本发明属于生物技术领域，具体涉及一种编码重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的基因、卵黄抗体与应用。
背景技术：
幽门螺杆菌(helicobacterpylori)是科学家barrymarshall和robinwarren发现的，该菌能够感染胃部组织并且引发溃疡，而这两位研究者也因发现了幽门螺杆菌而获得了2005年的诺贝尔生理学及医学奖。
幽门螺杆菌，是胃溃疡和胃癌的致病因子。据估计，一半的世界人口感染上幽门螺杆菌。很多感染者产生胃炎症状，而且每5名感染者当中，就有1人在他们的生命的某个时刻患上胃溃疡，在很多情形下，这是一种病情进展快速的致命性疾病。胃炎和胃溃疡可利用抗生素加以治疗；这些治疗经常需要使用两到三种不同类型的抗生素，而且仍然不能够治愈所有的病人。在最糟糕的情形下，长期的幽门螺杆菌炎症能够导致胃癌产生。胃癌是一种高度致死性的很难治疗的癌症。在全世界，胃癌每年影响着100万人，每年有超过70万人死于胃癌。
幽门螺杆菌的感染通常发生于幼年时期，这种细菌分布广泛，很多人都是该菌的携带者，这种细菌引发的并发症包括胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡，此外，其也会增加携带者患胃癌的风险。
胃癌产生的主要原因被认为是幽门螺杆菌(helicobacterpylori)感染。目前，人们尚没有有效地治疗胃癌的方法，而且抗生素耐药性的不断扩散也使得治疗这种细菌感染变得更加复杂。如今，在一项新的研究中，来自德国埃尔朗根-纽伦堡大学(friedrich-alexander-
如今，这些研究人员发现幽门螺杆菌分泌一种被称作htra的丝氨酸蛋白酶，它的作用就像一种武器那样能够穿透这个保护层。htra切割三种蛋白：闭合蛋白(occludin)、紧密连接蛋白-8(claudin-8)和上皮钙黏蛋白(e-cadherin)，从而破坏这个上皮细胞保护层。因此，幽门螺杆菌能够侵入更深的通常是不含病原体的组织层中，从而造成进一步的损伤。这是胃癌开始产生的第一阶段。
然而，正如这些研究人员所发现的那样，在第一个阶段之后的那个阶段是更加危险的。被称阿作iv型分泌系统的针状突起物经激活后，作为“分子注射器(molecularsyringes)”发挥作用。利用一种受体依赖性的机制，这些分子注射器穿过宿主细胞的基侧膜，注射一种细菌毒素，即caga蛋白。注入的caga随后会让宿主细胞发生重编程，使得它们潜在地发生癌变。这种蛋白的另一种作用是它阻止人免疫系统识别和消灭幽门螺杆菌---这是人胃部中的这种细菌长期存活下来的一个关键机制。
抑制幽门螺杆菌(hp)丝氨酸蛋白酶(htra)的卵黄抗体，可以通过抑制丝氨酸蛋白酶(htra)的活性，阻断幽门螺杆菌(hp)感染人体的途径，从而对其导致的相关疾病产生预防和治疗作用。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种编码重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的基因。
本发明的另一目的在于提供上述编码重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的基因的应用。
本发明的再一目的在于提供一种抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体，该卵黄抗体适于预防和治疗幽门螺杆菌感染引起的胃溃疡或胃癌。
本发明的第四个目的在于提供上述抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体的制备方法，该方法含基因工程技术，优化免疫技术和蛋白质分离纯化技术。
本发明的第五个目的在于提供上述抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种编码重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的基因，其核苷酸序列如下所示：
所述的编码重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的基因在制备抑制幽门螺杆菌感染产品中的应用；
一种重组载体pet22b-htra，包含上述编码重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的基因；
一种基因工程菌，是将上述重组载体pet22b-htra转化原核表达系统得到；
所述的基因工程菌，通过如下制备方法制备得到：
