈伤组织诱导培养基(含100μmas)，每个试验接种3瓶，每瓶接种20个叶盘。置于黑暗条件下共培养3d后，进行选择培养，设置培养条件为：温度25±1℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d，培养两周后记录叶盘生长情况。由表6可知，罗汉果叶盘的污染率随着农杆菌菌液浓度的增加而升高，同时罗汉果叶盘的出芽率随着农杆菌菌液浓度的增加而降低。过高的农杆菌菌液浓度(od600＝0.7)，会导致罗汉果叶盘污染严重，不能分化出芽；过低的农杆菌菌液浓度(od600＝0.1)，则会影响转化的效率。由此可判断，农杆菌用于侵染时的菌液od600值最好为0.3～0.5。表6农杆菌菌液浓度对出芽率的影响四、农杆菌侵染时间的确立用相同浓度的农杆菌菌液对预培养4d的罗汉果叶盘进行侵染，侵染时间分别为5min、10min、15min、20min、25min，将侵染后的叶盘接种至愈伤组织诱导培养基(含100μmas)，每个试验接种3瓶，每瓶接种20个叶盘。置于黑暗条件下共培养3d后，进行选择培养，设置培养条件为：温度25±1℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d，培养两周后记录叶盘生长情况。由表7可知，罗汉果叶盘的污染率随农杆菌侵染时间的增加而升高，同时罗汉果叶盘的出芽率随农杆菌侵染时间的增加而降低。当农杆菌侵染时间超过15min，会导致罗汉果叶盘污染严重，不能分化出芽；而农杆菌侵染时间过短，又会影响遗传转化的效率。由此可判断，农杆菌用于侵染时的最佳时间为10min。表7农杆菌侵染时间对罗汉果叶盘的影响发明人通过实施例2的方法获得了15个抗性芽，发明人通过以下试验鉴定获得的抗性芽转入了植物表达载体pbi121-2a11-iaam，具体实验步骤如下：通过实施例2得到的15个抗性芽转接至生根培养基培养30d后，采用ctab法微量提取已生出不定根的罗汉果雌株幼苗的茎叶，经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，结果如图5所示，其中m表示dl5000marker、1-15表示为植株编号。利用设计出的三套特异引物进行pcr扩增检测，pcr扩增反应体系为：0.5μldna，5μl2×estaqmastermix，0.4μl引物f/r，加水至总体系10μl。pcr扩增反应条件为：94℃4min；94℃30s，55～60℃30s，72℃1min，进行30个循环；72℃8～10min；4℃保存。pcr产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，并在凝胶成像系统中成像。其中所述三套特异引物见表3，分别为：针对果实特异启动子2a11序列设计的特异引物对2a11f/r，序列编号依次为seqidno.1和seqidno.2所示；针对单性结实基因iaam序列设计的特异引物对iaamf/r，序列编号依次为seqidno.3和seqidno.4所示；同时跨部分目的基因iaam序列和部分启动子序列2a11序列设计的特异引物对aicf/r，序列编号依次为seqidno.5和seqidno.6所示。表3本实施例中用到的所有引物引物名称序列(5'-3')序列编号2a11fgaaagagattatgaaggcgseqidno.12a11rtagatgtaagcggagagggseqidno.2iaamfcttacgagaaaggcacgacseqidno.3iaamrtagatgctgggcaaacgseqidno.4aicfaacactttcccttaaacatcseqidno.5aicratttccttgccaacatagseqidno.6ai1fggctttacactttatgcttccgseqidno.7ai1rcacttcctgattattgacccacaseqidno.8根据表3中特异引物进行pcr检测扩增目的片段，经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，从图6-8中综合三套特异引物的检测结果，结果显示共有4株转化植株扩增出目的条带。其中，图6为特异引物对2a11f/r检测结果图，图7为特异引物对iaamf/r检测结果图，图8为特异引物对aicf/r检测结果图。图6-8中，m表示dl2000marker，1-15表示植株编号。将经过pcr检测呈阳性的4株拟转基因植株进行批量扩繁，生根之后转移至大田炼苗5～7天，再转移至营养钵中生长20天左右，使得组培苗充分适应外界环境条件，之后移栽大田，后续观察得出，拟转基因植株在营养生长时期长势良好，叶色鲜绿，叶型正常。开花期植株可正常开花，开花植株子房膨大，挂果期植株子房未经授粉即发育成小果，表现单性结实性状。为了充分支持说明本发明的嵌合基因2a11-iaam的来源，发明人获得启动子2a11和目的基因iaam的克隆方法如下；①果实特异启动子2a11，是在参考ncbi公开的番茄2a11启动子序列genbankaccessionno.m87659信息的基础上，设计如表8引物对hxra1f/hxra1r，从樱桃番茄总dna中克隆得到的。引物对hxra1f/r的序列依次为seqidno.9和seqidno.10，参考ncbi公开的番茄2a11启动子序列克隆得到的2a11启动子序列为seqidno.11；hxra1f/r的具体序列和反应条件见表8。表8引物对hxra1f/hxra1r和反应条件②目的iaam，是在参考ncbi公开的c58中iaam的cds序列(genbankid:af126446.1)的基础上，设计引物对xxmif/xxmir(序列依次为seqidno.12和seqidno.13)和反应条件见表9，从根癌农杆菌c58菌株中克隆得到目的iaam的序列为seqidno.14。