本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高转化率运动发酵单胞菌及其构建方法和应用。
背景技术：
运动发酵单胞菌(zymononasmobilis)是一种革兰氏阴性兼性厌氧细菌。由于其具有独特的ed代谢途径和高效的乙醇发酵性能，该菌株在生物炼制领域被认为具有广阔的应用前景。除了具有上述优点，运动发酵单胞菌还存在着一些缺陷诸如：底物利用范围狭窄，只能利用葡萄糖、果糖和蔗糖；对抑制物的耐受性差；代谢图谱过于简单，产物种类少。为了拓展运动发酵单胞菌在工业上的应用，利用基因工程技术对其进行改造是一种较好的方式，也是目前生物技术领域研究的焦点。
由于目前对运动发酵单胞菌的基因工程改造一般涉及到目标基因的过表达和敲除等操作，但是运动发酵单胞菌基因操作体系存在转化效率较低、可用抗性筛选标记少、大质粒操作困难等特点，其基因工程改造大受限制，甚至在一些情况下，外源基因无法导入其中。运动发酵单胞菌自身已经存在着很多抗性基因，而传统的针对于运动发酵单胞菌的基因敲除手段通常会引入一些抗生素抗性标记用于转化子的筛选，这为实现多基因操作带来了不便。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种高转化率运动发酵单胞菌zm4m和zm401m及其构建方法和应用。
技术实现要素：
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是运动发酵单胞菌基因改造操作体系存在效率较低、大质粒操作困难、基因工程改造大受限制，甚至在一些情况下，外源基因无法导入其中。
研究表明运动发酵单胞菌种限制修饰系统(restriction-modificationsystem)的存在是导致其基因操作困难的重要原因。在运动发酵单胞菌中存在着ⅰ,ⅰ,ⅰ和ophanm类型的限制-修饰系统，其中编码ⅰ型限制-修饰系统主要成分的基因zmo1933和编码ⅳ型限制修饰系统的基因zmo0028的敲除对于提高运动发酵单胞菌质粒的转化效率具有最优良的结果。同时，敲除限制修饰系统以提高其他菌株的转化效率在文献和专利中都有所记载。
利用自杀质粒pex18tc实现对运动发酵单胞菌的ⅰ型和ⅳ型限制修饰系统的双敲除，自杀质粒pex18tc在运动发酵单胞菌基因组上经过同源重组双交换后便可实现对于目标基因的敲除，而且不会残留任何的抗生素抗性痕迹，这为实现多基因敲除奠定了理论基础。为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌菌株的构建方法。
在一个优选的实施例中，该构建方法的步骤如下：
1)结合参考文献及数据库kegg，预测运动发酵单胞菌zm4和zm401全基因组限制-修饰系统(r-msystem)相关基因。
2)对预测到的两个和限制-修饰系统相关的基因分别设计基因敲除引物。
3)分别以zm4和zm401为出发菌株，敲除相关基因，得到菌株zm4△1933、zm4△0028、zm401△1933、zm401△0028。
4)以zm4△0028为出发菌株，再敲除zmo1933基因，得到zm4△0028△1933双敲除菌株，即zm4m；以zm401△1933为出发菌株，再敲除zmo0028基因，得到zm401△0028△1933双敲除菌株，即zm401m。
其中，步骤2)中，两个zm4全基因组限制-修饰系统相关基因分别为ⅰ型限制-修饰系统相关基因zmo1933和ⅳ型限制-修饰系统相关基因zmo0028。
进一步地，步骤3)中通过自杀质粒敲除限制-修饰系统相关基因。
进一步地，敲除出发菌株的限制-修饰系统相关基因，最终形成无抗性标记残留的高转化效率的菌株。
进一步地，出发菌株包括zm4和zm401，美国菌种保藏中心编号分别为：atcc31821和atcc31822。
进一步地，步骤2)中，基因敲除中所述zmo1933基因的敲除引物为：上游同源臂的一对引物如seqidno.5及no.6所示，下游同源臂的一对引物如seqidno.7及no.8所示。
