本申请要求于2017年3月3日提交的美国临时申请号62/466,586的优先权权益，所述临时申请的全部内容通过引用结合在此。
背景技术：
注意力缺陷/过动症(adhd)是常见的儿童及青少年精神障碍，特征为不专注、活动过度以及易冲动。其影响了全世界大致3％至10％的学龄儿童，adhd儿童中超过一半与病症持续抗争直至成年。早期且准确的诊断出adhd是改善患者整个生命周期中的功能性损伤的关键。
adhd的诊断是基于对行为迹象的观察以及患者或其家人的口头报告，这容易有偏差。关于adhd诊断的可靠性和有效性一直存在争议。
存在鉴定生物标志(尤其是以体内以及非侵入性的方式可测量的生物标志)以准确诊断adhd并促进开发新治疗策略的未满足的需要。本发明满足了这一需要以及其他需要。
技术实现要素：
在一个实施方案中，本发明涉及用于检测受试者的adhd的方法，包括测量所述受试者的测试样品中以下mirna中的至少一种的表达水平的步骤：mir140-3p(seqidno:1)、let-7g-5p(seqidno:2)、mir-486-5p(seqidno:3)、mir-151a-3p(seqidno:4)、mir-151a-5p(seqidno:5)、mir-126-5p(seqidno:6)、mir-30e-5p(seqidno:7)、mir-223-3p(seqidno:8)、mir-142-5p(seqidno:9)、mir-27a-3p(seqidno:10)、mir-101-3p(seqidno:11)、mir-150-5p(seqidno:12)以及mir-92a-3p(seqidno:13)，以及与无adhd样品中相应mirna的表达水平进行比较，其中相对于无adhd样品中相应mirna的表达水平，测试样品中以下mirna的较高表达水平指示所述受试者患有adhd：let-7g-5p、mir-486-5p、mir-126-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、mir-27a-3p、以及mir-92a-3p，其中相对于无adhd样品中相应mirna的表达水平，测试样品中以下mirna的较低表达水平指示所述受试者患有adhd：mir140-3p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-142-5p、mir-101-3p、以及mir-150-5p。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于检测adhd的方法，包括测量所述受试者的测试样品中以下mirna中的至少两种的表达水平的步骤：mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-140-3p或mir-486-5p，以及与无adhd样品中相应mirna的表达水平进行比较，其中相对于无adhd样品中相应mirna的表达水平，测试样品中mir-126-5p和mir-486-5p的较高mirna表达水平指示所述受试者患有adhd，并且其中相对于无adhd样品中相应mirna的表达水平，测试样品中以下mirna中的至少两种的较低mirna表达水平指示所述受试者患有adhd：mir-151a-3p、mir-151a-5p以及mir-140-3p。
本发明提供了用于检测受试者的adhd的试剂盒，包含用于对所述受试者的测试样品中以下mirna中的至少一种进行测序或测量其表达水平的试剂：mir140-3p、let-7g-5p、mir-486-5p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、mir-142-5p、mir-27a-3p、mir-101-3p、mir-150-5p、或mir-92a-3p。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含指示所述试剂是用于测量mirna从而诊断adhd的标记，其中相对于无adhd样品中相应mirna的表达水平，测试样品中以下mirna的较高表达水平指示所述受试者患有adhd：let-7g-5p、mir-486-5p、mir-126-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、mir-27a-3p以及mir-92a-3p，其中相对于无adhd样品中相应mirna的表达水平，测试样品中以下mirna的较低表达水平指示所述受试者患有adhd：mir140-3p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-142-5p、mir-101-3p以及mir-150-5p。
