一种评价生发/防脱发功效的体外组合方法与流程

文档序号:15457504发布日期:2018-09-15 01:31

本发明涉及一种评价生发/防脱发功效的体外组合方法,可以替代活体动物用 于新原料、新物质等的功效评价。



背景技术:

脱发已经成为困扰现代人的一种常见现象之一,据有关统计我国约有1.6亿人 深受脱发困扰。从年龄上看,90后80后青年,已经成为最被脱发问题困扰的群 体。有报道指出2013-2018年间,全球护发产业预计将以4%的复合年增长率发展, 市场价值将在2018年底达到600亿美元。

传统育发评价方法采用的是动物实验,其具有不确定度大、影响因素多、周 期长、成本高等缺点,以及基于动物福利的要求,不仅不利于实现原料或新物质 的快速、有效、高通量筛查,而且需要使用大量实验动物,有悖于减少、优化和 替代的原则。体外方法是一类利用离体组织、器官等作为实验系统,通过不同的 手段评价、预测体内反应的方法。具有高通量、多终点、条件可控性高等优点, 有利于开发初期的快速有效筛查,但单一方法也存在预测能力有限等不足。

Ⅱ型5α还原酶存在于皮肤、前列腺等部位,可以将雄激素睾酮转化为双氢睾 酮,从而抑制毛发休眠期向生长期过渡,影响毛囊正常生长,引起油脂分泌过多, 导致雄性激素脱发,90%的脱发类型为雄性激素脱发。受试物体外抑制5α还原酶 的活性可以抑制双氢睾酮的生成,从而抑制了双氢睾酮对细胞影响,达到减少脱 发的效果。

真皮乳头细胞(Dermal Papillary Cell,DPC)为毛囊生长的关键细胞,角质细 胞分泌角质纤维形成毛发,细胞的活性和周期是评价是否具有促进细胞增殖的重 要指标。氧化应激被认为是导致细胞衰老和死亡的重要原因之一,拮抗/保护氧化 应激带来的细胞损伤,具有维持细胞正常结构与功能的重要意义。

改善微循环可以促进微血管形成,恢复血液供应,提高细胞的营养,促进细 胞增殖与分化的目的。鸡胚的绒毛膜尿囊膜,其血管丰富、明显,可观察是否能 够促进微血管生成,评价其改善微循环的能力。

我国传统植物资源丰富,近年来大力发展植物原料,许多植物原料宣称具有 明显的功效作用,其中就包括生发/防脱发功效。针对越来越多的植物提取物、新 合成物质,其安全与功效受到了广泛的关注。



技术实现要素:

本发明所要解决的技术问题,就是提供一种评价生发/防脱发功效的体外组合 方法,其有助于开发具有明确生发/防脱发功效的产品,实现植物等原料的快速、 有效筛查,节约时间和人力成本。

解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案如下。

一种评价生发/防脱发功效的体外组合方法,其特征是包括以下步骤:

S1,5α还原酶抑制水平分析;S2,细胞水平功效分析:包括细胞毒性、细胞增殖 能力和抗氧化能力功效分析;S3,血管生成分析。

所述的步骤S1包括以下子步骤:

S1-1,试剂配制:

备料:磷酸缓冲液(pH=7.0)、酶提取液、睾酮溶液、NADPH溶液、非那雄 胺溶液和考马斯亮蓝溶液;

考马斯亮蓝配制:精密称取考马斯亮蓝G-250 100mg,加入95%乙醇50mL, 溶液呈蓝色;搅拌溶解,再加入pH=7.0的85%(W/V)磷酸缓冲液100mL搅拌, 溶液呈血红色;最后用蒸馏水定容至1000mL,溶液变为褐色;在磁力加热搅拌器 上搅拌过夜,用滤纸过滤备用;

蛋白质标准溶液配制:称取牛血清白蛋白配制为0.1mg/mL蛋白质标准液,置 于4℃冰箱中保存;

酶提取液含有:0.32mol/L蔗糖、1mmol/L 1,4-二硫代苏糖醇、0.1mmol /L EDTA、10mmol/L Tric-HCl和20mmol/L磷酸缓冲液;

S1-2,Ⅱ型5α还原酶制备:

取250-300g的雄性SD大鼠4只,禁食不禁水过夜后CO2人道处死,分离取出前列 腺,去除多余组织,于冰台上剪碎;用预冷的磷酸缓冲液在玻璃匀浆器制成1:5 匀浆,10000g(离心机的参数),10min离心两次,去除上层白色脂肪层后取上清 液加入磷酸缓冲液定容至20mL,分装至EP管中,每管1mL,即为粗酶提取物;-80℃ 冰箱保存备用;

S1-3,蛋白定量:

标准曲线绘制:取0.1mg/mL BSA标准液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL,分 别补加蒸馏水至1mL,再加入考马斯亮蓝G-250溶液5mL,混匀,显色5min后 在595nm处测定吸光值,绘制蛋白质的标准曲线;以粗酶代替BSA进行反应, 测定粗酶吸光度值,代入标准曲线中获得总蛋白含量;

S1-4,5α还原酶反应:

在反应体系含有0.5mL磷酸缓冲液,0.1mL50%受试物或对照物,150μL睾酮 溶液,250μL,0.5mL粗酶提取物和2mg/mL NADPH溶液;

在37℃下反应30min,反应结束后加入2mL二氯甲烷使反应停止并萃取睾酮, 再然后加入0.25mL的100μg/mL丙基羟苯酸酯作为内标,摇晃60s,在400×g离 心力下离心10min;去除上层水相,移出1mL有机相并蒸干,残留物溶于1.5mL 甲醇,取10μL高效液相进样测定残留睾酮;

同时设置酶反应管、酶空白管、标准品管和样品管;在反应启动前加入二氯甲 烷使酶失活,设为酶空白管;用0.1mL 50%乙醇替代受试物,设为酶反应管;

S1-5,5α还原酶抑制率测定:

色谱条件:色谱柱:Luna C18(2)柱(4.6×250mm,5μm);

柱温:40℃,进样量:10μL,流速:1mL/min,流动相:70%甲醇

检测波长:242nm;

S1-6,结果分析:

酶反应管的睾酮含量记为T反应,酶空白管的睾酮含量记为T空白,样品管的睾酮 含量记为T样品;睾酮与内标峰面积的比值并记为r;

所述的步骤S2包括以下子步骤:

S2-1,细胞毒性:

S2-1-1,试剂配制

备料:10%FBS细胞培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、PBS和DMSO;

MTT溶液配制:称取MTT 0.5g,溶于100mL的0.01mol/L磷酸缓冲液配制成 5mg/mL的溶液,0.22μm滤器过滤除菌,分装,4℃避光保存;

S2-1-2,细胞制备:

将生长至80%-90%融合的细胞用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化,1200rpm/min, 3-5min离心,得到的细胞沉淀,用完全培养基制成悬液,密度1.0×104/孔(每孔100uL)接种于96孔板;在37℃、5%CO2和饱和湿度下的培养箱中培养1-2天, 待细胞长至80%汇合;

S2-1-3,暴露:

受试物用完全培养基溶解稀释至待测浓度;将96孔板中原来的培养基移走, 每孔加入200uL新鲜的含有受试物的培养基,至少8个系列浓度,同时设立阳性 对照孔:有细胞,受试物为5%SDS;阴性对照孔:有细胞,不加受试物;空白孔: 无细胞,不加受试物,培养液;培养箱中培养24和48h;

S2-1-4,细胞活性测定:

每孔加入5mg/mL的MTT溶液20uL,培养箱中孵育4h,移走培养基,每孔中 加入DMSO 150uL,培养箱中孵育30min,充分混匀后用酶标仪在570nm处测量 每孔的吸光度;

S2-1-5,结果分析:绘制抑制率曲线,计算得出受试物的半数抑制浓度(IC50)和20%抑制浓度(IC20);

S2-2,细胞增殖能力:

S2-2-1,试剂配制:

含10%FBS细胞培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、PBS、MTT溶液、DMSO 维持培养基(含0-2%FBS的细胞培养基)。

S2-2-2,细胞制备:

将生长至80%-90%融合的细胞用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化,1200rpm/min, 3-5min离心,得到的细胞沉淀,用完全培养基制成悬液,密度2.0-3.0×104/mL(每 孔100uL)接种于96孔板,或密度1×105/mL(每孔2mL)接种于6孔板;在37℃, 5%CO2,饱和湿度下的培养箱中培养18-24h;;更换维持培养液,继续培养18-24h。

S2-2-3,暴露:

去除孔中旧培养基,加入含不同浓度受试物的培养基,受试物最大浓度为IC20, 向下设置7个系列浓度,并设置空白对照组;暴露时间24和48h;

S2-2-4,细胞增殖能力测定:

在暴露后的96孔细胞培养板中,每孔加入5mg/mL的MTT溶液20uL,培养箱 中孵育4小时,移走培养基,每孔中加入DMSO 150uL,培养箱中孵育30min,充 分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度;

S2-2-5,结果分析:

细胞活力

各组与对照组进行统计学分析(α=0.05);

S2-3,抗氧化能力:

S2-3-1,试剂配制:

含10%FBS细胞培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、PBS、过氧化氢(H2O2)、 MTT溶液、DMSO;

S2-3-2,细胞制备:

将生长至80%-90%融合的细胞用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化,1200rpm/min, 3-5min离心,得到的细胞沉淀,用完全培养基制成悬液,密度1×104/mL(每孔100uL) 接种于96孔板,或密度1×105/mL(每孔2mL)接种于6孔板;在37℃,5%CO2, 饱和湿度下的培养箱中培养18-24h;

S2-3-3,暴露:

去除原培养基,加入含不同浓度受试物的培养基,需加入过氧化氢造成细胞氧 化损伤,同时设置对照组;暴露时间为24和48h;

S2-3-4,细胞活性测定:

每孔加入5mg/mL的MTT溶液20uL,培养箱中孵育4小时,移走培养基,每 孔中加入DMSO 150uL,培养箱中孵育30min,充分混匀后用酶标仪在570nm处 测量每孔的吸光度;

S2-3-5,抗氧化能力测定:

采用二氯荧光素(DCFH-DA)标记法;DCFH-DA是一种荧光探针,可以特异 性的与ROS结合,当细胞内ROS水平增高时,DCFH-DA的荧光强度相应的增高, 表现为相对于正常细胞荧光强度的升高;

接种于6孔板的细胞,细胞用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化悬浮,离心,用冷 PBS清洗2次,调整细胞密度为1×106/mL,用ROS试剂盒,用流式细胞仪检测;

S2-3-6,结果分析:

细胞活力

绘制细胞活力曲线,分析受试物对H2O2造成氧化损伤的保护作用;

ROS抑制水平

荧光强度均值(MFI)=荧光强度几何平均数;

相对荧光强度

S3,血管生成分析S3-1,材料和试剂:

SPF级受精鸡胚、甲醇、丙酮、10%中性福尔马林固定液、VEGF免疫组化试 剂盒

S3-2,CAM制备:

受精鸡胚置于培养箱中进行孵育(37.5℃,RH40-70%),每天翻转,检查鸡胚 发育情况;取发育良好的鸡胚于第7天,酒精消毒蛋壳,在气室端开一约2cm×2cm 的区域;小心分离气室膜,完全暴露CAM;

S3-3,暴露:

取直径约0.5cm定性滤纸片,轻置于CAM表面血管较少的部位,加入50μL 受试物,透明膜封口,返回培养箱孵育72h;

S3-4,血管分析:

血管图像分析:体视镜下直接观察血管,或从窗口处加入固定液(甲醇:丙酮 =1:1),固定20min后,用镊子取出一层CAM,在玻片上铺平,采集图像,计数血 管分支点数量;

免疫组化:取出CAM后,加入10%中性福尔马林固定液,固定24h后,常规 制作5μm厚度的石蜡切片,根据VEGF免疫组化试剂盒说明书进行操作,最后封 片,显微镜观察,并进行光密度分析;

S3-5,结果分析:

试验组平均血管分支点数量与对照组进行对比,并进行统计学分析,α=0.05;

试验组平均VEGF光密度值与对照组进行对比,并进行统计学分析,α=0.05。

所述的步骤S1中,阳性对照物为5α还原酶还原酶抑制剂,非那雄胺(CAS: 98319-26-7)浓度为0.1-1.0mg/mL。

所述的步骤S2中,所采用的细胞包括人源真皮乳头细胞(hDPC)、永生化人 角质细胞(HaCaT)和人原代角质细胞,,所采用的阳性对照物为米诺地尔,浓度 范围为0.001-1μmol/L;

所述的步骤S2中,细胞毒性和细胞增殖分析,所采用的方法包括MTT法、 中性红法、CCK法和荧光素漏出法;