表9引物对xxmif/xxmir和反应条件③启动子2a11和目的基因iaam的克隆测序过程如下：a、总dna的提取番茄dna的提取：取樱桃番茄嫩叶，使用植物基因组dna提取试剂盒，提取总dna。细菌培养：将保存于-80℃的根癌农杆菌c58菌株按1％的比例接种到10ml含rif20μg/ml的yeb液体培养基中，28℃恒温暗培养箱中过夜培养。用接种环在无菌条件下分别挑取菌液在含rif20μg/ml的lb固体培养基上划线培养得出单菌落。再用接种针挑取单菌落进行扩大培养。细菌基因组dna的提取：按照细菌基因组dna提取试剂盒说明书，对根癌农杆菌c58进行基因组总dna提取，最后用30μlte缓冲液溶解dna。用1×tae缓冲液配制1.0％琼脂糖凝胶，分别取5μl所提取的dna样品进行电泳，检验总dna的完整性，用核酸测定仪测定dna的浓度及纯度，保存于-20℃冰箱备用。b、目的片段的pcr扩增根据iaam的nucleotide序列信息设计合成5'端加有限制性核酸内切酶xbai、xmai酶切位点的特异性引物对xxmif/xxmir。pcr反应体系为：取1μldna模板，上游引物(10μmol/l)、下游引物(10μmol/l)各1.0μl，2.5μl10×extaqbuffer(mg2+plus)，0.5μltakaraextaq(5u/μl)，dntpmixture(2.5mmol/l)，补充ddh2o(rnase-free)至25μl。iaam基因的pcr扩增程序:预变性94℃3min；94℃30s，56.5℃30s，72℃40s，30cycles；72℃8min终延伸，10℃保存。pcr扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶跑胶检测，观察扩增产物的完整性。2a11克隆所用反应体系及条件参考iaam，但反应体系中模板为番茄总dna，引物对为hxra1f/hxra1r,反应条件中，退火温度为55.3℃，其它条件与iaam的相同。c、目的片段的t克隆及测序分别将上述所得的pcr产物多管合并后，取100μl样品用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，使用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒按照说明书进行目的片段纯化回收。取5μl回收所得dna片段用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测。将pcr回收产物分别与pmd19-tsimplevector连接，连接体系为：4μliaam基因目的片段、1μlpmd19-tsimplevector(50ng/μl)和5μlsolutioni，16℃水浴过夜连接。大肠杆菌dh5α感受态细胞的制备：1.预培养：从lb固体平板上挑取dh5α的单菌落接种至10mllb液体培养基中，37℃，200r/min振荡过夜培养；2.吸取0.5ml培养液接种至50mllb液体培养基中进行扩大培养。3.将菌液转移至50ml的无菌离心管中，冰浴10min；4.4℃条件下，6,000r/min离心5min，弃上清液，回收菌液5.向菌体添加50ml预冷好的0.1mol/lcacl2-mgcl2溶液，轻吹使菌体悬浮。6.4℃条件下，6,000r/min离心5min，弃上清液；7.用1.2ml冰冷的0.1mcacl2轻吹使菌体悬浮，置于冰上操作；8.分装细胞，每份100μl，即为感受态细胞，保存于-80℃备用。连接转化：1.将10μl连接产物加入到100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌均匀，冰中放置30min；2.42℃水浴热激60s，然后冰浴90s；3.加入500μllb液体培养基，37℃，200r/min，振荡培养45min；4.将菌体均匀涂布在含有amp/x-gal/iptg(100mg/l:24mg/l:20mg/l)的蓝白斑筛选培养基上，37℃过夜培养；将前述连接产物通过dh5α感受态细胞转化后挑取12个白色单菌落进行液体培养，12h后取1μl菌液作为模板，用相应的引物组合进行pcr检测，pcr扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶跑胶检测。挑取3个经过pcr鉴定为阳性重组质粒的菌株进行扩大培养，参考《分子克隆指南》(黄培堂，2002)，采用sds碱裂解法制备质粒dna，检测质粒浓度并进一步采用限制性内切酶xbai和xmai分别做双酶切验证，双酶切反应体系见表10，体系混匀后37℃反应1-2h，在1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测，酶切检测再次确定阳性克隆菌斑，最终得到pmd-iaam克隆子大肠杆菌菌液，将阳性克隆菌斑送华大基因有限公司测序，测序所得序列在genbank数据库进行blast比对、分析。表10pmd-iaam质粒的双酶切反应体系尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。