还提供了用于检测受试者的adhd的试剂盒，包含第一试剂和第二试剂，其中，所述试剂用于对所述受试者的测试样品中以下mirna中的至少两种进行测序或测量其表达水平：mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-140-3p、或mir-486-5p。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含指示所述试剂用于测量mirna从而诊断adhd的标记，其中相对于无adhd样品中相应mirna的表达水平，测试样品中mir-126-5p和mir-486-5p的较高mirna表达水平指示所述受试者患有adhd，其中相对于无adhd样品中相应mirna的表达水平，测试样品中以下mirna中的至少两种的较低mirna表达水平指示所述受试者患有adhd：mir-151a-3p、mir-151a-5p以及mir-140-3p。
还提供了在制造用于检测受试者的adhd的试剂盒中对以下mirna中的至少一种进行测序或测量其表达水平的试剂：mir140-3p、let-7g-5p、mir-486-5p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、mir-142-5p、mir-27a-3p、mir-101-3p、mir-150-5p、以及mir-92a-3p。
此专利中所使用的术语“发明”、“本发明(theinvention)”、“此发明”以及“本发明(thepresentinvention)”旨在广泛地指此专利的主题和下面的专利权利要求书的所有。包含这些术语的陈述应被理解为不局限于本文中所描述的主题并且不局限于下面的专利权利要求书的意义或范围。此专利所涵盖的本发明的实施方案由下面的权利要求书而非本发明内容来限定。本发明内容是对本发明的各个方面的高级概括并且引入了在下面的发明详述部分被进一步描述的概念中的一些。本发明内容不旨在鉴定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不旨在被独立用于确定所要求保护的主题的范围。应当通过参考整个说明书的适当部分、任何或全部附图以及各个权利要求来理解本主题。
当与以下附图和详细说明一起读取时，本发明将变得更加明显。
附图说明
当结合随后的详细说明进行考虑时，通过参考附图可以得到对本发明更加完整的理解。附图中所展示的实施方案仅旨在例证本发明并且不应当被解释为将本发明局限于所展示的实施方案。
图1是流程图，展示了实施例的研究设计。
图2a至图2m是条形图，展示了使用qpcr分析而在adhd和对照样品中对于adhd和对照受试者差异表达的13种mirna(按照阈值循环δct测得)的表达水平：mir-140-3p(图2a)、let-7g-5p(图2b)、mir-30e-5p(图2c)、mir-223-3p(图2d)、mir-142-5p(图2e)、mir-486-5p(图2f)、mir-151a-3p(图2g)、mir-151a-5p(图2h)、mir-126-5p(图2i)、mir-27a-3p(图2j)、mir-101-3p(图2k)、mir-150-5p(图2l)、以及mir-92a-3p(图2m)。“**”和“*”分别表示p<0.01和p<0.05。
图3的图a和图b是用于区别低龄组(图a)和大龄组(图b)中的adhd受试者与非adhd(对照)受试者的adhd诊断模型(支持向量机(svm)分类模型)的接受者操作特性(roc)曲线。
图3的图c和图d是用于区分男性(图c)和女性(图d)中的adhd与非adhd(对照)的adhd诊断模型的roc曲线。
发明详述
如本文中所使用的，冠词“一个(a)”和“一个(an)”是指冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。
权利要求书中使用的术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指明是指仅替代方案或者替代方案是互相排斥的，但本公开支持仅是指替代方案以及“和/或”的定义。
如在此使用的，“患者”或“受试者”是指被诊断或怀疑患有或发展adhd的哺乳类受试者。示例性受试者可以是可能发展adhd的人类、猿、狗、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿动物以及其他哺乳动物。
如在本文中可互换使用的，“microrna”、“mir”或“mirna”是指来自mir基因的未经加工的(例如，前体)或经加工的(例如，成熟)rna转录物。microrna是负向调节真核生物的基因表达并且构成新一类基因调控因子的具有大约22个核苷酸的长度的内源非编码单链rna(chua等(2009年)curr.opin.mol.ther.(《分子疗法时论》)11：189-199)。已在不同的生物体中对单独的mirna进行了鉴定和测序，并且已给予了它们名称。本文中提供了mirna的名称及其序列。