通过基因合成，得到编码重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的基因；将编码重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的基因亚克隆到原核表达载体pet22-b，得到重组载体pet22b-htra；将重组载体pet22b-htra转化大肠杆菌bl21(de3)，得到基因工程菌；
一种抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体，通过如下方法制备得到：
将上述基因工程菌进行诱导表达，纯化，获得重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶，将重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶作为免疫抗原免疫母鸡，收集免疫后的母鸡产下的鸡蛋，提取鸡蛋中的卵黄抗体，纯化，得到抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体；
所述的抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体的制备方法，包含如下步骤：
(1)将基因工程菌发酵培养至od600为0.6～0.8，然后使用iptg诱导目的蛋白表达，冰浴，收集菌体；超声破碎，离心，收集上清液；上清液经离子交换和亲和层析分离纯化，得到重组幽门螺杆菌(hp)丝氨酸蛋白酶(htra)，作为免疫抗原；
(2)选取20周龄产蛋母鸡，以步骤(1)制得的重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶作为免疫抗原，初次免疫使用弗氏完全佐剂和免疫抗原等体积混合，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂和免疫抗原等体积混合，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫3～5次，从第一次加强免疫开始收集免疫鸡蛋；
(3)收集步骤(2)制得的免疫鸡蛋的卵黄，加入6～9倍卵黄体积的水，20～40℃搅拌30min～2h，得到溶解液；然后加入硅藻土和0.6～1.3倍溶解液体积的乙醇，调节ph至6.5～7.5，搅拌30min～1h，过滤弃去残渣，得到清液；
(4)向步骤(3)制得的清液中加入硅藻土和1.5～2.5倍溶解液体积的乙醇，调节ph值至5.0～5.4，搅拌30min～1h，过滤弃去清液，得到固体组分；在固体组分中加入6～9倍固体组分质量的水溶解，20～40℃搅拌30min～2h，过滤弃去残渣，得到清液；将清液超滤浓缩，干燥，得到抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体；
步骤(1)中所述的发酵培养的温度优选为35～37℃发酵培养；
步骤(1)中所述的iptg诱导蛋白表达的条件优选为25℃～30℃的条件下0.1～1.0mmiptg诱导蛋白表达；
步骤(1)中所述的使用iptg诱导目的蛋白表达优选为：使用iptg诱导目的蛋白表达后，最终70～85％的重组幽门螺杆菌(hp)丝氨酸蛋白酶(htra)以可溶性形式蛋白表达；
步骤(2)中所述的免疫抗原的初始浓度优选为0.4～4mg/ml；
步骤(2)中所述的注射的用量优选为每只母鸡每次注射0.5ml；
步骤(3)中所述的卵黄的收集优选为：将步骤(2)制得的免疫鸡蛋清洗消毒后打破，用蛋黄分离器小心分离卵黄；
步骤(3)中所述的硅藻土的用量为按溶解液计终浓度5～20g/l；
步骤(4)中所述的硅藻土的用量为按溶解液计终浓度5～20g/l；
步骤(3)和(4)中所述的乙醇优选为预先冷却至0～15℃的乙醇；
步骤(3)中所述的超滤浓缩优选为用超滤器进行超滤浓缩，浓缩倍数为3～5倍；或加入pbs进行超滤浓缩，得到卵黄抗体溶液；
步骤(3)中所述的干燥优选为冷冻干燥；
所述的抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体在制备防治胃癌产品中的应用；
所述的产品优选为食品添加剂、保健品或药品；
一种酸奶，包含上述抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体；
所述的酸奶的制备方法，包含如下步骤：
(1)配制乳液：取奶粉120～130g，在奶粉中加入70～80℃，940～1060ml温开水配制成乳液；
(2)均质：将步骤(1)中的乳液9～11mpa均质1～2min；
(3)灭菌：将步骤(2)中均质后的乳液88～92℃水浴保温9～10min进行杀菌处理，然后将其冷却至38～42℃，得到料液；