进一步地，步骤2)中，基因敲除中所述zmo0028基因的敲除引物为：上游同源臂的一对引物如seqidno.1及no.2所示，下游同源臂的一对引物如seqidno.3及no.4所示。
进一步地，步骤3)中的自杀质粒为质粒pex18tc。
进一步地，步骤3)，4)中，所述敲除具体包括如下步骤：
(a)pcr扩增限制-修饰系统相关基因上下游同源臂，通过overlappcr方法获得大片段；
(b)连接大片段与自杀质粒得到重组质粒，将重组质粒去甲基化后，采用电转化法将质粒转化到运动发酵单胞菌zm4和zm401中；
(c)单交换转化子及双交换转化子的验证、筛选、鉴定，即得到1个限制-修饰系统相关基因敲除的菌株；
(d)以ⅰ型限制-修饰系统相关基因zmo1933敲除的菌株为受体菌，重复步骤(a)到(c)，进行ⅳ型限制-修饰系统相关基因zmo0028的敲除，即可获得2个限制-修饰系统相关基因敲除的菌株；或以ⅳ型限制-修饰系统相关基因zmo0028敲除的菌株为受体菌，重复步骤(a)到(c)，进行ⅰ型限制-修饰系统相关基因zmo1933的敲除，即可获得2个限制-修饰系统相关基因敲除的菌株，
进一步地，步骤(b)中所述的转化为电转化法。
进一步地，步骤(b)的具体步骤为：
●将构建好的质粒转入e.colijm110，并从中提取去甲基化的质粒；
●从-80℃冰箱中取出z.mobilis甘油菌，在rm琼脂平板上通过分区划线方式产生单菌落；
●挑取z.mobilis单菌落于rm液体培养基中培养过夜至对数末期；
●按照2％-3％转接，静置培养至od600＝0.4，冰上放置15-20min，4℃，4,500rpm离心5min，弃上层液体；
●用预冷的含有10％甘油的ddh2o洗2遍，并用适量体积的含有10％甘油的ddh2o重悬菌体，分装成80μl每管制成z.mobilis感受态；
●将1μg去甲基化的质粒加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置5min，转入预冷的1mm电击杯中，设置电击条件为：1.6kv/cm，200ω，25μf，电击后，立即加入0.8mlrm培养基，转移至1.5ml离心管中，30℃培养箱中复苏3h；
●涂布含有20μg/ml四环素的rm固体培养基，30℃培养箱中培养48-60h。
进一步地，步骤(c)中对步骤(b)得到的转化子用δtarget-up-f及δtarget-down-r为引物，进行单交换菌落pcr验证，电泳条带应为两条，一条长度为上下游同源臂总长，一条长度为上下游同源臂与目的基因之和。
进一步地，步骤(c)中的筛选分为两次，第一次为含有四环素的抗性平板筛选单交换菌株，第二次为含有5％蔗糖培养基进行筛选重组菌株。
进一步地，步骤(c)中具体的鉴定方法为：
对于单交换验证正确的转化子，在含有四环素(20μg/ml)的rm液体培养基中培养至对数期，按照约10-3-10-5比例稀释菌液，取100μl涂布于含有5％蔗糖的rm培养基中培养12-16h长出单菌落；
对长出的单菌落进行菌落pcr验证，应为单一条带，野生型条带或基因敲除菌株大小。
进一步地，步骤(c)中的验证及鉴定所使用的上游引物如seqidno.1和seqidno.5所示，下游引物如seqidno.4和seqidno.8所示。
进一步地，步骤(d)中得到的敲除菌株即为无抗性标记的敲除菌株。
第二方面提供了一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌。
在一个优选的实施例中，所述运动发酵单胞菌菌株通过包括如下步骤的方法制得；以zm4及zm401为出发菌株，敲除限制-修饰系统相关基因，相应获得高转化效率的菌株，菌株最终无抗性标记残留。
进一步地，出发菌株zm4和zm401购自美国菌种保藏中心，美国菌种保藏中心编号分别为：atcc31821和atcc31822
进一步地，菌株为zm4△1933、zm4△0028、zm401△1933、zm401△0028。
优选地，所述菌株为zm4m和zm401m。
本发明的第三个方面提供了上述高转化效率的运动发酵单胞菌zm4m和zm401m的应用。
