一种骆驼源性成分定量检测的双重数字PCR方法与流程

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种对骆驼源性成分进行定量检测的双重数字pcr方法。

背景技术：

2013年初席卷欧洲的“马肉风波”将食品中动物源性成分掺假推向了风口浪尖，经济利益驱动的食品掺假(economicallymotivatedadulteration,ema)成为了全球共同面临的食品安全热点问题。肉制食品中含有配料表无标识的肉类成分，成为ema最为主要的类型之一。“马肉风波”中法国、德国、意大利等欧盟16个国家的牛肉产品都含有未经标识的马肉成分。南非官方调查发现一些牛、羊肉制品中包括水牛肉、驴肉，甚至袋鼠肉、长颈鹿肉、斑马肉等。我国在查处“问题羊肉”时也发现掺假羊肉涉及骆驼、狐狸、水貂、老鼠等动物肉。

骆驼是大型养殖动物，单匹骆驼的产肉量十分可观。除用于货物运输以外，骆驼在世界各地都是常见的肉食动物。骆驼肉的风味、质地、色泽与牛肉相近，国内外均发生过屠宰的养殖骆驼或猎杀的野生骆驼伪充牛肉进入食品消费领域的案例。尤其是非洲野生骆驼遭猎杀后，以走私途径非法进入我国，以极低的价格冒充进口牛肉，被不明真相的食品企业作为加工原料采购，对消费者造成极大的食用安全隐患。此外，骆驼屠宰后剩余的骨、肉、头、内脏等部分也存在非法流向高蛋白饲料加工行业的潜在可能。

为保障食品和饲料安全，维护公平合法贸易，需建立食品和饲料中骆驼源性成分的定量测定方法，对肉制食品和饲料中的骆驼源性成分进行精准检测，为执法监管和相关行业自律提供准确可靠的技术依据。

目前，食品和饲料中骆驼源性成分检测局限于实时荧光pcr、普通pcr、琼脂糖凝胶电泳等分子生物学检测技术，未见能够满足行业需要的定量检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对以上要解决的缺点与不足，提供一种骆驼源性成分定量检测的双重数字pcr方法，通过同时检测骆驼和高等动物源性成分基因组单拷贝的双重数字pcr方法，可对肉制食品和/或饲料中的骆驼源性成分占总肉源性成分的拷贝数比例进行相对定量。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种骆驼源性成分定量检测的双重数字pcr方法，其采用双通道检测法，利用数字pcr系统同时探测骆驼特异性物种基因和高等动物特异性基因两种荧光信号，将骆驼特异性物种基因和高等动物特异性基因序列检测的探针分别标记为fam和vic，通过在同一pcr反应体系中测得的骆驼特异性物种基因和高等动物特异性基因序列的拷贝数，计算得到骆驼源性成分占高等动物源性成分的相对含量。

优选地，本发明的方法包括以下步骤：

(1)提取含有骆驼源性成分的肉制品的动物组织基因组dna；

(2)配制数字pcr反应体系；

(3)进行数字pcr反应；

(4)读取和分析数字pcr反应结果；

(5)计算所述骆驼源性成分占总肉成分的相对含量

骆驼源性成分占总肉成分的相对含量

其中a为骆驼特异性基因拷贝数浓度，b为高等动物特异性基因拷贝数浓度；

优选地，所述数字pcr反应包括但不限于微滴数字pcr反应和芯片数字pcr反应。

优选地，所述步骤(1)中，采用试剂盒法提取肉制品(例如食品和饲料)中的动物组织基因组dna。

优选地，所述试剂盒包括但不限于动物组织基因组dna提取试剂盒(kuraboquickgenedna提取试剂盒dt-s)、wizardgenomicdnapurificationkit(promega，a1120)、pss核酸自动提取仪等dna提取方法。

优选地，所述步骤(2)中，当数字pcr反应为微滴数字pcr反应时，所述微滴数字pcr反应体系为20μl，各组分如下：2×ddpcr^tm预混液10μl；浓度为10μmol/μl的引物各0.8μl，浓度为10μmol/μl的探针各0.4μl，dna模板2μl，补水至20μl。分别将20μl的反应体系和70μl微滴生成油加入微滴生成卡槽中，盖上胶垫后放入微滴生成仪中进行微滴生成，待微滴生成结束后用单通道电动移液枪将生成的微滴全部转移至96孔板中，封膜后置于热循环仪中进行pcr反应。

更优选地，所述步骤(3)中，所述微滴数字pcr反应条件为：95℃，5min，1℃/s；94℃，15s，1℃/s，60℃，1min，1℃/s，共49个循环；98℃，10min，1℃/s；12℃保存反应产物。

更优选地，所述步骤(4)中，所述微滴数字pcr数据读取如下：扩增结束后将96孔板置于微滴分析仪中读取荧光信号，并用quantasoftv1.3.2软件分析实验数据。

