本发明涉及一种评价生发/防脱发功效的体外组合方法，可以替代活体动物用于新原料、新物质等的功效评价。
背景技术：
脱发已经成为困扰现代人的一种常见现象之一，据有关统计我国约有1.6亿人深受脱发困扰。从年龄上看，90后80后青年，已经成为最被脱发问题困扰的群体。有报道指出2013-2018年间，全球护发产业预计将以4％的复合年增长率发展，市场价值将在2018年底达到600亿美元。
传统育发评价方法采用的是动物实验，其具有不确定度大、影响因素多、周期长、成本高等缺点，以及基于动物福利的要求，不仅不利于实现原料或新物质的快速、有效、高通量筛查，而且需要使用大量实验动物，有悖于减少、优化和替代的原则。体外方法是一类利用离体组织、器官等作为实验系统，通过不同的手段评价、预测体内反应的方法。具有高通量、多终点、条件可控性高等优点，有利于开发初期的快速有效筛查，但单一方法也存在预测能力有限等不足。
ⅱ型5α还原酶存在于皮肤、前列腺等部位，可以将雄激素睾酮转化为双氢睾酮，从而抑制毛发休眠期向生长期过渡，影响毛囊正常生长，引起油脂分泌过多，导致雄性激素脱发，90％的脱发类型为雄性激素脱发。受试物体外抑制5α还原酶的活性可以抑制双氢睾酮的生成，从而抑制了双氢睾酮对细胞影响，达到减少脱发的效果。
真皮乳头细胞(dermalpapillarycell，dpc)为毛囊生长的关键细胞，角质细胞分泌角质纤维形成毛发，细胞的活性和周期是评价是否具有促进细胞增殖的重要指标。氧化应激被认为是导致细胞衰老和死亡的重要原因之一，拮抗/保护氧化应激带来的细胞损伤，具有维持细胞正常结构与功能的重要意义。
改善微循环可以促进微血管形成，恢复血液供应，提高细胞的营养，促进细胞增殖与分化的目的。鸡胚的绒毛膜尿囊膜，其血管丰富、明显，可观察是否能够促进微血管生成，评价其改善微循环的能力。
我国传统植物资源丰富，近年来大力发展植物原料，许多植物原料宣称具有明显的功效作用，其中就包括生发/防脱发功效。针对越来越多的植物提取物、新合成物质，其安全与功效受到了广泛的关注。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题，就是提供一种评价生发/防脱发功效的体外组合方法，其有助于开发具有明确生发/防脱发功效的产品，实现植物等原料的快速、有效筛查，节约时间和人力成本。
解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下。
一种评价生发/防脱发功效的体外组合方法，其特征是包括以下步骤：
s1，5α还原酶抑制水平分析；s2，细胞水平功效分析：包括细胞毒性、细胞增殖能力和抗氧化能力功效分析；s3，血管生成分析。
所述的步骤s1包括以下子步骤：
s1-1，试剂配制：
备料：磷酸缓冲液(ph＝7.0)、酶提取液、睾酮溶液、nadph溶液、非那雄胺溶液和考马斯亮蓝溶液；
考马斯亮蓝配制：精密称取考马斯亮蓝g-250100mg，加入95％乙醇50ml，溶液呈蓝色；搅拌溶解，再加入ph＝7.0的85％(w/v)磷酸缓冲液100ml搅拌，溶液呈血红色；最后用蒸馏水定容至1000ml，溶液变为褐色；在磁力加热搅拌器上搅拌过夜，用滤纸过滤备用；
蛋白质标准溶液配制：称取牛血清白蛋白配制为0.1mg/ml蛋白质标准液，置于4℃冰箱中保存；
酶提取液含有：0.32mol/l蔗糖、1mmol/l1，4-二硫代苏糖醇、0.1mmol/ledta、10mmol/ltric-hcl和20mmol/l磷酸缓冲液；
s1-2，ⅱ型5α还原酶制备：
取250-300g的雄性sd大鼠4只，禁食不禁水过夜后co2人道处死，分离取出前列腺，去除多余组织，于冰台上剪碎；用预冷的磷酸缓冲液在玻璃匀浆器制成1：5匀浆，10000g(离心机的参数)，10min离心两次，去除上层白色脂肪层后取上清液加入磷酸缓冲液定容至20ml，分装至ep管中，每管1ml，即为粗酶提取物；-80℃冰箱保存备用；
s1-3，蛋白定量：
标准曲线绘制：取0.1mg/mlbsa标准液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml，分别补加蒸馏水至1ml，再加入考马斯亮蓝g-250溶液5ml，混匀，显色5min后在595nm处测定吸光值，绘制蛋白质的标准曲线；以粗酶代替bsa进行反应，测定粗酶吸光度值，代入标准曲线中获得总蛋白含量；