本文中的所有数字可以理解为用“约”来修饰。如本文中所使用的，当指可测量值如时距等或范围时，术语“约”意指涵盖规定值的±10％的变化，因为这样的变化适于mirna水平的表达，除非另有规定。
用于诊断注意力缺陷/过动症(adhd)的方法
本发明部分基于对受试者的测试样品中的表达水平相对于无adhd样品中相应mirna的预定水平增大或减小的特定mirna的鉴定。本发明的一些实施方案涉及诊断受试者是否患有adhd或处于发展adhd的风险中的方法，所述方法包括测量受试者的测试样品中至少一种mirna的表达水平以及与无adhd或对照样品中相应mirna的表达水平比较。在一个实施方案中，相对于对照样品中的表达水平，测试样品中较高的mirna表达水平指示受试者患有adhd。在另一个实施方案中，相对于对照样品中的表达水平，测试样品中较低的mirna表达水平指示受试者患有adhd。
无adhd或对照样品中预先测定的mirna表达水平来自无adhd个体的代表池，并且是无adhd或对照样品中平均、中值或其他统计学上操纵的或以其他方式概括或聚集的代表性mirna表达水平。
在一个实施方案中，mirna表达水平呈现为阈值循环(ct)。ct被定义为报告染料的荧光信号与任意放置的阈值相交的聚合酶链反应(pcr)循环，并且通过以下文章中所公开的已知方法来确定：thomasdschmittgen和kennethjlivak的“analyzingreal-timepcrdatabythecomparativectmethod(通过比较ct法来分析实时pcr数据)”，natureprotocols(《自然实验手册》)，第3卷，第6期(2008年)，1101-1108以及caifuchen等的“real-timequantificationofmicrornasbystem-looprt-pcr(通过茎-环rt-pcr对microrna进行实时定量)”，nucleicacidsresearch(《核酸研究》)，2005年，第3卷，第20期，e179。在另一个实施方案中，mirna表达水平是通过本文中所公开的方法或本领域中已知的任何方法测得的定量mirna表达。在另一个实施方案中，使用本文中所描述的机器学习网络来比较adhd患者的mirna与无adhd或对照样品的预定mirna表达水平。
“较高”或“较低”mirna表达是相对术语并且可以通过比较测试样品中的mirna表达水平与来自已知无adhd的受试者(即，对照受试者)的参考池的mirna表达水平来确定。在一些实施方案中，测试样品中mirna水平的表达为高于来自无adhd受试者的参考池的mir表达水平1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或其间的任何％。在其他实施方案中，测试样品中mirna水平的表达为低于来自无adhd受试者的参考池的mir表达水平1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或其间的任何％。
在一个实施方案中，测量受试者的测试样品中以下mirna中的至少一种的表达水平以诊断adhd：let-7g-5p、mir-486-5p、mir-151a-5p、mir-140-3p、mir-126-5p、或mir-151a-3p。
在另一个实施方案中，测量受试者的测试样品中以下mirna中的一种或多种的表达水平以诊断adhd：mir140-3p、let-7g-5p、mir-486-5p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、或mir-142-5p。
在又另一个实施方案中，测量受试者的测试样品中以下mirna中的一种或多种的表达水平以诊断adhd：mir140-3p、let-7g-5p、mir-486-5p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、mir-142-5p、mir-27a-3p、mir-101-3p、mir-150-5p、或mir-92a-3p。
在一个示例性实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-140-3p的表达水平，并且相对于对照样品中的mir-140-3p水平，测试样品中较低的mir-140-3p水平指示受试者患有adhd。在另一个示例性实施方案中，测量受试者的测试样品中let-7g-5p的表达水平，并且相对于对照样品中的let-7g-5p水平，测试样品中较高的let-7g-5p水平指示受试者患有adhd。在又另一个示例性实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-486-5p的表达水平，并且相对于对照样品中的mir-486-5p水平，测试样品中较高的mir-486-5p水平指示受试者患有adhd。