优选地，所述步骤(2)中，当数字pcr反应为芯片数字pcr反应时，所述芯片数字pcr反应体系为15μl，各组分如下：预混液7.5μl；浓度为10μmol/μl的引物各0.6μl，浓度为10μmol/μl的探针各0.3μl，dna模板1.5μl，补水至15μl；将配制好的15μl反应体系通过芯片装载仪自动加载到芯片上的微孔中，体系加载完成后立即使用封油注射器将封油覆盖于芯片表面并将芯片密封，密封后的芯片放置于pcr系统上进行扩增。

更优选地，所述步骤(3)中，所述芯片数字pcr反应条件为：96℃，10min；60℃，2min，98℃，30s，49个循环；60℃，2min；10℃保存反应产物。

更优选地，所述步骤(4)中，所述芯片数字pcr数据读取如下：扩增结束后，待芯片恢复至室温，将芯片置于芯片分析仪中读取并初步分析芯片结果，再经由quantstudio^tm3danalysissuitetmcloudsoftware二次分析实验数据。

更优选地，所述骆驼特异性基因是骆驼egf样结构域1的心脏发育蛋白基因。

更优选地，所述骆驼特异性基因的引物和探针的核苷酸序列如下：

骆驼特异性基因-f：catccacagcagtccacacc(seqidno.1)

骆驼特异性基因-r：ggtagaagatgtaggtggaaggac(seqidno.2)

骆驼特异性基因-p：fam-ccagcctcttcaccagtatccctgaca-bhq1(seqidno.3)。

更优选地，所述高等动物特异性基因是高等动物肌肉生长抑制基因。

更优选地，所述高等动物特异性基因的引物和探针的核苷酸序列如下：

高等动物特异性基因-f：ttgtgcaaatcctgagactcat(seqidno.4)

高等动物特异性基因-r：ataccagtgcctgggttcat(seqidno.5)

高等动物特异性基因-p：vic-cccatgaaagaaaggtatactgcggtac-bhq1(seqidno.6)。

骆驼属于哺乳纲偶蹄目骆驼科骆驼属(camelus)的动物，包括单峰驼(c.dromedarins)和双峰驼(c.bactrianus)两个种。经实际检验证明，本发明设计的骆驼特异性引物探针能够检测单峰驼和双峰驼。

上文所述高等动物特异性基因能够有效检出27种高等动物成分，分别为猪、黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴、狐、貉、果子狸、骆驼、猫、貂、鹿、狗、兔、狍、鼠、鸡、鸭、鹅、家鸽、鹌鹑、火鸡、非洲鸵鸟、鹧鸪。

数字pcr(digitalpcr，dpcr)是一种基于单分子扩增的核酸检测技术。通过将常规的pcr反应体系通过不同的形式进行分隔，产生大量分隔的扩增体系。将分隔后的pcr反应体系进行扩增后，逐一检查每一个小的反应体系中是否产生阳性荧光信号。通过泊松分布得到的微反应中平均拷贝数，结合阳性亮点的个数即可得到体系中目的片段的总拷贝数。

本方法采用双通道检测法，利用能够进行总肉成分定量的引物探针，骆驼特异性物种基因和高等动物特异性基因在基因组中均为恒定拷贝，利用数字pcr系统可以同时探测两种荧光信号，将特异性物种基因和高等动物特异性基因序列检测的探针分别标记为fam和vic，通过在同一pcr反应体系中测得的骆驼特异性物种基因和高等动物特异性基因序列的拷贝数，同时进行骆驼源性成分和总肉成分的定量，可计算得到骆驼特异性物种成分占高等动物成分的相对含量。

实验结果表明，本方法对骆驼源性成分占总肉成分的相对定性检测限(lod)为0.01％，定量检测限(loq)为0.1％。此外，本发明的方法在同一个pcr反应体系内进行双重pcr可以有效的避免不同反应体系里存在的系统误差，以及取样和dna提取造成的平行之间的误差，而且可以节约试剂和时间成本。