s1-4，5α还原酶反应：
在反应体系含有0.5ml磷酸缓冲液，0.1ml50％受试物或对照物，150μl睾酮溶液，250μl，0.5ml粗酶提取物和2mg/mlnadph溶液；
在37℃下反应30min，反应结束后加入2ml二氯甲烷使反应停止并萃取睾酮，再然后加入0.25ml的100μg/ml丙基羟苯酸酯作为内标，摇晃60s，在400×g离心力下离心10min；去除上层水相，移出1ml有机相并蒸干，残留物溶于1.5ml甲醇，取10μl高效液相进样测定残留睾酮；
同时设置酶反应管、酶空白管、标准品管和样品管；在反应启动前加入二氯甲烷使酶失活，设为酶空白管；用0.1ml50％乙醇替代受试物，设为酶反应管；
s1-5，5α还原酶抑制率测定:
色谱条件：色谱柱：lunac18(2)柱(4.6×250mm，5μm)；
柱温：40℃，进样量：10μl，流速：1ml/min，流动相：70％甲醇
检测波长：242nm；
s1-6，结果分析:
酶反应管的睾酮含量记为t反应，酶空白管的睾酮含量记为t空白，样品管的睾酮含量记为t样品；睾酮与内标峰面积的比值并记为r；
所述的步骤s2包括以下子步骤：
s2-1，细胞毒性：
s2-1-1，试剂配制
备料：10％fbs细胞培养基、0.25％胰酶-0.02％edta、pbs和dmso；
mtt溶液配制：称取mtt0.5g，溶于100ml的0.01mol/l磷酸缓冲液配制成5mg/ml的溶液，0.22μm滤器过滤除菌，分装，4℃避光保存；
s2-1-2，细胞制备：
将生长至80％-90％融合的细胞用0.25％胰酶-0.02％edta消化，1200rpm/min，3-5min离心，得到的细胞沉淀，用完全培养基制成悬液，密度1.0×104/孔(每孔100ul)接种于96孔板；在37℃、5％co2和饱和湿度下的培养箱中培养1-2天，待细胞长至80％汇合；
s2-1-3，暴露：
受试物用完全培养基溶解稀释至待测浓度；将96孔板中原来的培养基移走，每孔加入200ul新鲜的含有受试物的培养基，至少8个系列浓度，同时设立阳性对照孔：有细胞，受试物为5％sds；阴性对照孔：有细胞，不加受试物；空白孔：无细胞，不加受试物，培养液；培养箱中培养24和48h；
s2-1-4，细胞活性测定：
每孔加入5mg/ml的mtt溶液20ul，培养箱中孵育4h，移走培养基，每孔中加入dmso150ul，培养箱中孵育30min，充分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度；
s2-1-5，结果分析：
s2-2，细胞增殖能力：
s2-2-1，试剂配制：
含10％fbs细胞培养基、0.25％胰酶-0.02％edta、pbs、mtt溶液、dmso维持培养基(含0-2％fbs的细胞培养基)。
s2-2-2，细胞制备：
将生长至80％-90％融合的细胞用0.25％胰酶-0.02％edta消化，1200rpm/min，3-5min离心，得到的细胞沉淀，用完全培养基制成悬液，密度2.0-3.0×104/ml(每孔100ul)接种于96孔板，或密度1×105/ml(每孔2ml)接种于6孔板；在37℃，5％co2，饱和湿度下的培养箱中培养18-24h；；更换维持培养液，继续培养18-24h。
s2-2-3，暴露：
去除孔中旧培养基，加入含不同浓度受试物的培养基，受试物最大浓度为ic20，向下设置7个系列浓度，并设置空白对照组；暴露时间24和48h；
s2-2-4，细胞增殖能力测定：
在暴露后的96孔细胞培养板中，每孔加入5mg/ml的mtt溶液20ul，培养箱中孵育4小时，移走培养基，每孔中加入dmso150ul，培养箱中孵育30min，充分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度；
s2-2-5，结果分析：
细胞活力
各组与对照组进行统计学分析(α＝0.05)；
s2-3，抗氧化能力：
s2-3-1，试剂配制：
含10％fbs细胞培养基、0.25％胰酶-0.02％edta、pbs、过氧化氢(h2o2)、mtt溶液、dmso；
s2-3-2，细胞制备：