在第四实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-151a-3p的表达水平，并且相对于对照样品中的mir-151a-3p水平，测试样品中较低的mir-151a-3p水平指示受试者患有adhd。在第五实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-151a-5p的表达水平，并且相对于对照样品中的mir-151a-5p水平，测试样品中较低的mir-151a-5p水平指示受试者患有adhd。在第六实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-126-5p的表达水平，并且相对于对照样品中的mir-126-5p水平，测试样品中较高的mir-126-5p水平指示受试者患有adhd。在一些实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-30e-5p的表达水平，并且相对于对照样品中的mir-30e-5p水平，测试样品中较高的mir-30e-5p水平指示受试者患有adhd。在其他实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-223-3p的表达水平，并且相对于对照样品中的mir-223-3p水平，测试样品中较高的mir-223-3p水平指示受试者患有adhd。在其他实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-142-5p的表达水平，并且相对于对照样品中的mir-142-5p水平，测试样品中较低的mir-142-5p水平指示受试者患有adhd。在第十实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-27a-3p的表达水平，并且相对于对照样品中的mir-27a-3p水平，测试样品中较高的mir-27a-3p水平指示受试者患有adhd。在第十一实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-101-3p的表达水平，并且相对于对照样品中的mir-101-3p水平，测试样品中较低的mir-101-3p水平指示受试者患有adhd。在一些实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-150-5p的表达水平，并且相对于对照样品中的mir-150-5p水平，测试样品中较低的mir-150-5p水平指示受试者患有adhd。在另一个实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-92a-3p的表达水平，并且相对于对照样品中的mir-92a-3p水平，测试样品中较高的mir-92a-3p水平指示受试者患有adhd。
在又另一个实施方案中，测量受试者的测试样品中以下mirna中至少两种mirna的表达水平以诊断adhd：mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-140-3p或mir-486-5p。
在一个示例性实施方案中，测量受试者的测试样品中mirna-151a-3p和mir140-3p的表达水平，其中相对于对照样品中的表达水平，在测试样品中，mirna-151a-3p和mir140-3p的表达水平较低，指示受试者患有adhd。在另一个示例性实施方案中，测量受试者的测试样品中mirna-126-5p和mir140-3p的表达水平，其中相对于对照样品中的表达水平，在测试样品中，mirna-126-5p的表达水平较高并且mir140-3p的表达水平较低，指示受试者患有adhd。在又另一个示例性实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-151a-3p和mir-151a-5p的表达水平，其中相对于对照样品中的表达水平，在测试样品中，mirna-151a-3p和mir-151a-5p的表达水平较低、指示受试者患有adhd。在第四实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-151a-3p和mir-126-5p的表达水平，其中相对于对照样品中的表达水平，在测试样品中，mirna-126-5p的表达水平较高并且mir-151a-3p的表达水平较低，指示受试者患有adhd。在第五实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-126-5p和mir-486-5p的表达水平，其中相对于对照样品中的表达水平，在测试样品中，mirna-126a-5p和mir-486-5p的表达水平较高，指示受试者患有adhd。在第六实施方案中，测量受试者的测试样品中mir-151a-5p和mir-486-5p的表达水平，其中相对于对照样品中的表达水平，在测试样品中，mirna-486-5p的表达水平较高并且mir-151a-5p的表达水平较低，指示受试者患有adhd。在一些实施方案中，两个或更多个mirna表达水平的测量为adhd诊断提供了更高的准确度、灵敏度或特异度。
