37个Y染色体STR基因座和一个Y-Indel的荧光复合扩增体系、试剂盒及其应用的制作方法

文档序号:15457571发布日期:2018-09-15 01:33
本发明属于生物检测
技术领域
,用于检测人体基因组中的短串联重复序列基因座多态性,具体地,本发明涉及37个Y染色体STR基因座和1个Y-Indel的荧光复合扩增体系、试剂盒及其应用。
背景技术
:人类Y染色体特异的短串联重复序列即Y-STR(shorttandemrepeat,STR),为人类男性所特有,按父系单倍型遗传,在法医学亲子鉴定和个体识别、人类种群学、类起源和进化研究中具有独特的应用价值,在无创伤性产前基因诊断的研究工作中也具有重要应用前景。Y-STR检验技术是作为常染色体STR检验技术的一种补充手段。此技术在对嫌疑人进行家系排查,父系亲权鉴定,男女混合成份中男性成份的检测以及多个男性混合成份的判定方面有着十分重要的应用价值,正日益受到公安机关侦查部门的重视。Y染色体上的STR基因座数目较多,鉴于如此多的选择,公安部发布了20个核心STR基因座和15个优选基因座以及一些备选基因座。目前,市面上现有的试剂盒位点数都较少,还没有同时包含这35个基因座的复合扩增体系,累积个体识别力和累积非父排除率仍有待进一步提高。技术实现要素:为了克服上述不足,本发明对男性人群的Y-STR基因座的遗传多态性进行了深入的研究,目的在于提供一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增体系、试剂盒及其应用,本发明所提供的试剂盒可以应用在法医鉴定及亲子鉴定等领域中。本发明采用6色荧光,包括了中国公安部公布Y建库指导要求的20个核心基因座和全部的15个优选基因座,此外还包含1个多拷贝位点(DYF404S1)、1个适于中国人群的Y-indel,将其应用于建库工作,得到的数据可以和公安部DNA数据库完美比对,从而大大提高DNA数据库的应用效率,单倍型分析的识别能力,具有更高的个体识别率。本发明所采取的技术方案为:37个Y染色体STR基因座和1个Y-Indel的荧光复合扩增体系,包括34对特异引物,能同时扩增37个Y染色体STR基因座和1个Y-Indel:DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYF387S1a/b、DYS627、DYS449、DYS518、DYS444、DYS447、DYS596、DYF404、DYS527a/b、DYS557和Y-Indel,所述34对特异性荧光引物及浓度如下表1(各引物序列依序与SEQNO.1-68对应):表1特异性荧光引物及各引物浓度其中,每个基因座对应的引物对中,上排为正向引物,下排为反向引物;基因座DYS385a/b、DYF387S1、DYF404S1、DYS527a/b分别具有2个等位基因,两等位基因对应的引物对相同。所述扩增体系中的被扩增基因座分别由五种颜色的荧光标记组成,相同的荧光标记视为同一组,五组组合分别为:Y-Indel、DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS444为第一组,采用FAM标记;DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS449为第二组,采用HEX标记;DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS438、DYS447、DYS596为第三组,采用L552标记;DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYS518为第四组,采用LR600标记;DYS576、DYF404S1、DYS387S1a/b、DYS627、DYS527a/b、DYS557为第五组,采用TET-592标记。所述荧光标记位于特异引物对中其中一条引物的5’端。由34对引物扩增各STR基因座,复合扩增采用聚合酶链式反应。所述扩增体系中还含有基因座的等位基因分型标准物。所述等位基因分型标准物采用橙色标记物QD550标记。一种试剂盒,包括上述任一扩增体系。上述扩增体系或试剂盒在法医DNA分析、亲自鉴定中的应用,所述应用为采用上述扩增体系或试剂盒用于检测DNA样本。所述的扩增产物可用ABI系列的遗传分析仪进行检测。所述DNA样品可来源于人血液、血痕、精液、精斑、唾液、体液、毛发、肌肉、组织、指甲等。所述DNA样品可用试剂盒法、酚氯仿抽提法、Chelex-100法、磁珠法进行DNA提取处理。更具体的技术方案包括:(一)Y染色体STR基因座的确定本发明对男性人群的Y-STR基因座的遗传多态性进行了深入的研究,同时结合了公安部公布的20个核心基因座和15个优选基因座,在此基础上,还增加了一个Y-Indel和DYF404S1。Y-Indel为一个插入缺失位点,此位点的加入有50%的机会可以100%排除是否为同一个家系。新增的DYF404S1,是一个高突变多拷贝基因座,提高了累计个体识别力和累积非父排除率。本发明目的在于提供一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增体系、试剂盒及其应用,本发明所提供的试剂盒可以应用在法医鉴定及亲子鉴定等领域中。(二)六色荧光标记的确定本发明采用了六色荧光标记技术,将上述37个Y染色体STR基因座和1个Y-Indel分成五组,Y-Indel、DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS444用FAM标记;DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS449用HEX标记;DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS438、DYS447、DYS596用L552标记;DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYS518用LR600;DYS576、DYF404S1、DYS387S1a/b、DYS627、DYS527a/b、DYS557用TET-592。(三)本发明进一步提供了37个Y染色体STR基因座和1个Y-Indel的特异性寡核苷酸扩增引物对,共34对引物。(四)37个Y染色体STR基因座和1个Y-Indel等位基因范围、Genbank登记号、参考序列见表2:表237个Y染色体STR基因座和1个Y-Indel的等位基因范围、Genbank登记号、参考序列本发明所提供试剂盒的优越性见表3,其中“+”指的是可以识别该STR基因座,空格为不能识别该STR基因座,本发明的扩增体系可以识别37个Y染色体基因座和1个Y-Indel,而其它试剂盒均只能识别部分基因座。表3本发明所提供试剂盒与国内外试剂盒比较本发明所提供的DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYF387S1a/b、DYS627、DYS449、DYS518、DYS444、DYS447、DYS596、DYF404、DYS527a/b、DYS557和Y-Indel。