将生长至80％-90％融合的细胞用0.25％胰酶-0.02％edta消化，1200rpm/min，3-5min离心，得到的细胞沉淀，用完全培养基制成悬液，密度1×104/ml(每孔100ul)接种于96孔板，或密度1×105/ml(每孔2ml)接种于6孔板；在37℃，5％co2，饱和湿度下的培养箱中培养18-24h；
s2-3-3，暴露：
去除原培养基，加入含不同浓度受试物的培养基，需加入过氧化氢造成细胞氧化损伤，同时设置对照组；暴露时间为24和48h；
s2-3-4，细胞活性测定：
每孔加入5mg/ml的mtt溶液20ul，培养箱中孵育4小时，移走培养基，每孔中加入dmso150ul，培养箱中孵育30min，充分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度；
s2-3-5，抗氧化能力测定：
采用二氯荧光素(dcfh-da)标记法；dcfh-da是一种荧光探针，可以特异性的与ros结合，当细胞内ros水平增高时，dcfh-da的荧光强度相应的增高，表现为相对于正常细胞荧光强度的升高；
接种于6孔板的细胞，细胞用0.25％胰酶-0.02％edta消化悬浮，离心，用冷pbs清洗2次，调整细胞密度为1×106/ml，用ros试剂盒，用流式细胞仪检测；
s2-3-6，结果分析：
细胞活力
绘制细胞活力曲线，分析受试物对h2o2造成氧化损伤的保护作用；
ros抑制水平
荧光强度均值(mfi)＝荧光强度几何平均数；
相对荧光强度
s3，血管生成分析s3-1，材料和试剂：
spf级受精鸡胚、甲醇、丙酮、10％中性福尔马林固定液、vegf免疫组化试剂盒
s3-2，cam制备：
受精鸡胚置于培养箱中进行孵育(37.5℃，rh40-70％)，每天翻转，检查鸡胚发育情况；取发育良好的鸡胚于第7天，酒精消毒蛋壳，在气室端开一约2cm×2cm的区域；小心分离气室膜，完全暴露cam；
s3-3，暴露：
取直径约0.5cm定性滤纸片，轻置于cam表面血管较少的部位，加入50μl受试物，透明膜封口，返回培养箱孵育72h；
s3-4，血管分析：
血管图像分析：体视镜下直接观察血管，或从窗口处加入固定液(甲醇：丙酮＝1:1)，固定20min后，用镊子取出一层cam，在玻片上铺平，采集图像，计数血管分支点数量；
免疫组化：取出cam后，加入10％中性福尔马林固定液，固定24h后，常规制作5μm厚度的石蜡切片，根据vegf免疫组化试剂盒说明书进行操作，最后封片，显微镜观察，并进行光密度分析；
s3-5，结果分析：
试验组平均血管分支点数量与对照组进行对比，并进行统计学分析，α＝0.05；
试验组平均vegf光密度值与对照组进行对比，并进行统计学分析，α＝0.05。
所述的步骤s1中，阳性对照物为5α还原酶还原酶抑制剂，非那雄胺(cas：98319-26-7)浓度为0.1-1.0mg/ml。
所述的步骤s2中，所采用的细胞包括人源真皮乳头细胞(hdpc)、永生化人角质细胞(hacat)和人原代角质细胞，，所采用的阳性对照物为米诺地尔，浓度范围为0.001-1μmol/l；
所述的步骤s2中，细胞毒性和细胞增殖分析，所采用的方法包括mtt法、中性红法、cck法和荧光素漏出法；
所述的步骤s2中，细胞抗氧化能力分析采用过氧化氢进行氧化损伤造模，其浓度范围为5-40μmol/l，造模时间为6-18h；
所述的步骤s2中的采用过氧化氢进行氧化损伤造模，分两种模型：分别为造模前加入受试物和造模后加入受试物，分别评价受试物对过氧化氢造成的细胞氧化损伤的保护作用和修复作用。
所述的步骤s3中，图像分析采用体式镜进行图像采集，用图像分析软件进行分析，计数滤纸外周2-3cm内小血管分支点。
本发明中，在确定的实验条件下，受试物可以抑制5α还原酶活性，促进细胞增殖，对氧化损伤具有拮抗/保护作用，能够促进微血管循环，可作为具有潜在生发/防脱发功效的有力证据，受试物可作为育发体系的组成成分。
附图说明
图1不同浓度受试物对hacat的细胞毒性示意图；
图2不同浓度受试物对hacat的细胞增殖示意图(*：p<0.05)；
图3.1为0h时间点血管图像(空白对照)；
图3.2为24h时间点血管图像(10％样品)；
图3.3为48h时间点血管图像(30％样品)；
图3.4为72h时间点血管图像.