测量mirna表达的水平是指定量存在于样品中的mirna的量。测量任何mirna的表达水平可以使用本文中所公开的方法来实现，如通过实时pcr、northern印迹分析或本领域技术人员已知的任何技术。测量mirna的表达水平包括测量mirna的成熟形式或与mirna表达相关联的前体形式的表达。
在特定实施方案中，至少一种mirna的水平使用northern印迹分析来检测。例如，可以通过在核酸提取缓冲液的存在下均质化、之后离心来从细胞中纯化总的细胞rna。沉淀核酸，并且通过用dna酶处理以及沉淀来去除dna。然后，rna分子根据标准技术通过琼脂糖凝胶上的凝胶电泳进行分离并转移至硝酸纤维素滤器。然后rna通过加热固定到滤器上。使用与所讨论的rna互补的适当标记的dna或rna探针来完成特定rna的检测和定量。参见例如molecularcloning：alaboratorymanual(《分子克隆：实验室手册》)，j.sambrook等编辑，第二版，coldspringharborlaboratorypress(冷泉港实验室出版社)，1989年，第7章，其全部公开内容通过引用结合。
在一些实施方案中，期望使用微阵列。微阵列是使得能够对复杂生物化学样品进行平行分析的核酸、蛋白质、小分子、细胞或其他物质的微型有序阵列。可以使用多种技术来制作微阵列，包括利用尖细头针打印至载玻片上、使用预制的遮蔽物进行光刻、使用动态微镜装置进行光刻、喷墨打印或在微电极阵列上进行电化学。
例如，可以根据本领域中已知的任何方法来完成mirna的微阵列分析。在一个实施方案中，从细胞(如白细胞)或样品中提取rna，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从总rna中对小rna(18至26个核苷酸的rna)进行大小选择。寡核苷酸接头附接至小rna的5'和3'末端并且所得的连接产物用作rt-pcr反应(具有10个扩增循环)的模板。有义链pcr引物具有附接至其5'末端的荧光团，从而荧光标记pcr产物的有义链。使pcr产物变性并随后与微阵列杂交。pcr产物(被称为与阵列上的相应mirna捕获探针序列互补的靶核酸)将经由碱基配对来与附着有捕获探针的点杂交。然后，当使用微阵列激光扫描仪激发时，点将发出荧光。然后，使用多个阳性和阴性对照以及阵列数据归一化法，就特定mirna的拷贝数来估计每个点的荧光强度，这将产生特定mirna的表达水平的估量。
在一个实施方案中，微阵列包括用于对以下mirna中的一种或多种进行测序或测量的mirna特异的探针寡核苷酸：mir140-3p、let-7g-5p、mir-486-5p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、mir-142-5p、mir-27a-3p、mir-101-3p、mir-150-5p、mir-92a-3p或其组合。
在一些实施方案中，期望使用定量rt-pcr。定量rt-pcr(qrt-pcr)是用于迅速测量聚合酶链式反应的产物的量的经改进的pcr。qrt-pcr通常用于判定基因序列(如mirna)是否存在于样品中，并且如果其存在，确定样品中的拷贝数。可以确定核酸分子(包括mirna)的表达的任何pcr方法落在本公开的范围内。存在本领域中已知的qrt-pcr法的若干变型，包括但不限于经由琼脂糖凝胶电泳、sybr绿(双链dna染料)的使用以及荧光报道探针的使用。
未知生物机制中所涉及的adhd的一些可能的mirna生物标志可以使用全局筛选技术(如微阵列或下一代测序(ngs))来鉴定。ngs是示出了高灵敏度和低背景噪声的用于mirna表达谱的全局筛选技术并且可能发现尚未鉴定的adhd标志。
在adhd和非adhd受试者中差异表达的mirna的鉴定允许以多种方式使用此信息。例如，可以估计特定的治疗方案(例如，以便判定疗法对患有adhd的受试者是否有效)。类似地，可以通过对测试样品中的mirna表达水平与非adhd样品的已知表达谱进行比较来作出诊断或确诊。此外，这些mirna表达谱允许对抑制adhd中的mirna表达的药物候选物进行筛选或将不良预后谱转变成更好的预后谱。
在一个示例性实施方案中，提供了用于建立adhd特异的机器学习算法的方法，包括：(a)确定来自未患有adhd的受试者的参考池和患有adhd的受试者的参考池的以下mirna中的至少一种的δct值：mir140-3p、let-7g-5p、mir-486-5p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、mir-142-5p、mir-27a-3p、mir-101-3p、mir-150-5p、或mir-92a-3p；以及(b)将步骤(a)中的来自未患有adhd的受试者的参考池的mirna的至少一个δct值以及来自患有adhd的受试者的参考池的mirna的至少一个δct值登记到机器学习算法中；以及(c)使用步骤(b)中的机器学习算法来建立二分类模型(binaryclassificationmodel)。
