本发明属于生物工程领域，涉及一种海洋来源的单甘酯脂肪酶催化合成单甘酯的方法。
背景技术：
单甘酯是油脂的衍生物，是甘油中一个羟基与脂肪酸结合的产物，是一种高效的表面活性剂。单甘酯具备乳化、起泡、分散、消泡、抗淀粉老化等作用，被广泛的应用在各个食品领域，是食品领域应用最悠久效果最好的一种乳化剂。单甘酯的使用量超过了食品乳化剂总量的50％，欧美发达国家在上世纪三十年代就将其应用于食品行业。发展到目前，单甘酯的合成主要有两种方法：化学合成法和酶合成法。其中，化学法生产单甘酯主要有酯交换和酯化法两种方法，其原料主要是甘油、脂肪酸。其中酯交换又称为油脂甘油解法、醇解。除了脂肪醇解、甘油脂肪酸酯化外，单甘酯的化学法生产还有缩水甘油法、环氧氯丙烷法、化学基团保护法等。酶法生产单甘酯目前只是出于实验室研究阶段，限制其工程应用的最大的阻碍是酶与底物的接触困难导致生产效率下降而生产成本大幅度提高。
单甘酯和甘二酯是一类多元醇型非离子型表面活性剂。单甘酯、甘二酯和它们的复配物，常用作乳化剂、稳定剂、起泡剂、润滑剂、抗黏剂、增塑剂及抗菌剂等，被广泛应用在日化、食品、医药、纺织印染、金属加工等行业。目前，工业上合成单甘酯和甘二酯主要采用油脂甘油解法，一般是在高温(220-250℃)下以无机碱为催化剂，氮气保护下催化油脂与甘油进行反应，反应结束后需迅速降温，防止可逆反应导致单甘酯含量降低。产物为单甘酯、甘二酯、甘三酯、脂肪酸以及甘油的混合物，单甘酯含量一般为30％-40％，甘二酯为35％-40％。该方法由于需要高温，因此能耗大，色泽深，产生的副产物多。特别是对于含有双键的不饱和油脂，高温容易使双键氧化，严重影响了甘油酯产品的质量。而利用生物酶合成甘油单酯具有效率高，能耗少，环境友好等优势。但目前用于甘油单酯合成的脂肪酶为甘油三酯水解酶或甘油二酯水解酶，反应中残留的甘油二酯和甘油三酯难于去除，增加分离的工序导致生产成本提高。
技术实现要素：
本发明提供了一种单甘酯脂肪酶催化合成单甘酯的方法，采用甘油与脂肪酸的酯化，该方法得到的产物单一，有利于富集高纯度的单甘酯产物。
本发明采用的技术方案如下：
一种酶法催化合成单甘酯的方法，将甘油与脂肪酸按摩尔比为1:0.1～1:1进行混合，以固定化单甘酯脂肪酶作为催化剂，在温度为40-70℃、搅拌速度为200～600rpm的条件下反应，利用真空泵不断除去反应过程中产生的水分，最后通过离心分离，得到单甘酯产物。
优选地，所述甘油与脂肪酸的摩尔比为1:1。
优选地，所述脂肪酸为亚油酸。
优选地，所述催化剂为海洋微生物来源的单甘酯脂肪酶。
优选地，所述海洋微生物来源的单甘酯脂肪酶，其dna序列如seqidno.1所示。
优选地，反应温度为65℃。
优选地，搅拌速度为500rpm。
优选地，所述海洋微生物来源的单甘酯水解酶是通过大肠杆菌表达制备。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用单甘酯脂肪酶作为催化剂酯化合成不饱和脂肪酸甘油单酯，反应的过程中不产生其他甘油酯副产物，简化单甘酯产物分离成本，同时具有减少能耗和环境友好的优点。
(2)本发明方法反应条件温和，转化效率高，产物纯度高，酶活损失少，适合大规模推广应用。
附图说明
图1为gmgl经过ni柱纯化之后的sds-page电泳结果；1为裂解液；2为裂解液上清；3为20mm咪唑洗脱液；4为500mm咪唑洗脱液。
具体实施方式
本发明主要涉及一种海洋来源的单甘酯脂肪酶gmgl的催化合成单甘酯的方法。一方面，通过表达纯化的酶用于催化甘油与脂肪酸的酯化，另一方面在晶体结构的基础上分析结构与功能的关系，理性设计了一系列突变体以提高单甘酯脂肪酶的酯化活力。
实施例1单甘酯脂肪酶gmgl的表达与纯化