(左上为0h，右上为24h，左下为48h，右下为72h)。
具体实施方式
实例1生姜提取物的酶抑制作用
s1，5α还原酶抑制体外模型
s1-1，试剂配制：磷酸缓冲液(ph＝7.0)、酶提取液、睾酮溶液、nadph溶液、非那雄胺溶液和考马斯亮蓝溶液；
考马斯亮蓝配制：精密称取考马斯亮蓝g-250100mg，加入95％乙醇50ml，溶液呈蓝色；搅拌溶解，再加入ph＝7.0的85％(w/v)磷酸缓冲液100ml搅拌，溶液呈血红色；最后用蒸馏水定容至1000ml，溶液变为褐色；在磁力加热搅拌器上搅拌过夜，用滤纸过滤备用；
蛋白质标准溶液配制：称取牛血清白蛋白配制为0.1mg/ml蛋白质标准液，置于4℃冰箱中保存；
酶提取液含有：0.32mol/l蔗糖、1mmol/l1，4-二硫代苏糖醇、0.1mmol/ledta、10mmol/ltric-hcl和20mmol/l磷酸缓冲液；
姜汁提取物：取100g生姜，清洗干净，消毒杀菌，破碎仪榨汁，收集姜汁，离心过滤，取上清液，过膜，加入1,3丁二醇和苯氧乙醇，混合均匀，即得姜汁提取物。测试时用无菌水按体积分数稀释成30％、10％和1％三个浓度。
s1-2，ⅱ型5α还原酶制备：
取250-300g的雄性sd大鼠4只，禁食不禁水过夜后co2人道处死，分离取出前列腺，去除多余组织，于冰台上剪碎；用预冷的磷酸缓冲液在玻璃匀浆器制成1：5匀浆，10000g，10min离心两次，去除上层白色脂肪层后取上清液加入磷酸缓冲液定容至20ml，分装至ep管中，每管1ml，即为粗酶提取物；-80℃冰箱保存备用；
s1-3，蛋白定量：
标准曲线绘制：取0.1mg/mlbsa标准液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml，分别补加蒸馏水至1ml，再加入考马斯亮蓝g-250溶液5ml，混匀，显色5min后在595nm处测定吸光值，绘制蛋白质的标准曲线；以粗酶代替bsa进行反应，测定粗酶吸光度值，代入标准曲线中获得总蛋白含量；
s1-4，5α还原酶反应：
在反应体系含有0.5ml磷酸缓冲液，0.1ml50％受试物或对照物，150μl睾酮溶液，250μl，0.5ml粗酶提取物和2mg/mlnadph溶液；
在37℃下反应30min，反应结束后加入2ml二氯甲烷使反应停止并萃取睾酮，再然后加入0.25ml的100μg/ml丙基羟苯酸酯作为内标，摇晃60s，在400×g离心力下离心10min；去除上层水相，移出1ml有机相并蒸干，残留物溶于1.5ml甲醇，取10μl高效液相进样测定残留睾酮；
同时设置酶反应管、酶空白管、标准品管和样品管；在反应启动前加入二氯甲烷使酶失活，设为酶空白管；用0.1ml50％乙醇替代受试物，设为酶反应管；
s1-5，5α还原酶抑制率测定:
色谱条件：色谱柱：lunac18(2)柱(4.6×250mm，5μm)；
柱温：40℃，进样量：10μl，流速：1ml/min，流动相：70％甲醇
检测波长：242nm；
s1-6，结果分析:
结果显示：10％和1％的姜汁提取物对5α还原酶有一定的抑制作用，表明其可能具有抑制雄性激素脱发的功效。
实例2当归提取物细胞功效分析
s2，细胞功效分析
s2-1，细胞毒性
s2-1-1，试剂配制：10％fbs细胞培养基、0.25％胰酶-0.02％edta、pbs和dmso；mtt溶液配制：称取mtt0.5g，溶于100ml的0.01mol/l磷酸缓冲液配制成5mg/ml的溶液，0.22μm滤器过滤除菌，分装，4℃避光保存；
s2-1-2当归提取物：取100g的当归药材，开水清洗2-3次，按照一定料液比加入一定浓度的乙醇，加热回流提取，过滤，收集滤液。减压浓缩至一定生药浓度，加入1,3丁二醇和苯氧乙醇，混合均匀，离心过膜，即得当归提取物。细胞毒性测试时在0.5～80％范围内设置8个浓度。功效测试时，在无毒性的范围内选择5个浓度进行分析。