作为基因工程菌在基因组大片段删除方面的应用。
技术效果
1、单敲除及双敲除限制修饰系统菌株比野生菌株具有更高的转化效率；
2、高转化效率运动发酵单胞菌zm4m及zm401m菌株的构建方法和传统运动发酵单胞菌基因工程改造方法相比，未在运动发酵单胞菌中引入抗性标记，可以对该限制修饰系统双敲除菌株以同样的敲除方法实现对其他目标基因的多次敲除，不会给重组子筛选带来不便。
以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的单交换及双交换转化子示电泳验证图，其中泳道1是单交换转化子；泳道3、5、6是双交换转化子；泳道2、4、7、8、9、10是双交换恢复为野生型的转化子；m为敲除基因的dnaladder；
图2是本发明的一个较佳实施例的zm4及zm4m和zm401及zm401m菌株的转化效率对比图，其中phw20a为来源于dh5α的甲基化质粒，phw20a(dam-,dcm-)为来源于jm110的去甲基化质粒；
图3是本发明的一个较佳实施例的zm4及zm4m的发酵性能对比图；
图4是本发明的一个较佳实施例的zm401及zm401m的发酵性能对比示意图；
图5是本发明的一个较佳实施例的zmo1055基因在zm4及zm4m中的转化效率对比图；
图6是本发明的一个较佳实施例所用的自杀载体图谱示意图；
图7是本发明的一个较佳实施例所用的z.mobilis基因敲除(同源重组)示意图。
具体实施方式
在本发明中出发菌株为zm4和zm401，购自美国菌种保藏中心，美国菌种保藏中心编号分别为：atcc31821和atcc31822
自杀载体pex18tc图谱如图6所示，来源为：上海交通大学微生物代谢国家重点实验室周宁一课题组馈赠。
实施例1
一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌zm4m及zm401m菌株的构建：
1、限制-修饰系统相关基因预测
通过结合参考文献及数据库kegg，预测运动发酵单胞菌zm4和zm401全基因组限制-修饰系统(r-msystem)相关基因，如表1所示，其中zmo0028和zmo1933两个基因的ncbi-proteinid分别为aav88652和aav90557。
表1运动发酵单胞菌中预测到的限制修饰系统
2、敲除引物的设计
为预测到的两个和限制修饰系统相关的基因分别设计基因敲除引物并用于后续筛选、鉴定步骤，基因敲除与转化子鉴定相关引物如表2所示。
表2基因敲除与转化子鉴定相关引物
注：下划线为酶切位点序列，小写为与相邻片段相连所需的同源序列。
3、第一次基因敲除获得单交换转化子
分别以zm4和zm401为出发菌株，通过质粒pex18tc敲除掉关基因，得到菌株zm4△0028、zm401△1933。
敲除操作的步骤为：
利用pcr扩增所述限制酶基因上下游同源臂，通过overlappcr方法获得大片段。
连接所述大片段与自杀质粒得到重组质粒，将所述质粒转化到运动发酵单胞菌zm4和zm401中。
采用电转化的方法，向z.mobilis中转入相应的质粒，具体步骤如下：
将构建好的质粒转入e.colijm110，并从中提取去甲基化的质粒；
从-80℃冰箱中取出z.mobilis甘油菌，在rm琼脂平板上通过分区划线方式产生单菌落；
挑取z.mobilis单菌落于rm液体培养基中培养过夜至对数末期；
按照2％-3％转接，静置培养至od600＝0.4，冰上放置15-20min，4℃，4,500rpm离心5min，弃上层液体；
用预冷的含有10％甘油的ddh2o洗2遍，并用适量体积的含有10％甘油的ddh2o重悬菌体，分装成80μl每管制成z.mobilis感受态；
将1μg去甲基化的质粒加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置5min，转入预冷的1mm电击杯中，设置电击条件为：1.6kv/cm，200ω，25μf，电击后，立即加入1mlrm培养基，转移至1.5ml离心管中，30℃培养箱中复苏3h；