sequencelisting<110>广西壮族自治区药用植物园<120>罗汉果单性结实雌株的培育方法<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1gaaagagattatgaaggcg19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2tagatgtaagcggagaggg19<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3cttacgagaaaggcacgac19<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列<400>4tagatgctgggcaaacg17<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5aacactttcccttaaacatc20<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<400>6atttccttgccaacatag18<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7ggctttacactttatgcttccg22<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8cacttcctgattattgacccaca23<210>9<211>32<212>dna<213>人工序列<400>9aagcttagccctttaaaaagtatagtcaatat32<210>10<211>32<212>dna<213>人工序列<400>10tctagattttggattaattgctaattgatgag32<210>11<211>1381<212>dna<213>人工序列<400>11aagcttagccctttaaaaagtatagtcaatatttacggtgaccgtgaatttcttaattat60gatatataatttaaaagaaatcatgatcacattctactgatgagaacatgtgctaatcaa120gggaaaacatggatgtgaaaaatactttttgttaaaagtaaaaaaaaatgtgaaattttg180ttagttatttactacctatacattatttgagcatgtgcaaactttacaaatacctaatag240aagattttcacctgcctgtatatatgtaaattaattataatgaacactctcacataaaat300aattatcagtatatacattaatacttgccctccacaatgaattaaataaaatgtagaaca360tgatctacacttcaataaaactaagaccataaagaataatttcaaaatatacacatgtca420acaataaattatttgcatattatattaacttactaaacaatctttacttttgaaatataa480aaataatcaagttataagtctgctcaaagtaaagcacttgttagactcatctgattttga540gaaggtaagcaaattgatggtgcataatagtcacaagtaaaatataaaatagatttcatt600agtaaaattgttttttactttctttatatataattatcaatatccttcaatggtaggtta660attatattgttaacttcttgttgaattaaagcaataagacaagaatattaaagataaaag720aacaataaaaatagaaagactaagagataagagttttcttattcttctttcaataagtat780catcaagtgtatacaatataaatttttgtatttttgatctatctatttataatgttatat840ataagcatacaaaagatcagtcataaatatgaccttaatcatgaaaataatgaaagagat900tatgaaggcgtaaggttactagaataatagtcattaaaaaaaggggttatctttataatt960gaataattgatgaagtaatggagataattagtgagcataaatttttttaaaaaaatggac1020atttacactataatattttataacactttcccttaaacatctaggtataaataatgagtc1080ttgtcaaaatcttagtaggaaaaattctgtgaaatttttttagtgaaaacaaatgatata1140aatatcttgaatactcattatttgttgtctcattaaaaatcttatctgacctataaaata1200aattatttgctcaactcaaaatagtttttcattctaaaattagtataattattagtgaat1260atttaattaacataattgtatactaaggggcctataaattggattcttctcaaagaaaaa1320taaaatcaccacacaactttcttcttctgctcatcaattagcaattaatccaaaatctag1380a1381<210>12<211>38<212>dna<213>人工序列<400>12tctagaatgtcagcttcagctctccttgataaccagtg38<210>13<211>37<212>dna<213>人工序列<400>13cccgggttaatttctattgcggtagttatatctcttc37<210>14<211>2280<212>dna<213>人工序列<400>14tctagaatgtcagcttcagctctccttgataaccagtgcgatcatttctctaccaaaatg60gtggatctgataatggtcgataaggctgatgaattggaccgcagggtttccgatgccttc120tcagaacgtgaagcttctaggggaaggaggattactcaaatctccggcgagtgcagcgct180gggttagcttgcaaaaggctggccgacggtcgctttcccgagatctcagctggtgagaag240gtagcagccctctccgcttacatctatgttggcaaggaaattctggggcggatacttgaa300tcggaaccttgggcgcgagcaagagtgagtggtctcgttgccatcgaccttgcaccattt360tgtatggatttctccgaagcacaacttctccaaaccctgtttttgctgagcggtaaaaga420tgtgcatccagcgatcttagtcatttcgtggccatttcaatctctaagactgcccgctcc480cgaaccctgcaaatgccgccttacgagaaaggcacgacgaaacgcgttaccgggtttacc540ctgacccttgaagaggccgtaccatttgacatggtagcttatggtcgaaacctgatgctg600aaggcttcggcaggttcctttccaacaattgacttgctctatgactacagatcgtttttt660gaccaatgttccgatagtggacggatcggcttctttccggaagatgttcctaagccaaaa720gtggcgatcattggcgctggcatttccggactcgtggtggcaagcgaactgcttcatgct780ggtgtagacgatgttacaatatatgaagcaagtgatcgggttggaggcaagctttggtca840catgctttcaaggacgctcccagcgtggtggccgaaatgggggcgatgcgatttcctcct900gctgcatcgtgcttgtttttcttcctcgagcggtacggcctgtcttcgatgaggtcgttc960ccaaatctcggcacagtcgacactaacttggtctaccaaggcctccgatacatgtggaaa1020gccgggcagcagccaccgaagctgttccatcgcgtttacagcggttggcgtgcgttcttg1080aaggacggtttccatgagggagatattgtgttggcttcgcctgttgctattactcaagcc1140ttgaaatcaggagacattaggcgggctcatgactcctggcaaacttggctgaaccgtttc1200gggagggagtccttctcttcagcgatagagaggatctttctgggcacgcatcctcctggt1260ggtgaaacatggagtttccctcatgattgggacctattcaagctaatgggaataggatct1320ggcgggtttggtccagtttttgaaagcgggtttattgagatccttcgcttggtcataaac1380ggatatgaagaaaatcagcggatgtgctctgaaggaatctcagaacttccacgtcgaata1440gccactcaagtggttaacggtgtgtctgtaagccagcgtatacgccatgttcaagtcagg1500gcgattgagaaagaaaagacaaaaataaagataaggcttaagagcgggatatctgaactt1560tatgataaggtggtggttacatctggactcgcaaatatccaactcaggcattgtctgaca1620tgcgataccaccatttttcgtgcaccagtgaaccaagcggttgataacagccatatgaca1680ggctcgtcaaaactcttcctgctgactgaacgaaaattttggttagaccatatcctcccg1740tcctgtgtcctcatggacgggatcgcaaaagcagtgtactgcctggactatgagccgcag1800gatccgaatggtaaaggtctggtgctcatcagttatacatgggaggacgactcccacaag1860ctgttggcggttcccgacaaaaaagagcgattctgtctgctgcgggacgcaatttcgaga1920tctttcccggcgtttgcccagcatctagttcccgcctgcgctgattacgaccaaaatgtt1980gttcaacatgattggcttacagacgagaatgccgggggagctttcaaactcaaccggcgt2040ggcgaggatttttattctgaagaacttttctttcaagcgctggacatgactaatgatacc2100ggagtttacttggcgggttgcagttgttccttcaccggtggatgggtggagggcgctatt2160cagaccgcgtgtaacgccgtctgtgcaattatccacaattgtggaggtattttggcaaag2220gacaatcctctcgaacactcttggaagagatataactaccgcaatagaaattaacccggg2280当前第1页12