用于循环肿瘤细胞捕获的多酚涂层的制作方法

文档序号:15457416发布日期:2018-09-15 01:29

本发明属于生物功能材料和分析检测技术领域,特别涉及在材料表面捕获循环肿瘤细胞的技术。



背景技术:

癌症是目前威胁人类健康最严重的疾病之一,肿瘤的侵袭和转移是癌症患者临床致死的主要原因,及早发现与治疗是提高癌症患者生存率的最有效手段。循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是在肿瘤的形成或生长过程中从原位肿瘤病灶脱离进入人体外周血循环系统的细胞。研究表明,血液中CTCs的数量及类型变化与癌症的发生和发展密切相关,是最具潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段之一。因此发展高灵敏度、高特异性的CTCs捕获方法,对实现癌症的个体化治疗具有重要意义。

随着微流控芯片和微纳米制备技术的发展,CTCs捕获技术近年来已取得较大进步,这主要基于肿瘤细胞与血液中正常细胞物理性质和生物化学性质上的差异。其中,基于物理性质的分离方法,主要是利用癌细胞与正常血细胞在尺寸、密度等方面的差异对癌细胞进行分离;基于生化性质的分离捕获方法,主要基于免疫识别分离的原理,可针对性分离表达特定抗原的癌细胞,因此具有更高的特异性。目前主要以上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)抗体或核酸适配体为识别分子,磁性纳米颗粒、微纳米基质或微流控芯片为载体实现对CTCs的捕获。文献Small 2015,11,3850、Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,1252和Chem.Soc.Rev.,2017,46,4245综述了近年来CTCs捕获的方法和技术。虽然这些方法都具有一定的CTCs捕获效果,但也存着各种不足,如材料制备过程较为复杂,有的捕获效率不高或富集时间较长等。此外,由于CTCs会发生上皮细胞间质转变,且不是每种肿瘤细胞都表达上皮标志,因此使用单一的EpCAM抗体捕获CTCs往往会造成假阴性结果。另外抗体的生产价格昂贵,采用多种特异性标志物抗体联合使用又会导致成本的增加;而核酸适配体的稳定性不足,易被核酸酶降解。中国专利CN201210382382.X、CN201410153844.X、CN201510263669.4和CN201710014061.7中也分别公开了捕获CTCs的方法或技术,但也存在上述类似的缺陷。

多酚类化合物是指植物中一组化学物质统称,因含有多个酚羟基而得名,存在于许多普通水果和蔬菜中,来源广泛,成本低廉。目前尚未见到多酚类化合物用于CTCs捕获的类似报道。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一种用于循环肿瘤细胞捕获的材料及其制备方法。该材料包括多酚类化合物,可以将多酚类化合物修饰到基底材料,制备得到多酚涂层,所制备的多酚涂层可用于捕获外周血中的循环肿瘤细胞,有望用于癌症患者的早期诊断。

本发明的技术方案如下:

一种用于循环肿瘤细胞捕获的材料,该材料包括多酚类化合物。

进一步地,在上述技术方案中,所述的多酚类化合物为单宁酸、表儿茶素没食子酸酯或表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种。

本发明还提供一种用于循环肿瘤细胞捕获的多酚涂层,采用表面改性的方法,将多酚类化合物修饰到基底材料表面形成多酚涂层。

进一步地,在上述技术方案中,所述的多酚类化合物为单宁酸、表儿茶素没食子酸酯或表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种。

进一步地,在上述技术方案中,所述的基底材料为无机非金属材料、金属材料或有机高分子材料。所述无机非金属材料优选二氧化硅、氧化铝、氧化铁中的一种,所述金属材料优选金、铜中的一种,所述的有机高分子材料优选聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚氨酯中的一种。