附图说明

图1是采用ddpcr的骆驼源性成份拷贝数浓度相对定性检测限的验证2d图。

图2是采用cdpcr的骆驼源性成份拷贝数浓度相对定性检测限的验证2d图。

图3是采用ddpcr的骆驼源性成分拷贝数浓度相对定量检测限验证实验数据分析图。

图4是采用cdpcr的骆驼源性成分拷贝数浓度相对定量检测限验证实验结果2d图。

图5是采用ddpcr的实际样品检测结果1d图。

图6是采用cdpcr的实际样品检测结果2d图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

仪器和试剂

1.仪器

qx200^tmdropletdigitalpcr系统：包括热循环仪(c1000touch^tmthermalcycler)、微滴生成仪(dropletgenerator)、微滴分析仪(dropletreader)和封膜仪(pcrplatesealer)4个部分，购自美国bio-rad公司。

quantstudio^tm3ddigitalpcr系统：包括pcr系统(dualflatblockpcrsystem9700)、芯片装载仪(digitalchiploader)和芯片分析仪(digitalpcrinstrument)3个部分，购自美国appliedbiosystemsbylifetechnologies公司。

nanodrop1000核酸蛋白分析仪购自美国thermoscientific公司。

e4-200xls+单通道电动移液枪购自美国瑞宁公司。

2.试剂

ddpcr：ddpcr^tm预混液(supermixforprobes,nodutp)、微滴生成油(dropletgenerationoil)、微滴分析油(dropletreaderoil)、微滴生成卡槽(dropletgeneratordg8cartridge)、微滴生成卡槽胶垫(dropletgeneratordg8gasket)和96孔板，购自美国bio-rad公司。

cdpcr：预混液(3ddigitalpcrmastermixv2)、芯片试剂盒(3ddigitalpcr20kchipkitv2，包含芯片、芯片盖、刷头、封油注射器)，购自美国appliedbiosystemsbylifetechnologies公司。

quickgene基因提取试剂盒(cat.#dt-s)

引物和探针均由上海闪晶分子生物科技有限公司合成。

骆驼特异性物种基因和高等动物特异性基因序列检测的探针如下表1所示：

表1

3.供试样品

含有骆驼源性成分的肉制品(如食品或饲料)。

检测方法

本发明的对动物源性食品和饲料中骆驼成分相对定量检测的双重数字pcr方法按照以下步骤进行：

1、样品的制备与dna模板的提取：取样品(肉、肉制品或饲料等)25～30g剪碎后，使用组织研磨仪进行破碎，破碎条件为1800转/分、3分钟。称取制样20mg～50mg于1.5ml离心管内，采用试剂盒法提取样品dna，试剂盒可选用：动物组织基因组dna提取试剂盒(kuraboquickgenedna提取试剂盒dt-s)、wizardgenomicdnapurificationkit(promega，a1120)、pss核酸自动提取仪等dna提取方法。

2、反应体系的配制和分散

(1)ddpcr数字pcr的反应体系为：

ddpcr(微滴数字pcr，dropletdigitalpcr)反应体系为20μl，各组分如下：2×ddpcr^tm预混液10μl；浓度为10μmol/μl的引物各0.8μl，浓度为10μmol/μl的探针各0.4μl，dna模板2μl，补水至20μl。

分别将20μl的反应体系和70μl微滴生成油加入微滴生成卡槽中，盖上胶垫后放入微滴生成仪中进行微滴生成，待微滴生成结束后用单通道电动移液枪将生成的微滴(大约40μl)全部转移至96孔板中，用封膜仪进行封膜后置于热循环仪中进行pcr反应。

(2)cdpcr数字pcr的反应体系为：

cdpcr(芯片数字pcr，chipdigitalpcr)反应体系为15μl，各组分如下：预混液7.5μl；浓度为10μmol/μl的引物各0.6μl、浓度为10μmol/μl的探针各0.3μl，dna模板1.5μl，补水至15μl。

将配制好的15μl反应体系通过芯片装载仪自动加载到芯片上的微孔中，体系加载完成后立即使用封油注射器将封油覆盖于芯片表面并将芯片密封。密封后的芯片放置于pcr系统上进行扩增。

3、数字pcr反应程序

ddpcr反应条件：95℃，5min(1℃/s)；94℃，15s(1℃/s)，60℃，1min(1℃/s)，共49个循环；98℃，10min(1℃/s)，12℃保存反应产物。

cdpcr反应条件：96℃，10min；60℃，2min，98℃，30s，49个循环；60℃2min；10℃保存反应产物。

4、荧光信号读取和分析

本标准中荧光读取采用fam或vic双通道荧光检测。

ddpcr数据读取：扩增结束后将96孔板置于微滴分析仪中读取荧光信号，并用quantasoftv1.3.2软件分析实验数据。

cdpcr数据读取：扩增结束后，待芯片恢复至室温，将芯片置于芯片分析仪中读取并初步分析芯片结果，再经由quantstudio^tm3danalysissuitetmcloudsoftware二次分析实验数据。