机器学习网络的非限制性示例包括支持向量机(svm)、人工神经网络、决策树学习(例如，cart、id3、c4.5、chaid、mars以及条件推理树)、基于实例的学习(例如，k最近邻)、贝叶斯网络、遗传算法以及集成学习(例如，装袋和推进)。
用于诊断注意力缺陷/过动症(adhd)的试剂盒
本发明还提供了用于诊断adhd的试剂盒。在一个示例性实施方案中，试剂盒包含用于在需要诊断adhd的受试者的测试样品中对选自以下的一种或多种mirna进行测序或测量其表达水平的至少一种试剂(agent)：mir140-3p、let-7g-5p、mir-486-5p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、mir-142-5p、mir-27a-3p、mir-101-3p、mir-150-5p以及mir-92a-3p。在另一个实施方案中，试剂盒包含用于对需要诊断adhd的受试者的测试样品中以下mirna中的至少两种进行测序或测量其表达水平的至少两种试剂：mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-140-3p或mir-486-5p。
如果相对于无adhd样品中相应mirna的表达水平，测试样品中以下mirna表达水平较高：let-7g-5p、mir-486-5p、mir-126-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、mir-27a-3p或mir-92a-3p，则使用试剂盒诊断出adhd。如果相对于无adhd样品中相应mirna的表达水平，测试样品中以下mirna表达水平较低：mir140-3p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-142-5p、mir-101-3p或mir-150-5p，则使用试剂盒诊断出adhd。测试样品的非限制性示例包括体液(例如，血清、血液以及脑脊液)、细胞(例如，白细胞)以及组织(脑活检)。
在一个实施方案中，试剂盒进一步包括使用试剂盒来诊断adhd的说明书。在另一个实施方案中，试剂是rt-pcr。在另一个实施方案中，试剂是特定用于对seqidno:1至seqidno:13mirna中任何mirna进行测序或测量的探针寡核苷酸。该试剂可以是本领域中已知的用于测量seqidno:1至seqidno:13mirna的表达水平的试剂。
本发明的实施方案通过以下实施例来展示，所述实施例不应被以任何方式解释为对本发明的范围强加限制。相反地，应清楚地理解，可以诉诸各种其他的实施例、修改及其等效方案，在阅读了本文中的说明书后、在不偏离本发明的精神的情况下，本领域技术人员可以想到所述实施例、修改及其等效方案。在以下实施例中所描述的研究期间，除非另外说明，否则遵循常规程序。下面出于说明性目的描述了所述程序中的一些程序。
实施例中使用的材料和方法的说明
研究参与者：研究方案由台湾高雄长庚纪念医院(kaohsiungchanggunghospital)的机构审查委员会(irb)批准。在台湾高雄长庚儿童医院(kaohsiungchanggungchildren'shospital)的儿童精神病学门诊部对符合条件的患有adhd的患者进行治疗并且从同一家医院招募对照(无adhd)受试者进行此研究。
研究的入选标准为(a)由高级儿童精神病学专家在基于《中文版学龄儿童情感障碍和精神分裂症评分表(scheduleforaffectivedisordersandschizophreniaforschool-agechildren)(流行病学版)》(k-sads-e)进行结构化面谈之后基于《精神障碍诊断和统计手册(diagnosticandstatisticalmanualofmentaldisorders)(第四版文本修订)》(dsm-iv-tr)的标准进行adhd临床诊断；(b)年龄在6岁至16岁之间；(c)中国汉族人；以及(d)之前未进行过adhd药物治疗。如果患者有重大生理疾病(如遗传、代谢或感染病症)或神经精神性疾病史(如智力残疾、自闭症谱系障碍、双相型障碍、重性抑郁障碍、精神病性障碍、物质使用障碍、癫痫或重型颅脑损伤)，则排除这些患者。
对照受试者是无任何重大生理疾病或前述重大神经精神性疾病的在6岁至16岁之间的未患有adhd的中国汉族儿童。
图1是流程图，示出了研究设计。基于五位adhd患者和五位对照受试者的血液样品进行初步研究，并且使用ngs技术，20种mirna被鉴定为adhd的可能生物标志。