(4)接种：在无菌条件下，加入无菌的抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体5～10mg，另将发酵剂，按照1g/1000ml的比例接种到料液中，并将其搅拌均匀，得到接种料液；
(5)发酵：在无菌条件下，将接种料液等量灌装于灭菌的玻璃瓶中并封口，然后将封口好的玻璃瓶放置于42℃恒温培养箱中发酵45h；
(6)后发酵：将步骤(5)中发酵后的玻璃瓶在1～4℃的条件下进行后发酵，后发酵至少保持24h，得到酸奶；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)为了提高重组蛋白在基因工程菌中的表达水平，本发明通过密码子优化，得到本发明所提供的编码重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的基因。将该编码重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的基因重组原核表达系统中，选用合适的表达载体和宿主，实现表达量提高且为可溶性表达(70～85％的重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶以可溶性形式蛋白表达)，利于保持重组蛋白的天然构像和免疫原性。
(2)为了解决卵黄抗体大规模生产所需的抗原来源的问题，利用基因工程和蛋白重组的技术来制备幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶抗原，操作简单，成本低。
(3)本发明设计和实现了一种能够阻断幽门螺杆菌感染人体的路径，从而有效预防和治疗相关疾病的新的卵黄抗体。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1重组幽门螺杆菌(hp)丝氨酸蛋白酶(htra)的克隆
(1)从pubmed蛋白质数据库中检索幽门螺杆菌(hp)丝氨酸蛋白酶(htra)氨基酸序列，选用编号为genbank：aad05980.1，氨基酸序列如下所示，对其进行密码子优化：
(2)选择表达载体为pet-22b，表达宿主为bl21(de3)，酶切位点为5'ndei和3'sali，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因的全序列合成和克隆，获得基因工程菌hphtra，其中，密码子优化后的dna序列如下：
(3)基因工程菌hphtra接种于含amp(终浓度为100μg/ml)的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按体积百分比为1％的接种量转接，37℃培养至od600为0.6～0.8，然后加入终浓度为0.15mmol/l的iptg于28℃诱导表达4h，冰浴15min，离心收集菌体；用0.05m磷酸盐缓冲液(ph8.0)悬浮离心收集的细菌，超声破碎，条件为：200w，超声3s，问歇12s，30min。10000g离心收集上清，弃去沉淀，得到上清液；
(4)上清液上cm阳离子交换柱，用冲洗液(0.05m磷酸盐缓冲液(ph8.0)+终浓度0.1m的nacl)冲洗柱子至流出液最后od280<0.5；用洗脱液(0.05m磷酸盐缓冲液(ph8.0)+终浓度0.5m的nacl)洗脱柱子，收集至流出液最后od280<0.3；将cm柱收集峰用1万孔径的超滤膜超滤浓缩后，加入质量分数为0.9％的nacl溶液超电导，使最终电导与质量分数为0.9％的nacl溶液电导一致(电导率±10％)；调节ph值至7.2±0.1，用nacl调电导低于平衡液(0.05m磷酸盐缓冲液+终浓度0.5m的nacl，ph7.2±0.1，电导50±4ms/cm)电导1～2ms/cm，上苯扎嘧啶亲和层析柱；用冲洗液(0.05m磷酸盐缓冲液+终浓度0.5m的nacl，ph7.2±0.1，电导50±4ms/cm)冲洗柱子至流出液最后od280<0.2；用洗脱液(0.1mnaac-hac+终浓度0.3m的nacl，ph4.0±0.1，电导30±2ms/cm)洗脱柱子，收集至流出液最后od280<0.2；超滤浓缩，调节ph4.0±0.1，冻干，得到重组幽门螺杆菌(hp)丝氨酸蛋白酶(htra)，经sds-page分析，纯度大于95％，85％以上重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶以可溶性形式蛋白表达，密码子优化后获得的重组幽门螺杆菌(hp)丝氨酸蛋白酶(htra)表达量大大提高。
实施例2抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体的制备