这37个Y染色体STR基因座和1个Y-Indel包含Yfiler、PPY23和YfilerPlus的所有位点,同时也包含了公安部的20个核心基因座及15个优选基因座,除此之外还包含1个Y-Indel位点和一个DYF404S1特有位点,提高了累积个体识别力和累积非父排除率。本发明兼容性好,包含22个常规位点DYS393,DYS19,DYS392,DYS549,YGATAH4,DYS460,DYS458,DYS481,DYS635,DYS448,DYS533,DYS456,DYS389I,DYS390,DYS389II,DYS438,DYS391,DYS439,DYS437,DYS385ab,DYS643,包含Yfiler和PP23的所有位点,也包含公安局的20个核心位点和15和优选位点。包含9个快速突变型位点DYS570,DYS576,DYS627,DYF387S1,DYS449,DYS518,DYS527a/b,DYF404S1。包含10个基因座的扩增片段小于220bp的miniSTR基因座,这10个基因座分别为DYS393、DYS570、DYS460、DYS458、DYS456、DYS389I、DYS391、DYS439、DYS576、DYF404S1。具有更高的个体识别力,快速突变型位点的加入提高了个体识别力。具有更高的适用性,适用于多种免提取检材,血卡、血纱布、FTA卡、血滤纸、唾液卡、新鲜全血、头发等均可以直接扩增。快速高效,1.5h完成扩增。总之,本发明具有如下优点:(1)更高的累积个体识别力和累积非父排除率,应用该体系对1000个无关男性个体进行检测,共检测出998个单倍型,个体识别力达到99.8%。所有基因座的非父排除率TGD=1,累积个体识别率和累积非父排除率相等。(2)物种特异性强:应用该体系扩增了包括鸡、猪、羊、牛、鼠、猫、狗、兔子、马、鹿以及大肠杆菌等物种的DNA样本,均没有检测出特异性扩增;(3)混合样本的检测:在男性DAN模板和女性DNA模板的比例达到1:500时,仍能有效检测出37个Y染色体STR基因座和1个Y-Indel,无任何基因座丢失。附图说明图1为随机模板扩增效果图;图2为其他物种的扩增效果图;图3为正常男性模板A的扩增效果图;图4为正常男性模板A以1:500的比例与女性模板B混合的扩增图;图5为等位基因标准物的分型图。具体实施方式下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。实施例137个Y染色体STR基因座和1个Y-Indel的选择、荧光标记组合以及引物设计本产品在基因座选择上,融合了公安部的20个核心基因座和15个优选基因座,同时增加了一个Y-Indel位点,还包含一个特有位点DYF404S1。将37个基因座和1个Y-Indel分成五组,通过反复多次实验验证后,确定最优荧光染料组合方案,Y-Indel、DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS444用FAM标记;DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS596用HEX标记;DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS438、DYS447和DYS596用L552标记;DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYS518用LR600标记;DYS576、DYF404S1、DYF387S1、DYS627、DYS527a/b、DYS557用TET-592标记。针对上述每个基因座设计一对引物,单对引物进行扩增实验,确保不会引起非特异扩增后,34对引物复合扩增,重新设计可能引起非特异的引物,直到体系中无非特异扩增出现,根据引物对效率的高低调整复合扩增体系中引物的浓度(表1和表2)。本发明采用特殊的缓冲液进行PCR扩增,如表4所示。表4反应缓冲液(5*MasterMixIII)配方成分单位缓冲液中的浓度KClM0.01MgCl2M0.002Tris-HClM0.055BSAmg/ml0.8dNTPmM0.2(NH4)2SO4mM0.01DMSO%5乙二醇%8Na4P2O7mM1Taq酶U2本发明进行了扩增祖峰优化和热循环参数的优化,由此确定本发明推荐使用的反应体系和热循环参数,如表5和表6所示。表5反应体系表6热循环参数实施例2扩增产物的毛细管电泳检测在检测前,对产物进行变性处理并与分子量内标混合,1ul产物+0.5ul分子量内标+8.5ul的HIDI(去离子甲酰胺),混匀后短暂离心,95℃变性5min后立即冰浴10min,用ABI系列遗传分析仪进行电泳检测,如图1。从图中可以看出,每个基因座都可以准确分型,特异性较好,未出现非特异条带,各个基因座的峰高均衡性也较好。实施例3物种特异性实验取猪、牛、羊、鸡的模板进行扩增,检测37个Y染色体STR基因座和1个Y-Indel复合扩增体系的物种特异性,结果如图2所示。通过对其他物种的扩增,扩增不出条带,说明34对引物的种属特异性较好。实施例4混合模板扩增能力验证纯净男性模板编号A;纯净女生编号B。将A和B分别按照1:500的比例进行混合扩增。图3分别为正常男性模板A扩增效果图;图4为正常男性模板A和B分别以1:500的比例与女性模板混合的扩增图(即500ng女性DNA模板存在时1ng男性DNA模板的扩增结果图),由图可以得出:即使在存在大量女性模板的情况下,也能准确对微量的男性模板进行准确分型。各基因座等位基因标准物根据各基因座PCR产物片段长度大小设计并制备等位基因分型标准物,如表7。表7基因座等位基因标准物信息基因座荧光标记物颜色片段长度范围等位基因范围Y-Indel蓝69-811-2DYS393蓝103-1477-18DYS570蓝157-21710-25DYS19蓝229-2699-19DYS392蓝282-3304-20DYS549蓝342-3827-17DYSH4蓝392-4328-18DYS444蓝440-47511-15DYS460绿93-1177-13DYS458绿127-18310-24DYS481绿190-23816-32DYS635绿249-30115-28DYS448绿317-37714-24DYS533绿388-4287-17DYS449绿419-49024-37DYS456黄85-13311-23DYS389Ⅰ黄149-1819-17DYS390黄189-24515-29DYS389Ⅱ黄255-29924-35DYS438黄307-3576-16DYS447黄380-44715-30DYS596黄454-49511-17DYS391红84-1285-16DYS439红137-1816-17DYS437红193-22511-19DYS385a/b红239-3237-28DYS643红343-3986-17DYS518红402-49031-50DYS576紫85-15011-23DYF404S1紫160-20011-17DYF387S1紫226-28430-45DYS627紫292-35611-27DYS527a/b紫370-43518-29DYS557紫440-48911-22等位基因标准物的分型图见图5。本发明中的等位基因标准物为分型的标准,将目前找到的频率较高的分型集合到一起,用于对个人进行分型鉴定。上述实施例仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本
