本发明属于基因辅助选择技术领域，具体涉及一种玉米c型细胞质雄性不育育性恢复基因rf4位点紧密连锁分子标记及其应用。
背景技术：
玉米是世界上三大粮食作物之一，在社会发展中占有重要地位。近年来，杂种优势的应用使得玉米产量有了大幅的提高，而细胞质雄性不育（cms）的利用则是实现杂种优势利用的一条有效途径。雄性不育的利用在降低生产成本，提高种子纯度等方面起到了积极的作用。玉米细胞质雄性不育(malesterility)是指玉米在生长发育过程中雄穗不能产生正常的花药、花粉或雄配子，而雌穗发育正常，能接受正常花粉而受精结实的遗传现象。表现雄性不育的植株，其雄配子在形成过程中由于受某种生理机理的调控，导致雄配子的败育，而雌配子发育正常，所以只有被授以其它植株的正常花粉才能完成正常的受精结实。因此，植物的雄性不育在配制杂交种、利用杂种优势上具有重要价值。玉米属于雌雄同株，常异花授粉作物，天然异交率在90%以上，所以在用可育亲本配制玉米杂交种时，需要进行人工去雄。如果去雄不及时、不彻底，就会导致种子混杂。利用玉米细胞质雄性不育系配制杂交种，不仅可以提高种子纯度、降低种子生产成本，还可以提高杂交种的产量、增加对抗病性的遗传弹性。
分子标记辅助选择（marker-assistedselection，mas）是指利用分子标记对目的基因或性状进行选择。分子标记辅助选择不受时间和环境条件的限制，可以直接对性状的基因型进行选择，提高了育种效率，缩短了育种进程，因而越来越受到育种工作者的重视和应用。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种分子标记，其与玉米c型细胞质育性恢复基因rf4位点紧密连锁，可对其进行辅助选择，用于不育化制种，节省大量的人力、物力，加快了恢复系的转育。
为解决以上技术问题，本发明通过以下技术方案实现：
本发明玉米c型细胞质雄性不育育性恢复基因rf4位点，位于玉米第8号染色体，该基因位点能完全恢复c型细胞质雄性不育系的育性。与该恢复基因rf4位点紧密连锁的分子标记为x-21-1(seqidno.5)和x33(seqidno.6)，分别位于第8号染色体165378bp-165543bp和227404bp-227499bp。
进一步的，所述分子标记x-21-1的扩增引物为：
x-21-1f：5’-tttcttctcagggtggtcttgc-3’(seqidno.1)
x-21-1r：5’-cacctttccacctcgcctatt-3’(seqidno.2)。
进一步的，所述分子标记x33的扩增引物为：
x33f：5’-cacacacgaggggaggaggt-3’(seqidno.3)
x33r：5’-aaggtctttgttgtcgggca-3’(seqidno.4)。
进一步的，若用碱裂解法提取玉米种子的dna，则利用上述引物扩增所述分子标记，每15µl反应体系中含有：10×pcrbuffer(含mg2+)2.0µl，2.5mmol/l的dntps0.3µl，5u/µl的taq酶0.20µl，10ng/µl的引物2.0µl，dna5.0µl，ddh2o5.5µl。
进一步的，若用常规ctab法提取玉米种子的dna，则利用上述引物扩增所述分子标记，每15µl反应体系中含有：10×pcrbuffer1.50µl，25mmol/l的mg2+1.0µl，25mmol/l的dntps0.3µl，5u/µl的taq酶0.10µl，50ng/µl的引物1.50µl，20ng/µl的dna3.0µl，ddh2o7.6µl。
进一步的，利用上述引物扩增所述分子标记的pcr反应程序为：95℃2min，8个循环的95℃1min、65℃（每循环降低1℃）1min和72℃1min，29个循环的95℃1min、58℃1min和72℃1min，72℃5min。
本发明具有以下积极有益效果：
本发明分子标记与玉米c型细胞质育性恢复基因rf4位点紧密连锁，可对其进行辅助选择，用于不育化制种，节省大量的人力、物力，加快了恢复系的转育。
附图说明
图1为本发明育性恢复基因rf4位点及分子标记的b73物理图谱；
图2为本发明田间育性观察结果；左图为可育单株，右边为不育单株。
图3为利用本发明分子标记选择获得制种恢复系的流程。
具体实施方式
.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中所涉及的原料，如无特别说明均为市售，所涉及检测方法如无特别说明，则均为常规方法。
一、连锁标记获得步骤：
以玉米优良自交系87-1为基础构建了恢复系cms-es87-1(rf4rf4)和不育系cms-es87-l(rf4rf4)的近等基因系，利用该近等基因系共计组配45000株的bc1f1分离群体用于精细定位。