s2-1-3，细胞制备：
将生长至80％-90％融合的hacat细胞用0.25％胰酶-0.02％edta消化，1200rpm/min，3-5min离心，得到的细胞沉淀，用完全培养基制成悬液，密度1.0×104/孔(每孔100ul)接种于96孔板；在37℃，5％co2，饱和湿度下的培养箱中培养1-2天，待细胞长至80％汇合；
s2-1-4，暴露：
受试物用完全培养基溶解稀释至待测浓度；将96孔板中原来的培养基移走，每孔加入200ul新鲜的含有受试物的培养基，至少8个系列浓度，同时设立阳性对照孔：有细胞，受试物为5％sds；阴性对照孔：有细胞，不加受试物；空白孔：无细胞，不加受试物，培养液；培养箱中培养24和48h；
s2-1-5，细胞活性测定：
每孔加入5mg/ml的mtt溶液20ul，培养箱中孵育4h，移走培养基，每孔中加入dmso150ul，培养箱中孵育30min，充分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度；
s2-2，细胞增殖能力：
s2-2-1，试剂配制：含10％fbs的dmem培养基、0.25％胰酶-0.02％edta、pbs、mtt溶液、dmso，维持培养基：含1％fbs的dmem培养基
s2-2-2，细胞制备：
将生长至80％-90％融合的细胞用0.25％胰酶-0.02％edta消化，1200rpm/min，3-5min离心，得到的细胞沉淀，用完全培养基制成悬液，密度2.0-3.0×104/ml(每孔100ul)接种于96孔板，或密度1×105/ml(每孔2ml)接种于6孔板；在37℃，5％co2，饱和湿度下的培养箱中培养18-24h；更换维持培养液，继续培养18-24h。
s2-2-3，暴露：
去除孔中旧培养基，加入含不同浓度受试物的培养基，受试物最大浓度为ic20，向下设置7个系列浓度，并设置空白对照组；暴露时间24和48h；
s2-2-4，细胞增殖能力测定：
在暴露后的96孔细胞培养板中，每孔加入5mg/ml的mtt溶液20ul，培养箱中孵育4小时，移走培养基，每孔中加入dmso150ul，培养箱中孵育30min，充分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度；
s2-2-5，结果分析：
细胞毒性结果见图1。
细胞增殖结果见图2。
结果显示：细胞毒性试验显示，浓度在<20％时，对角质细胞不产生明显细胞毒性。细胞增殖试验显示，浓度在20％时，对角质细胞产生较明显的促进作用，随浓度较低，促进作用也随之减弱。
实例3首乌提取物促进改善血液循环
s3，血管生成分析
s3-1，样品制备
首乌提取物：取100g的首乌药材，开水清洗2-3次，按照一定料液比加入一定浓度的乙醇，加热回流提取，过滤，收集滤液。减压浓缩至一定生药浓度，加入1,3丁二醇和苯氧乙醇，混合均匀，离心过膜，即得首乌提取物。
s3-2，cam制备
spf级受精鸡胚置于培养箱中进行孵育(37.5℃，rh40-70％)，每天翻转，检查鸡胚发育情况；取发育良好的鸡胚于第7天，酒精消毒蛋壳，在气室端开一约2cm×2cm的区域；小心分离气室膜，完全暴露cam；
s3-3，暴露：
取直径约0.5cm定性滤纸片，轻置于cam表面血管较少的部位，加入50μl受试物，浓度10％，透明膜封口，返回培养箱孵育72h；
s3-4，血管分析：
体视镜下直接观察血管，采集图像，做定性分析。
s3-5，结果：见附图3。
结果显示：图3.1显示，阴性对照无明显促进作用，图3.2和3.3可以看出不同浓度受试物对血管生成具有一定的促进作用，高浓度下促进作用较明显。