进一步地,在上述技术方案中,所述的多酚涂层的厚度不少于80nm,涂层表面酚羟基含量的比例不低于20%。

在本发明中,采用表面改性的方法,将多酚类化合物修饰到基底材料表面形成多酚涂层。对于所述的表面改性方法不做特别限定,本领域技术人员可基于常规的表面改性方法将多酚类化合物修饰到基底材料表面,优选采用多酚化合物与金属离子在表面螯合自组装的方法。

本发明还提供一种捕获循环肿瘤细胞的方法,包括将外周血样品与上述的多酚涂层接触的步骤。将供试者提供的外周血样品滴加至所述多酚涂层,在培养箱中敷育,多酚涂层能够特异性地捕获样品中的肿瘤细胞,以达到捕获肿瘤细胞的目的。还有,多酚类化合物含有抗炎症的生物活性,从而能够进一步降低白细胞在多酚涂层的粘附,因此多酚涂层能够快速有效的从外周血中富集循环肿瘤细胞。

在上述技术方案中,所述的外周血样品是将外周血液去除血浆、红细胞和血小板而得到的。

本发明与现有的循环肿瘤细胞捕获技术相比具有以下有益效果:

1.本发明采用来源广泛,价格低廉,无毒无害的多酚类化合物,无需固载特异性癌细胞识别抗体或核酸适配体,能有效的降低使用成本。

2.本发明的多酚涂层,在整个涂层制备过程中无需引入微纳米基质,不需要复杂的表面刻蚀技术,方法简单快速。

3.本发明所提供的包含多酚类的材料,以及所制备的多酚涂层可实现对不同癌细胞类型的特异性捕捉,具有较好的广谱性,可应用于癌症患者的早期诊断。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的多酚涂层的扫描电镜照片,比例尺为10微米。

图2为本发明实施例1的多酚涂层捕获癌细胞后的扫描电镜照片,比例尺为10微米。

图3为本发明实施例1的修饰多酚涂层前后捕获效率柱状图。

图4为本发明实施例2的多酚涂层对不同癌细胞系的捕获效率柱状图。

图5为本发明实施例3的多酚涂层对外周血中不同数量癌细胞的捕获效率点状图。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。下述实施例中,如无特殊说明,所使用的实验方法均为常规方法,所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

实施例1

本实施例选用的多酚类化合物为单宁酸,基底材料为平面单晶硅片;利用多酚化合物与金属离子的螯合自组装作用对基底材料进行化学修饰;以癌细胞MCF-7为待捕获的循环肿瘤细胞为例,对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证,包括以下步骤:

1)采用多酚化合物与金属离子的螯合自组装的修饰方法,在基底硅片表面制备多酚涂层:

分别配置浓度为3.2mg/mL的单宁酸水溶液和0.8mg/mL的三氯化铁水溶液;向1cm×1cm的基底硅片中依次加入1mL的单宁酸溶液和1mL的三氯化铁溶液,反应3分钟,反应完成后取出硅片,去离子水洗涤,氮气干燥;重复上述的反应步骤5次,得到单宁酸修饰后的多酚涂层(图1),涂层的厚度为80nm,涂层表面酚羟基含量的比例为20%。

2)准备待测的循环肿瘤细胞样品:

取MCF-7细胞悬浮液100μL,用细胞计数器计数并计算其浓度;吸取一定量的上述细胞悬浮液,用DMEM细胞培养基稀释至1×105个细胞/mL;

3)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞:

将步骤1)中修饰有单宁酸涂层的硅片放入细胞培养板中,然后将步骤2)混合均匀的细胞悬浮液0.5mL滴加到涂层表面,然后置于细胞培养箱中,捕获时间为90分钟;作为对照实验,未修饰有多酚涂层的硅片表面也进行相同的待测样品中的循环肿瘤细胞捕获实验;

4)捕获效果的评价:

捕获时间结束后,将捕获有循环肿瘤细胞的多酚涂层用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三次;用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液固定捕获的癌细胞30分钟;将捕获的癌细胞浸泡在浓度为10μg/mL的DAPI水溶液中30分钟,达到染色的目的;最后在Olympus倒置荧光显微镜10倍下分别拍照,选取不同视野下的荧光照片,利用ImageJ软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数,计算捕获效率;对照实验组也上述步骤进行,并计算捕获效率。