基于从68位adhd患者和54位对照受试者采集的血液样品的训练集(trainingset)用于建立基于mirna的adhd诊断模型。基于从15位adhd患者和15位对照受试者采集的血液样品的测试集用于进一步验证训练集中所鉴定的基于mirna的adhd诊断模型。
采集测试样品并提取rna样品
从每位受试者采集大约5ml血液。以3000rpm将全血样品离心10分钟，之后添加红细胞(rbc)裂解缓冲液(台湾芮宝生医股份有限公司(rbcbioscience))去除rbc。用mirvanamirna分离试剂盒(美国生命科技(lifetechnology))来处理无rbc样品从而从白细胞(wbc)中提取总的rna。使用agilent2100(美国安捷伦科技(agilenttechnologies))来确定rna的完整性。排除具有小于8的rna完整性指数(rin)的rna样品。
adhd和无adhd样品中的mirna谱的评估
在初步研究中，均匀混合五位adhd患者和五位对照受试者的rna样品从而分别生成合并的adhd库和合并的对照库。两个合并的rna库用truseq小rna制备试剂盒(美国依诺米那(illumina))来制备并且用miseq(依诺米那)来测序，之后通过mirseq分析来鉴定用于adhd诊断的20种mirna候选物。
mirna的实时qpcr验证
实时定量逆转录pcr(qrt-pcr)用于确定所有已登记的受试者的血液样品中20种mirna的表达谱。taqmanmicrorna转录试剂盒(美国应用生物系统公司(appliedbiosystems))用于制备rna样品。根据制造商的说明书在veriti96孔热循环仪(应用生物系统公司)上进行逆转录反应。实时pcr循环条件如下：95℃、10分钟，之后进行40个循环(在95℃下15秒以及在60℃下1分钟)。mirna表达丰度通过δct值来确定，其中，小核仁rnau44作为内源对照。
临床测量
在被设计用于降低测试条件下的可变性的房间中，由高级精神病学专家使用k-sads-e诊断工具并且由ad儿童心理学专家使用韦克斯勒儿童智力量表——第四版(wisc-iv)对所有的adhd受试者和对照受试者进行采访。swanson，nolan及pelham第iv版量表(snap-iv)父母版和snap-iv教师版分别由受试者的父母和教师来完成。由临床医生使用adhd评定量表(adhd-rs)对受试者进行采访。
统计分析
使用统计软件包spss16.0版(美国伊利诺伊州芝加哥spss有限公司)和medcalc软件15.11.4版来分析数据。变量呈现为平均值(标准偏差)或频率。小于0.05的双尾p值被视为具有统计学显著性。
用于支持向量分类、回归以及分布估计的集成软件，支持向量机库(libsvm)，用于开发adhd特异的svm对准模型以便基于mirna表达来区分对照受试者与adhd受试者。接受者操作特性(roc)曲线和曲线下面积(auc)用于估计libsvm所产生的概率评分的特异度和灵敏度两者。在概率评分0.5的截止值下评估特征的最佳诊断点。执行皮尔森相关(pearsoncorrelation)来分析adhd患者的概率评分与adhd症状之间的关系。
结果
ngs的mirna表达谱
ngs的mirna表达谱表明，18种候选mirna在adhd患者与对照之间差异表达。候选mirna被定义为：(1)adhd组或对照组中大于1,000的tpm(每百万转录)；(2)adhd患者/对照受试者的mirna之比大约高于1.50或低于0.67。基于之前的研究数据，mir-181a-5p和let-7d也被视为可能生物标志。总共20种候选mirna用作adhd的诊断生物标志：mir-29a-3p、mir-142-3p、mir-140-3p、mir-423-3p、mir-192-5p、mir-27a-3p、mir-101-3p、mir-150-5p、let-7g-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、mir-142-5p、mir-143-3p、mir-92a-3p、mir-486-5p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-181a-5p、以及let-7d。
qpcr验证
对训练集的所有样品的qpcr验证表明，以下9种mirna的表达水平在训练集中adhd受试者与非adhd受试者之间显著不同：mir140-3p、let-7g-5p、mir-486-5p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、mir-126-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、以及mir-142-5p(图2a至图2i)。图2j至图2m表明，mir-27a-3p、mir-101-3p、mir-150-5p以及mir-92a-3p的表达水平在训练集的adhd与非adhd受试者之间是不同的(0.1>p>0.05)。