(1)实施例1制得的重组幽门螺杆菌(hp)丝氨酸蛋白酶(htra)用生理盐水配制成蛋白浓度为1mg/ml的溶液作为免疫抗原；取20周龄产蛋母鸡4只，将免疫抗原与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化后，以0.5ml/只的剂量经母鸡双翼或胸肌处多点注射；首次免疫2周后进行第一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂和免疫抗原等体积混合并充分乳化后，以0.5ml/只的剂量经母鸡双翼或胸肌处多点注射；以后每隔15天加强免疫一次，共加强免疫4次，第1次加强免疫后收集鸡蛋，收集未免疫蛋作为阴性对照品，连续收集2个月(收集的鸡蛋编号)，存放于4℃；首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；
(2)将步骤(1)收集的鸡蛋清洗消毒后打破，用蛋黄分离器小心分离卵黄；用9倍卵黄体积的纯化水溶解稀释卵黄，30℃搅拌30min，得到溶解液；然后加入按溶解液计终浓度为16g/l的硅藻土和1.0倍溶解液体积的乙醇(预先冷却至15℃以下)，调节ph值至7.0，搅拌1h，过滤弃去残渣，得到清液；
(3)向步骤(2)制得的清液中加入按溶解液计终浓度为10g/l的硅藻土和2.5倍溶解液体积的乙醇(预先冷却至15℃以下)，调节ph值至5.2，搅拌1h，过滤弃去清液，得到固体组分；在固体组分中加入9倍固体组分质量的纯化水溶解，30℃搅拌30min，过滤弃去残渣，得到清液；将清液用超滤器进行超滤浓缩，浓缩倍数为4倍，得到卵黄抗体溶液；卵黄抗体溶液除菌过滤无菌冻干，得到抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体。
实施例3抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体的制备
(1)实施例1制得的重组幽门螺杆菌(hp)丝氨酸蛋白酶(htra)用生理盐水配制成蛋白浓度为0.4mg/ml的溶液作为免疫抗原；取20周龄产蛋母鸡4只，将免疫抗原与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化后，以0.5ml/只的剂量经母鸡双翼或胸肌处多点注射；首次免疫2周后进行第一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂和免疫抗原等体积混合并充分乳化后，以0.5ml/只的剂量经母鸡双翼或胸肌处多点注射；以后每隔15天加强免疫一次，共加强免疫5次，第1次加强免疫后收集鸡蛋，收集未免疫蛋作为阴性对照品，连续收集2.5个月(收集的鸡蛋编号)，存放于4℃；首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；
(2)将步骤(1)收集的鸡蛋清洗消毒后打破，用蛋黄分离器小心分离卵黄；用6倍卵黄体积的纯化水溶解稀释卵黄，20℃搅拌2h，得到溶解液；然后加入按溶解液计终浓度为5g/l的硅藻土和0.6倍溶解液体积的乙醇(预先冷却至15℃以下)，调节ph值至6.5，搅拌45min，过滤弃去残渣，得到清液；
(3)向步骤(2)制得的清液中加入按溶解液计终浓度为5g/l的硅藻土和1.5倍溶解液体积的乙醇(预先冷却至15℃以下)，调节ph值至5.0，搅拌45min，过滤弃去清液，得到固体组分；在固体组分中加入6倍固体组分质量的纯化水溶解，20℃搅拌2h，过滤弃去残渣，得到清液；将清液用超滤器进行超滤浓缩，浓缩倍数为3倍，得到卵黄抗体溶液；卵黄抗体溶液除菌过滤无菌冻干，得到抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体。
实施例4抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体的制备
(1)实施例1制得的重组幽门螺杆菌(hp)丝氨酸蛋白酶(htra)用生理盐水配制成蛋白浓度为4mg/ml的溶液作为免疫抗原；取20周龄产蛋母鸡4只，将免疫抗原与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化后，以0.5ml/只的剂量经母鸡双翼或胸肌处多点注射；首次免疫2周后进行第一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂和免疫抗原等体积混合并充分乳化后，以0.5ml/只的剂量经母鸡双翼或胸肌处多点注射；以后每隔15天加强免疫一次，共加强免疫3次，第1次加强免疫后收集鸡蛋，收集未免疫蛋作为阴性对照品，连续收集1.5个月(收集的鸡蛋编号)，存放于4℃；首次免疫采用福氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；