涂布含有20μg/ml四环素的rm固体培养基，30℃培养箱中培养48-60h。
对长出的转化子用δtarget-up-f及δtarget-down-r为引物，菌落pcr验证，电泳条带应为两条(一条长度为上下游同源臂总长，一条长度为上下游同源臂与目的基因之和)。所述鉴定为使用引物上游同源臂的一对引物如seqidno.1和seqidno.5所示，下游源臂的一对引物如seqidno.4和seqidno.8
双交换转化子的筛选、鉴定，即得目的基因敲除的菌株。具体鉴定方法为：
对于单交换验证正确的转化子，在含有四环素(20μg/ml)的rm液体培养基中培养至对数期，按照约10-3-10-5比例稀释菌液，取100μl涂布于含有5％蔗糖的rm培养基中培养12-16h长出单菌落；
对长出的单菌落进行菌落pcr验证，应为单一条带(野生型条带或基因敲除菌株大小)，得到的敲除菌株即为无抗性标记的敲除菌株。所述鉴定为使用引物上游源臂的一对引物如seqidno.1和seqidno.5所示，下游源臂的一对引物如seqidno.4和seqidno.8。
4、第二次基因敲除获得转化子敲除两个限制-修饰系统基因的菌株
以zm4△0028为出发菌株，再敲除zmo1933基因，得到zm4△0028△1933双敲除菌株，即zm4m；以zm401△1933为出发菌株，再敲除zmo0028基因，得到zm401△0028△1933双敲除菌株，即zm401m。
具体敲除步骤如下：
以1个限制酶基因敲除的菌株为受体菌，pcr扩增所述限制酶基因上下游同源臂，通过overlappcr方法获得大片段。
连接所述大片段与自杀质粒得到重组质粒，将所述质粒转化到运动发酵单胞菌zm4和zm401中。
采用电转化的方法，向z.mobilis中转入相应的质粒，具体步骤如下：
将构建好的质粒转入e.colijm110，并从中提取去甲基化的质粒；
从-80℃冰箱中取出z.mobilis甘油菌，在rm琼脂平板上通过分区划线方式产生单菌落；
挑取z.mobilis单菌落于rm液体培养基中培养过夜至对数末期；
按照2％-3％转接，静置培养至od600＝0.4，冰上放置15-20min，4℃，4,500rpm离心5min，弃上层液体；
用预冷的含有10％甘油的ddh2o洗2遍，并用适量体积的含有10％甘油的ddh2o重悬菌体，分装成80μl每管制成z.mobilis感受态；
将1μg去甲基化的质粒加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置5min，转入预冷的1mm电击杯中，设置电击条件为：1.6kv/cm，200ω，25μf，电击后，立即加入0.8mlrm培养基，转移至1.5ml离心管中，30℃培养箱中复苏3h；
涂布于含有20μg/ml四环素的rm固体培养基，30℃培养箱中培养48-60h。
对长出的转化子用δtarget-up-f及δtarget-down-r为引物，菌落pcr验证，电泳条带应为两条(一条长度为上下游同源臂总长，一条长度为上下游同源臂与目的基因之和)。所述鉴定为使用引物上游同源臂的一对引物如seqidno.1和seqidno.5所示，下游源臂的一对引物如seqidno.4和seqidno.8
双交换转化子的筛选、鉴定，即得2个限制-修饰酶基因均敲除的菌株。具体鉴定方法为：
对于单交换验证正确的转化子，在含有四环素(20μg/ml)的rm液体培养基中培养至对数期，按照约10-3-10-5比例稀释菌液，取100μl涂布于含有5％蔗糖的rm培养基中培养12-16h长出单菌落；
对长出的单菌落进行菌落pcr验证，应为单一条带(野生型条带或基因敲除菌株大小)，得到的敲除菌株即为无抗性标记的敲除菌株。所述鉴定为使用引物上游源臂的一对引物如seqidno.1和seqidno.5所示，下游源臂的一对引物如seqidno.4和seqidno.8。
单交换转化子及双交换转化子的验证、筛选、鉴定，即得到2个限制酶基因敲除的菌株，z.mobilis基因敲除(同源重组)示意图如图7所示。
实施例2
通过以下步骤使用电转化法将重组质粒转化到运动发酵单胞菌zm4和zm401：