adhd诊断模型
为了得到更加稳健的诊断模型，以下13种mirna的表达水平的组合用于开发使用svm算法的adhd诊断模型(此后的“adhd诊断模型”)：mir-140-3p、mir-27a-3p、mir-101-3p、mir-150-5p、let-7g-5p、mir-30e-5p、mir-223-3p、mir-142-5p、mir-92a-3p、mir-486-5p、mir-151a-3p、mir-151a-5p、以及mir-126-5p。多变量协方差分析确认这13种mirna的表达不被年龄、性别或智商混淆。为了得到最好的区别效度，5倍交叉验证用于得到最佳参数，γ＝0.015625并且成本(cost)＝256。使用0.5的默认概率截止(probabilitycutoff)，当与内科医生作出的adhd诊断(黄金标准)相比时，adhd诊断模型具有86.8％的灵敏度和88.9％的特异度，导致曲线下面积(auc)的值为0.94(p<0.001)。
另外，特定mirna的组合在adhd诊断准确度(auc)中导致了意外的协同作用，如表1所示。
表1.adhd诊断中所使用的mirna的auc。
对测试集中的15位adhd受试者和15位对照受试者进行独立盲测。adhd患者与对照受试者在年龄、性别或智商方面不存在显著差异。使用adhd诊断模型来分析测试集(testingset)中的30位受试者的13种mirna的δct。15个adhd样品中的13个被正确诊断为患有adhd并且15位对照受试者中的11位被正确分类为非adhd，展示了86.7％的灵敏度、73.3％的特异度以及80％的准确度。
adhd诊断模型的进一步验证
训练集和测试集中的受试者被合并到一起进行附加的灵敏度分析。受试者被分为低龄组(≤108个月)和大龄组(>108个月)，并且roc分析表明，adhd诊断模型的概率评分有效地区分了两个年龄组中的adhd受试者与非adhd受试者(图3a，auc：0.92，p<0.001，并且图3b，auc：0.91，p<0.001)。另外，受试者被分为男性和女性，并且roc分析表明，adhd诊断模型的概率评分有效地区分了男性(图3c，auc：0.90，p<0.001)和女性(图3d，auc：0.93，p<0.001)adhd受试者与非adhd受试者。皮尔森相关表明，adhd诊断模型的概率评分与由父母(r＝0.485,p<0.001)、教师(r＝0.507,p<0.001)或临床医生(r＝0.632,p<0.001)评定的不专注症状以及由父母(r＝0.473,p<0.001)、教师(r＝0.380,p<0.001)或临床医生(r＝0.613,p<0.001)评定的过动/冲动症状正相关。
据报道，若干mirna(如mir124-1和let-7d)可能与adhd相关联。基于文献综述或mirna数据库，这些mirna因为在adhd的神经生物学机制中起作用而因此被鉴定出来。本发明的用于构建adhd诊断模型的13种mirna未曾报道涉及adhd的病理生理学，并且通过全局筛选技术(ngs)进行鉴定。
seqidno:1(hsa-mir-140-3p)
uaccacaggguagaaccacgg
seqidno:2(hsa-let-7g-5p)
ugagguaguaguuuguacaguu
seqidno:3(hsa-mir-486-5p)
uccuguacugagcugccccgag
seqidno:4(hsa-mir-151a-3p)
cuagacugaagcuccuugagg
seqidno:5(hsa-mir-151a-5p)
ucgaggagcucacagucuagu
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cauuauuacuuuugguacgcg
seqidno:7(hsa-mir-30e-5p)
uguaaacauccuugacuggaag
seqidno:8hsa-mir-223-3p
ugucaguuugucaaauacccca
seqidno:9(hsa-mir-142-5p)
cauaaaguagaaagcacuacu
seqidno:10(mir-27a-3p)
uucacaguggcuaaguuccgc
seqidno:11(mir-101-3p)
uacaguacugugauaacugaa
seqidno:12(mir-150-5p)
ucucccaacccuuguaccagug
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uauugcacuugucccggccugu
序列表
<110>长庚医疗财团法人高雄长庚纪念医院
<120>用于检测注意力缺陷/过动症的方法和试剂盒
<130>cgmfk-17001-twi
<150>us62/466,586
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