其中，2009年夏在位于郑州市的河南农业大学科教园区用2800株bc1f1群体进行单株育性调查及花粉i2-ki检测。bc1f1群体中，有1368株田间育性观察属于5/ⅲ级，划分为可育株；1432株田间育性观察属于0/ⅰ级，划分为不育株；对每一单株的花粉进行i2-ki染色检测，所有单株的田间育性观察结果与花粉镜检结果一致，即可育单株与不育单株的比例为1368：1432，适合性检测符合1：1分离比(x2=1.42<x20.05,1(3.84))。并且，2009年夏在位于郑州市的河南农业大学科教园区组配群体大小为42200粒，采用碱裂解法提取玉米胚乳dna。根据分子标记在基因组中的相对位置，用距离目标基因较远的两个标记x-9与28-4对42200株bc1群体进行标记鉴定和连锁分析，共筛选到12株交换单株。
根据育性鉴定结果和分子标记对交换单株的检测结果分析可知，玉米c型胞质雄性不育育性恢复主基因rf4位于标记x-21-1与x-33之间，从b73物理图谱得知，两者的物理距离大约为60000nt。
二、碱裂解法提取种子基因组dna的步骤：
（1）取玉米种子于水中浸泡两分钟；
（2）取出数粒种子放到吸水纸，取一粒放到木板上用手术刀且切下胚乳的一小部分，去除种皮，放到96孔pcr板中，将种子放到96孔深孔板中相对应的位置；按此方法对所有种子进行该处理；
（3）将种子切下的部分，加100μl0.1molnaoh，放入pcr仪中，99.9度加热煮沸10min；0.1molnaoh配制：4.0gnaoh+800ml双蒸水并定容1000ml；
（4）将煮沸好的溶液冷却到室温，加入100μl的te2.0充分混匀；
（5）取5μl为模板，以备pcr反应。
三、利用本发明分子标记进行辅助选择：
利用本专利所述分子标记及其他公共标记在恢复基因回交导入过程中每代进行前景和背景选择，至bc3f1进行自交，利用本专利所述分子标记进行前景选择，纯合植株与不育系进行配合力测定并进行杂交种子生产。通过本专利所述分子标记进行辅助选择，可将恢复基因位点导入玉米杂交种的父本中，进而构建用于种子企业生产中所需的三系（不育系、保持系和恢复系）中恢复系。利用具有恢复作用的恢复系与对应不育系，可在田间制种过程中大量节约人工及机械成本，节省企业投入成本，最终惠及广大农户。
四、利用本发明所述分子标记将rf4位点导入玉米品种的父本：
利用恢复系cms-es87-1(rf4rf4)为母本，以待转育玉米杂交种的父本为父本进行杂交，随后以玉米杂交种的父本为轮回亲本进行连续回交（如图3）。在播种之前利用本发明分子标记的引物，通过taq酶对提取的种子dna进行pcr扩增，根据扩增产物的大小来判定所检测的玉米种子是否携带有来自恢复系cms-es87-1(rf4rf4)的基因位点片段。选取maizegdb（www.maizegdb.org)网站上玉米基因组的公共引物50对利用同样的扩增检测方法进行背景检测。最终选择含有恢复系cms-es87-1(rf4rf4)的基因位点片段，且背景回复高的种子种植于田间，雌穗开花后继续与轮回亲本回交，后代重复上述检测流程。回交三代后即可自交，用本发明分子标记选择含有恢复系cms-es87-1(rf4rf4)的基因位点片段的纯合片段的玉米材料即可获得三系配套制种中的恢复系。
在玉米三系配套选育中，携带rf4位点片段自交系与携带rf4位点片段自交系的杂交后代群体中，可用该分子标记快速筛选出携带rf4位点片段的后代材料。例如玉米杂交种浚单20的三系配套材料中恢复系的选育中，通过筛选含有rf4片段的种子，极大的节约了田间工作量，加快了恢复系的选育过程。
表1玉米杂交种浚单20的三系配套材料中恢复系的选育
序列表
<110>河南农业大学
<120>玉米c型细胞质雄性不育育性恢复基因rf4位点紧密连锁分子标记及其应用
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tttcttctcagggtggtcttgc22
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
cacctttccacctcgcctatt21
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cacacacgaggggaggaggt20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
aaggtctttgttgtcgggca20
<210>5
<211>166
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
tttcttctcagggtggtcttgcgaagttgtttagccatttctcactgtagtatatatcga60
cgactagtattggaggatcagggcggagcaatggtgaatgtgtgcttctctgtaggaacc120
aaaaggttgcgacccttctgcacctaataggcgaggtggaaaggtg166
<210>6
<211>96
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
cacacacgaggggaggaggttgctgcccacctaatgtggctagcctactagtgcgtgtgt60
ttgctcctaacgagggtgcccgacaacaaagacctt96