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的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和等同替换,这些对本发明权要求进行改进和等同替换后的技术方案,均落入本发明的保护范围。序列表<110>苏州阅微基因技术有限公司<120>37个y染色体str基因座和1个y-indel的荧光复合扩增体系、试剂盒及其应用<130>xhx2018021201<141>2018-02-12<160>68<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>1agttatgttttatttgtcatt21<210>2<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>2aatgacaaataaaacataact21<210>3<211>23<212>DNA<213>Homosapiens<400>3gatactctatactgtgtacagct23<210>4<211>22<212>DNA<213>Homosapiens<400>4tgaaatgcagatattccctatc22<210>5<211>20<212>DNA<213>Homosapiens<400>5tttgaagtttcatatttcag20<210>6<211>23<212>DNA<213>Homosapiens<400>6cagatacagacttttaagcttga23<210>7<211>22<212>DNA<213>Homosapiens<400>7ggaaatgttatctagtctgttg22<210>8<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>8ctttctgctcaatctcaacta21<210>9<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>9tgttgtgctggaatttaaacatacc25<210>10<211>23<212>DNA<213>Homosapiens<400>10gattttgtttatgtagatttggc23<210>11<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>11gatgtttcaggaccaaaatag21<210>12<211>22<212>DNA<213>Homosapiens<400>12ctattaactctaattctggagg22<210>13<211>22<212>DNA<213>Homosapiens<400>13ggagaatataaatgcttatcac22<210>14<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>14ttattagtcttttagcactctttac25<210>15<211>27<212>DNA<213>Homosapiens<400>15gtctctttaaaaaattcaaaaatttgg27<210>16<211>20<212>DNA<213>Homosapiens<400>16cggcctcccaaagttctggc20<210>17<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>17gtccctttaagaggagtctgc21<210>18<211>23<212>DNA<213>Homosapiens<400>18ctcaccagaaggttgcaagactc23<210>19<211>26<212>DNA<213>Homosapiens<400>19gtgatatagatagatagatatagatc26<210>20<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>20ttatagcagcaaaattcacagttgg25<210>21<211>23<212>DNA<213>Homosapiens<400>21caagaaggtgggttttagttggc23<210>22<211>24<212>DNA<213>Homosapiens<400>22tgtgttgtgtatacttcttcttcc24<210>23<211>26<212>DNA<213>Homosapiens<400>23ctacctaatatttatctatatcattc26<210>24<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>24aacaccagttagaggagatggaaag25<210>25<211>26<212>DNA<213>Homosapiens<400>25caaacattggactctaattttttcag26<210>26<211>20<212>DNA<213>Homosapiens<400>26gcccaaaacttcttaaactg20<210>27<211>28<212>DNA<213>Homosapiens<400>27ctatctatctatctatctatcattatac28<210>28<211>23<212>DNA<213>Homosapiens<400>28ttccagacattgccaagtgttac23<210>29<211>24<212>DNA<213>Homosapiens<400>29cacctatcatctacctaatctgtc24<210>30<211>23<212>DNA<213>Homosapiens<400>30ttccagacattgccaagtgttac23<210>31<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>31ggatgggaaatgatgtttctgaatc25<210>32<211>23<212>DNA<213>Homosapiens<400>32cttcagtatgttacgtttactac23<210>33<211>22<212>DNA<213>Homosapiens<400>33gcaagccattaaggaaattgtc22<210>34<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>34