●将构建好的质粒转入e.colijm110，并从中提取去甲基化的质粒；
●从-80℃冰箱中取出z.mobilis甘油菌，在rm琼脂平板上通过分区划线方式产生单菌落；
●挑取z.mobilis单菌落于rm液体培养基中培养过夜至对数末期；
●按照2％-3％转接，静置培养至od600＝0.4，冰上放置15-20min，4℃，4,500rpm离心5min，弃上层液体；
●用预冷的含有10％甘油的ddh2o洗2遍，并用适量体积的含有10％甘油的ddh2o重悬菌体，分装成80μl每管制成z.mobilis感受态；
●将1μg去甲基化的质粒加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置5min，转入预冷的1mm电击杯中，设置电击条件为：1.6kv/cm，200ω，25μf，
电击后，立即加入1mlrm培养基，转移至1.5ml离心管中，30℃培养箱中复苏3h；
●涂布含有20μg/ml四环素的rm固体培养基，30℃培养箱中培养48-60h。
实施例3
转化子单交换验证：
如图1所示，将通过电转化法将重组质粒转化到运动发酵单胞菌zm4和zm401形成的转化子进行单交换菌落pcr验证，电泳条带应为两条，一条长度为上下游同源臂总长，一条长度为上下游同源臂与目的基因之和，鉴定所使用的上游引物如seqidno.1和seqidno.5所示，下游引物如seqidno.4和seqidno.8所示。
实施例4
2个限制-修饰酶基因均敲除菌株的鉴定：
2个基因均敲除的菌株的构建步骤为按照构建单基因敲除菌株的步骤，先得到单基因敲除菌株，在单基因敲除的菌株基础上再构建第二个基因敲除菌株。
对于单交换验证正确的转化子，在含有四环素(20μg/ml)的rm液体培养基中培养至对数期，按照约10-3-10-5比例稀释菌液，取100μl涂布于含有5％蔗糖的rm培养基中培养12-16h长出单菌落；
对长出的单菌落进行菌落pcr验证，应为单一条带，野生型条带或基因敲除菌株大小，得到的敲除菌株即为无抗性标记的敲除菌株，鉴定所使用的上游引物如seqidno.1和seqidno.5所示，下游引物如seqidno.4和seqidno.8所示
实施例5
敲除限制修饰系统的zm4m及zm401m菌株转化效率及发酵性能比较：
按照制备电击转化感受态的方式制备感受态细胞，控制感受态细胞浓度为od600为20，80μl/管，向其中加入1μgdna，设置电击条件为：1.6kv/cm,200ω,25μf，电击后加入800μlrm液体，30℃静置复苏3h涂板。
发酵性能比较：
将几种菌株从-80℃取出后，于rm固体板活化，取活化好的菌于rm液体培养基中培养至对数末期作为种子，测其od600，转接于含有100g/l葡萄糖的rm发酵培养基中，控制菌株的初始od600＝0.5，絮凝菌株zm401及zm401m在摇匀后，取样解絮后测od600的值
如图2，图3，图4，所示，将去甲基化和未去甲基化的表达载体phw20a分别转化zm4、zm401以及敲除限制修饰系统的菌株zm4m和zm401m中，转化效率能够大幅度提高。且相比于zm4和zm401，zm4m和zm401m的生长性能和发酵性能并未受到影响。
实施例6
zm4m的转化效率性能比较：
转化效率比较方法同实施例5。将基因zmo1055(ncbi-proteinid:aav89679)连接表达载体phw20a后，构建成功基因表达载体phw20a-zmo1055，将其分别转入zm4和zm4m中，验证其转化效率。实验结果如图5所示，相比于zm4，zm4m的转化效率大幅度提高。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110>上海交通大学
<120>一种高转化率运动发酵单胞菌及其构建方法和应用
<130>0133517131pix
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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