实验结果表明,MCF-7癌细胞能够较好的铺展在修饰有多酚涂层的硅片表面(图2),多酚涂层表面的MCF-7癌细胞的捕获效率达到76%,而对照实验中,未修饰多酚涂层表面的MCF-7癌细胞的捕获效率仅为2%(图3),表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效捕获。

实施例2

本实施例选用的多酚类化合物为表儿茶素没食子酸酯,基底材料为平面金片;利用多酚化合物与金属离子的螯合自组装作用对基底材料进行化学修饰;以癌细胞MCF-7为待捕获的循环肿瘤细胞为例,对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证,包括以下步骤:

1)采用多酚化合物与金属离子的螯合自组装的修饰方法,在基底金片表面制备多酚涂层:

分别配置浓度为3.2mg/mL的表儿茶素没食子酸酯水溶液和0.8mg/mL的三氯化铁水溶液;向1cm×1cm的基底金片中依次加入1mL的表儿茶素没食子酸酯溶液和1mL的三氯化铁溶液,反应3分钟,反应完成后取出金片,去离子水洗涤,氮气干燥;重复上述的反应步骤10次,得到表儿茶素没食子酸酯修饰后的多酚涂层(图1),涂层的厚度为82nm,涂层表面酚羟基含量的比例为25%。

2)准备待测的循环肿瘤细胞样品:

取MCF-7细胞悬浮液100μL,用细胞计数器计数并计算其浓度;吸取一定量的上述细胞悬浮液,用DMEM细胞培养基稀释至1×105个细胞/mL;

3)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞:

将步骤1)中修饰有表儿茶素没食子酸酯涂层的金片放入细胞培养板中,然后将步骤2)混合均匀的细胞悬浮液0.5mL滴加到涂层表面,然后置于细胞培养箱中,捕获时间为90分钟;作为对照实验,未修饰有多酚涂层的金片表面也进行相同的待测样品中的循环肿瘤细胞捕获实验;

4)捕获效果的评价:

捕获时间结束后,将捕获有循环肿瘤细胞的多酚涂层用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三次;用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液固定捕获的癌细胞30分钟;将捕获的癌细胞浸泡在浓度为10μg/mL的DAPI水溶液中30分钟,达到染色的目的;最后在Olympus倒置荧光显微镜10倍下分别拍照,选取不同视野下的荧光照片,利用ImageJ软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数,计算捕获效率;对照实验组也上述步骤进行,并计算捕获效率。

实验结果表明,多酚涂层表面的MCF-7癌细胞的捕获效率达到80%,而对照实验中,未修饰多酚涂层表面的MCF-7癌细胞的捕获效率为5%,表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效捕获。

实施例3

本实施例选用的多酚类化合物为单宁酸,基底材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS);利用多酚化合物与金属离子的螯合自组装作用对基底材料进行化学修饰;以癌细胞MCF-7、A431、Hela和A549为待捕获的循环肿瘤细胞为例,对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证,包括以下步骤:

1)采用多酚化合物与金属离子的螯合自组装的修饰方法,在基底PDMS表面制备多酚涂层:

分别配置浓度为3.2mg/mL的单宁酸水溶液和0.8mg/mL的三氯化铁水溶液;向1cm×1cm的PDMS基底中依次加入1mL的单宁酸溶液和1mL的三氯化铁溶液,反应3分钟,反应完成后取出PDMS,去离子水洗涤,氮气干燥;重复上述的反应步骤5次,得到单宁酸修饰后的多酚涂层,涂层的厚度为90nm,涂层表面酚羟基含量的比例为22%。

2)准备待测的循环肿瘤细胞样品:

分别取MCF-7、A431、Hela和A549细胞悬浮液各100μL,用细胞计数器计数并计算其各自浓度;分别吸取一定量的上述细胞悬浮液,用DMEM细胞培养基稀释各自悬浮液至1×105个细胞/mL;