(2)将步骤(1)收集的鸡蛋清洗消毒后打破，用蛋黄分离器小心分离卵黄；用8倍卵黄体积的纯化水溶解稀释卵黄，40℃搅拌45min，得到溶解液；然后加入按溶解液计终浓度为20g/l的硅藻土和1.3倍溶解液体积的乙醇(预先冷却至15℃以下)，调节ph值至7.5，搅拌30min，过滤弃去残渣，得到清液；
(3)向步骤(2)制得的清液中加入按溶解液计终浓度为20g/l的硅藻土和2倍溶解液体积的乙醇(预先冷却至15℃以下)，调节ph值至5.4，搅拌30min，过滤弃去清液，得到固体组分；在固体组分中加入8倍固体组分质量的纯化水溶解，40℃搅拌45min，过滤弃去残渣，得到清液；将清液用超滤器进行超滤浓缩，浓缩倍数为5倍，得到卵黄抗体溶液；卵黄抗体溶液除菌过滤无菌冻干，得到抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体。
实施例5抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体的效价分析
elisa间接酶联免疫实验，将实施例1制得的重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶用包被液稀释至10μg/ml，elisa板每孔包被100μl，用封膜覆盖96孔酶标板，37℃温育2h，然后甩干孔中液体，用pbst洗涤1次，吸水纸拍干；每孔加入100μl30mg/ml脱脂奶粉进行封闭，置37℃温育1h，然后甩干孔中液体，用pbst洗涤3次(每次洗涤后留置4min)，用吸水纸拍干；pbst洗板后加入实施例2制得的抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体的倍比稀释液(1:160～1:10240)，100μl/孔加入酶标反应板中，最后一行加入pbs作为空白对照，37℃温育1h，甩干，用pbst洗涤3次(每次洗涤后留置4min)，吸水纸拍干；每孔加入l:3000的兔抗鸡igy-hrp抗体(promegacorporation)100μl，置37℃温育1h。甩干，用pbst洗涤3次(每次洗涤后留置4min)，然后用吸水纸拍干；每孔加入新鲜配制的底物液(10mg3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(tmb)溶于5ml无水乙醇，用4.5ml蒸馏水稀释，再加5ml磷酸柠檬酸缓冲液，加样前再加入10μl双氧水)100μl，置37℃温育15min，然后每孔加入50μl2mol/lh2so4终止反应。将酶标板置酶标仪490nm长处测od值。吸光度od值在对照2倍以上为阳性标准，测定抗体滴度。结果表明，实施例2制得的抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体的抗体滴度可达1:5120以上。
实施例6一种含抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体的酸奶
(1)准备原料：主要原料包括奶粉和抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体(实施例2制得)；
(2)配制乳液：称取奶粉125g，在奶粉中加入1000ml75℃的温开水配制成乳液；
(3)均质：将步骤(2)中的乳液在均质机上均质2min，均质机的压力保持在10mpa；
(4)灭菌：将步骤(3)中均质后的乳液在90℃的水浴锅中保温10min进行杀菌处理，然后将其冷却至40℃，得到料液；
(5)接种：在无菌条件下，加入无菌的抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体10mg，另将发酵剂，按照1g/1000ml的比例接种到料液中，并将其搅拌均匀，得到接种料液；
(6)发酵：在无菌条件下，将接种料液等量灌装于灭菌的玻璃瓶中并封口，然后将封口好的玻璃瓶放置于42℃恒温培养箱中发酵5h；
(7)后发酵：将步骤(6)中发酵后的玻璃瓶放入4℃的冰箱中进行后发酵，后发酵至少保持24h，得到含抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体的酸奶。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>广东工业大学
<120>编码重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的基因、卵黄抗体与应用
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