人工合成编码海洋来源单甘酯脂肪酶gmgl的dna序列，其序列如seqidno.1所示。用双酶切位点(ecorⅰ和bgiⅱ)连入pet-30a(+)载体中。将重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，将所得到的转化子克隆挑取转接入适量lb培养基(加入卡那霉素至终浓度为50μg/ml)中，37℃培养至600nm吸光度为0.8，加入诱导剂异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.02％，20℃诱导18h。以4200r/min离心30min收取菌体后，用缓冲液：20mmtris-hcl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，ph8.0以菌体：缓冲液＝1(g)：10(ml)比例加入缓冲液使菌体重悬。菌体重悬之后用超声破碎法裂解菌体，破碎程序为：振幅度70％，15min。将重悬菌体用冰块包被放置托盘上。破碎后，以12000r/min低温离心40min去除沉淀和其他颗粒状杂质。将离心后上清液与ni-nta亲和介质结合后，用含有500mm氯化钠、100mm磷酸盐缓冲液、20mm咪唑的缓冲液冲洗介质，去除杂蛋白。最终用含有500mm氯化钠、100mm磷酸盐缓冲液、500mm咪唑的洗脱液将目的蛋白从亲和介质上洗脱下来，收集各个不同浓度洗脱液的峰尖蛋白，利用sds-page电泳检测。sds-page电泳结果如图1所示。以10kd横纵切向流超滤膜将洗脱液浓缩并更换至20mmtris-hcl，ph8.0的缓冲液里储存，用液氮速冻后放置-80℃冰箱保存。
实施例2单甘酯脂肪酶gmgl的固定化
首先称取各种5g型号为d101的大孔树脂于100ml小烧杯中，加入30ml乙醇(95％)浸泡24h过滤后用去离子水反复清洗树脂至乙醇完全去除为止；将上一步处理的树脂继续加入30ml盐酸(5％)浸泡4h，过滤后用去离子水反复清洗至洗液的ph为中性；继续往上一步处理的树脂加入30mlnaoh(2％)，浸泡4h过滤后用清水反复冲洗至洗液ph为中性；最后，用ph6.0的磷酸盐缓冲液将树脂浸泡，每隔一段时间过滤，测定滤液的ph并继续添加新的缓冲液进行浸泡，重复此操作，直至滤液ph至6.0，将树脂滤干后于4℃冰箱存放。将单甘酯脂肪酶的酶液与缓冲液等体积混匀，按30mg/g酶与树脂的比例加入树脂，于组合型恒温气浴摇床(30℃，200rmp)中震荡2h，取上清液于ep管中测定其蛋白含量。采用适当的过滤方式将固定化酶过滤，并用之前的缓冲液清洗固定化酶，直至固定化酶滤液中没有蛋白存在，沥干后，将制备的固定化酶于30℃下真空干燥8h。
实施例3单甘酯脂肪酶gmgl催化合成单甘酯
按照甘油:亚油酸摩尔比1:1、3:1、5:1、7:1、10:1、20:1、40:1的比例加入甘油与亚油酸于10ml锥形瓶中，并用缓冲液(100mmtris-hclph8.0)补齐至2g，加入900u的固定化酶gmgl于油浴锅中反应，反应温度设定为65℃，搅拌转速为500rpm，反应72h。利用真空泵不断除去反应过程中产生的水分，最后通过离心分离，得到单甘酯产物。利用hplc检测反应产物的生成，油样成分分别于3、6、12、24、48、72h取样，每次取样50μl或100μl，结果见表1。
表1底物摩尔比对gmgl催化亚油酸与甘油酯化反应的影响
序列表
<110>华南理工大学
<120>一种酶法催化合成单甘酯的方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>251
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
metthrgluthrtyrprovalvallysglyalagluprophephephe
151015
gluglyasnaspileglyileleuvalleuhisglyphethrglyser
202530
proglnsermetargproleuglyglualatyrhisglualaglytyr
354045
thrvalcysglyproargleulysglyhisglythrhistyrgluasp
505560
metglulysthrthrcysglnasptrpileaspservalglualagly
65707580
tyrglutrpleulysasnargcysglythrilephevalthrglyleu
859095
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115120125
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