3)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞:

将步骤1)中修饰有单宁酸涂层的PDMS放入细胞培养板中,然后将步骤2)的各自细胞悬浮液0.5mL滴加到涂层表面,然后置于细胞培养箱中,捕获时间为90分钟;作为对照实验,未修饰有多酚涂层的PDMS材料也进行相同的待测样品中的循环肿瘤细胞捕获实验;

4)捕获效果的评价:

捕获时间结束后,将捕获了循环肿瘤细胞的多酚涂层用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三次;用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液固定捕获的癌细胞30分钟;将捕获的癌细胞浸泡在浓度为10μg/mL的DAPI水溶液中30分钟,达到染色的目的;最后在Olympus倒置荧光显微镜10倍下分别拍照,选取不同视野下的荧光照片,利用ImageJ软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数,计算捕获效率;对照实验组也上述步骤进行,并计算捕获效率。

实验结果表明,多酚涂层表面对MCF-7、A431、Hela和A549癌细胞的捕获效率分别达到76%、76%、78%和83%(图4),而未修饰多酚涂层表面的对照实验中,这些癌细胞的捕获效率均低于2%,表明该方法可以实现对不同癌细胞系的高效捕获,具有较好的广谱性。

实施例4

本实施例选用的多酚类化合物为单宁酸,基底材料为平面单晶硅片;利用多酚化合物与金属离子的螯合自组装作用对基底材料进行化学修饰;向外周血单核细胞中加入癌细胞MCF-7为待捕获的循环肿瘤细胞模型,对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证,包括以下步骤:

1)采用多酚化合物与金属离子的螯合自组装的修饰方法,在基底硅片表面制备多酚涂层:

分别配置浓度为3.2mg/mL的单宁酸水溶液和0.8mg/mL的三氯化铁水溶液;向1cm×1cm的基底硅片中依次加入1mL的单宁酸溶液和1mL的三氯化铁溶液,反应3分钟,反应完成后取出硅片,去离子水洗涤,氮气干燥;重复上述的反应步骤5次,得到单宁酸修饰后的多酚涂层,涂层的厚度为85nm,涂层表面酚羟基含量的比例为20%。

2)准备待测的循环肿瘤细胞样品:

取5mL新鲜抗凝血,向血液中加入外周血单核细胞分离液(北京索莱宝生物科技,P8610),利用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,得到外周血单核细胞悬浮液,细胞浓度为0.8×106个细胞/mL;取MCF-7细胞悬浮液100μL,用细胞计数器计数并计算其浓度;向外周血单核细胞悬浮液中分别加入癌细胞数量为50、100、200、400、600、800和1000的MCF-7细胞,混合均匀;

3)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞:

将步骤1)中修饰有单宁酸涂层的硅片放入细胞培养板中,然后将步骤2)混合均匀的细胞悬浮液0.5mL滴加到涂层表面,然后置于细胞培养箱中,捕获时间为90分钟;

4)捕获效果的评价:

捕获时间结束后,将捕获了循环肿瘤细胞的多酚涂层用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三次;用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液固定捕获的癌细胞30分钟;将捕获的癌细胞浸泡在浓度为10μg/mL的DAPI水溶液中30分钟,10μg/mL的Cytokeratin-FITC磷酸盐缓冲液中60分钟,达到染色的目的;最后在激光共聚焦荧光显微镜10倍下分别拍照,选取不同视野下的荧光照片,利用ImageJ软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数,计算捕获效率。

实验结果表明,多酚涂层表面对外周血样本中不同数量的MCF-7癌细胞的捕获效率能达到75%以上(图5)。此外,外周血单核细胞在多酚涂层的粘附数量为(14个细胞/mm2),要显著低于未修饰有多酚涂层的表面(73个细胞/mm2),表明该方法可以实现从外周血中高效特异性地捕获循环肿瘤细胞。

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