ccgaagtcatacaatgcaaatgatg25<210>35<211>24<212>DNA<213>Homosapiens<400>35gccaagcacagtgggtcatgccag24<210>36<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>36ccgaagtcatacaatgcaaatgatg25<210>37<211>26<212>DNA<213>Homosapiens<400>37ccctgggatcctgctcaacatcctac26<210>38<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>38ccgaagtcatacaatgcaaatgatg25<210>39<211>24<212>DNA<213>Homosapiens<400>39gggtagattgtaaaaattttctcc24<210>40<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>40ccgaagtcatacaatgcaaatgatg25<210>41<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>41ctatctatcatctgtgaatgacagg25<210>42<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>42tagagacggggtttccttatgttgg25<210>43<211>22<212>DNA<213>Homosapiens<400>43gatcagcctggacaacataatg22<210>44<211>24<212>DNA<213>Homosapiens<400>44gccaggagctattttattgtgagc24<210>45<211>26<212>DNA<213>Homosapiens<400>45gcacaggtgcagtcatagctgtctgc26<210>46<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>46atgtatactacttcagtgatggtgc25<210>47<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>47tgtgtatcagtgctggtgccacagt25<210>48<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>48ctgaccaacacagtgaaactccact25<210>49<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>49ggatggggaggttgcagtaagcaca25<210>50<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>50cttccttctttccttccttacttcc25<210>51<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>51ctatgaatattttcccttaacttgt25<210>52<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>52gctactcaggaggctgaggccggat25<210>53<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>53tctttccttcttttccctccttcct25<210>54<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>54ctgggcaacacaagtgaaactgctt25<210>55<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>55ctcttctccactttaaccagtatac25<210>56<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>56tgtatactgtattattacaataaag25<210>57<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>57ttgaggacatgcctgtgctacaact25<210>58<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>58tcacatctacctgtgacctgcaagc25<210>59<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>59tctttcagtcttatttgtctgttcc25<210>60<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>60tgttttctagtgagagaaagtctcc25<210>61<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>61ttaaataaacttcttaaattgtaac25<210>62<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>62gagaggctgcagactgcagtgagcc25<210>63<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>63tctttccttcttttccctccttcct25<210>64<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>64caaagttacttttataatcaaattg25<210>65<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>65ggtggattggtgactctcagacctt25<210>66<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>66atatgttctaatgcaccttgaggga25<210>67<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>67tgagcaagaaaaatagtacccaaat25<210>68<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>68tcatt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