荧光收集结束后，根据反应热点图确定荧光阈值，进行阴性点与阳性点的区分。

5、结果计算

骆驼源性成分占总肉成分相对含量的计算

骆驼源性成分占总肉成分相对含量

a——骆驼特异性基因拷贝数浓度

b——高等动物特异性基因拷贝数浓度

6、质量控制

(1)样品检测的质量控制

a.样品平行间的相对标准偏差计算

样品数字pcr反应应设置两个平行，在保证检测结果拷贝数浓度大于定量检测限的情况下，并且阳性反应数量低于总反应数量80％的前提下，相对标准偏差计算公式如下：

其中x1和x2为两个平行样品的骆驼特异性/高等动物特异性基因含量拷贝数浓度，x为两组所测平行组拷贝数浓度的平均值。两个平行样品拷贝数浓度的相对标准偏差(rsd)值需小于25％，其两个平行样品所测得的平均值作为该样品的物种特异性/高等动物特异性基因含量进行后续分析。

b.有效微反应数的控制

数字pcr体系分割过程中产生的有效微反应的总数量不得低于平台理论数的60％(即12000个)；阳性体系的数量不得超过总体系数量的80％。

c.空白对照的质量控制

数字pcr空白对照理论检测结果应为零。但在实际检测中，允许有极少量阳性体系数出现。空白对照中阳性微反应体系数应小于实际有效体系数的0.03％。

以上质控条件中有一项不符合者，实验结果应放弃，并重新进行数字pcr实验。

(2)性能指标的确证

a.绝对定量限的验证

本方法对骆驼和高等动物成分的绝对定量检测限为5copies/μl。对拷贝数浓度为5copies/μl的阳性样品进行数字pcr定量检测，每个浓度设置3个平行，计算各浓度平行检测结果的rsd值。以rsd≤25％作为有效定量数据的判断依据，绝对定量检测低限为检测结果rsd≤25％时的最低拷贝数浓度。

b.相对定量检测低限和回收率

本方法对骆驼占高等动物成分比例的相对定量检测限为1％。对已知相对拷贝数浓度的阳性样品/标准物质进行数字pcr定量检测，每个浓度设置2个平行，计算各相对拷贝数浓度平行检测结果的rsd值和测得的相对拷贝数浓度与理论值的偏差。以rsd≤25％和偏差≤±10％作为有效定量数据的判断依据。

实施例1骆驼源性成份拷贝数浓度相对定性检测限的验证

供试样本：以猪、牛、羊、鸡基因组dna为基质，将骆驼基因组dna按照拷贝数百分比混合成骆驼基因组dna拷贝数百分比为0.01％的供试dna样本。分别进行3个平行的ddpcr和cdpcr实验，所得数据见图1和图2。结果显示，对于骆驼源性成分含量为0.01％时，ddpcr和cdpcr均能检出。

实施例2骆驼源性成份拷贝数浓度相对定量检测限的验证

供试样本：为验证本方法的定量检测限，以猪、牛、羊、鸡基因组dna为基质，在其中掺入拷贝数百分比分别为0.1％、1％、10％和100％的骆驼基因组dna。分别进行3个平行的ddpcr和cdpcr实验，所得实验结果见图3和图4。

对于拷贝数百分比分别为0.1％、1％、10％和100％的骆驼基因组dna样本，在ddpcr平台上的检测结果分别为0.099％、0.997％、10.38％和99.04％，三个平行之间的rsd值在2.06％～14.82％之间，回收率在98.59％～103.78％之间；在cdpcr平台上的检测结果分别为0.099％、0.968％、10.30％和99.29％，三个平行之间的rsd值在0.99％～9.94％之间，回收率在96.76％～103.04％之间。

实施例3实际样品检测能力

供试样本：以猪、牛、羊、鸡混合生肉为基质，在其中掺入质量百分比为1％、10％、50％和100％的骆驼肉，用试管研磨机进行混匀，制备含有多种动物源性成分的混合肉样各10g。每个样品称取3个平行，每个平行30mg，分别进行动物组织基因组dna提取，每个称样平行分别进行1个平行的ddpcr和cdpcr。检测结果见图5和图6。

图5中，f10、g10、h10为骆驼质量百分比1％的样本，e11、d11、f11为骆驼质量百分比10％的样本，d12、c12、b12为骆驼质量百分比50％的样本，e12、f12、g12为骆驼质量百分比100％的样本。

对于骆驼肉质量百分比分别为1％、10％、50％和100％的供试样本，在ddpcr平台上的检测结果分别为1.06％、10.42％、53.28％和99.62％，三个平行之间的rsd值在0.74％～7.53％之间，回收率在99.62％～106.56％之间；在cdpcr平台上的检测结果分别为0.962％、10.10％、50.34％和99.29％，三个平行之间的rsd值在0.98％～9.94％之间，回收率在96.16％～100.99％之间。

序列表

<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>一种骆驼源性成分定量检测的双重数字pcr方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

catccacagcagtccacacc20

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggtagaagatgtaggtggaaggac24

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccagcctcttcaccagtatccctgaca27

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ttgtgcaaatcctgagactcat22

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ataccagtgcctgggttcat20

<210>6

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cccatgaaagaaaggtatactgcggtac28