所述的步骤S2中,细胞抗氧化能力分析采用过氧化氢进行氧化损伤造模,其 浓度范围为5-40μmol/L,造模时间为6-18h;

所述的步骤S2中的采用过氧化氢进行氧化损伤造模,分两种模型:分别为造 模前加入受试物和造模后加入受试物,分别评价受试物对过氧化氢造成的细胞氧 化损伤的保护作用和修复作用。

所述的步骤S3中,图像分析采用体式镜进行图像采集,用图像分析软件进行 分析,计数滤纸外周2-3cm内小血管分支点。

本发明中,在确定的实验条件下,受试物可以抑制5α还原酶活性,促进细胞 增殖,对氧化损伤具有拮抗/保护作用,能够促进微血管循环,可作为具有潜在生 发/防脱发功效的有力证据,受试物可作为育发体系的组成成分。

附图说明

图1不同浓度受试物对HaCaT的细胞毒性示意图;

图2不同浓度受试物对HaCaT的细胞增殖示意图(*:p<0.05);

图3.1为0h时间点血管图像(空白对照);

图3.2为24h时间点血管图像(10%样品);

图3.3为48h时间点血管图像(30%样品);

图3.4为72h时间点血管图像.

(左上为0h,右上为24h,左下为48h,右下为72h)。

具体实施方式

实例1生姜提取物的酶抑制作用

S1,5α还原酶抑制体外模型

S1-1,试剂配制:磷酸缓冲液(pH=7.0)、酶提取液、睾酮溶液、NADPH溶 液、非那雄胺溶液和考马斯亮蓝溶液;

考马斯亮蓝配制:精密称取考马斯亮蓝G-250 100mg,加入95%乙醇50mL, 溶液呈蓝色;搅拌溶解,再加入pH=7.0的85%(W/V)磷酸缓冲液100mL搅拌, 溶液呈血红色;最后用蒸馏水定容至1000mL,溶液变为褐色;在磁力加热搅拌器 上搅拌过夜,用滤纸过滤备用;

蛋白质标准溶液配制:称取牛血清白蛋白配制为0.1mg/mL蛋白质标准液,置 于4℃冰箱中保存;

酶提取液含有:0.32mol/L蔗糖、1mmol/L 1,4-二硫代苏糖醇、0.1mmol /L EDTA、10mmol/L Tric-HCl和20mmol/L磷酸缓冲液;

姜汁提取物:取100g生姜,清洗干净,消毒杀菌,破碎仪榨汁,收集姜汁,离心 过滤,取上清液,过膜,加入1,3丁二醇和苯氧乙醇,混合均匀,即得姜汁提取物。 测试时用无菌水按体积分数稀释成30%、10%和1%三个浓度。

S1-2,Ⅱ型5α还原酶制备:

取250-300g的雄性SD大鼠4只,禁食不禁水过夜后CO2人道处死,分离取出前列 腺,去除多余组织,于冰台上剪碎;用预冷的磷酸缓冲液在玻璃匀浆器制成1:5 匀浆,10000g,10min离心两次,去除上层白色脂肪层后取上清液加入磷酸缓冲液 定容至20mL,分装至EP管中,每管1mL,即为粗酶提取物;-80℃冰箱保存备用;

S1-3,蛋白定量:

标准曲线绘制:取0.1mg/mL BSA标准液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL,分 别补加蒸馏水至1mL,再加入考马斯亮蓝G-250溶液5mL,混匀,显色5min后 在595nm处测定吸光值,绘制蛋白质的标准曲线;以粗酶代替BSA进行反应, 测定粗酶吸光度值,代入标准曲线中获得总蛋白含量;

S1-4,5α还原酶反应:

在反应体系含有0.5mL磷酸缓冲液,0.1mL50%受试物或对照物,150μL睾酮 溶液,250μL,0.5mL粗酶提取物和2mg/mL NADPH溶液;

在37℃下反应30min,反应结束后加入2mL二氯甲烷使反应停止并萃取睾酮, 再然后加入0.25mL的100μg/mL丙基羟苯酸酯作为内标,摇晃60s,在400×g离 心力下离心10min;去除上层水相,移出1mL有机相并蒸干,残留物溶于1.5mL 甲醇,取10μL高效液相进样测定残留睾酮;

同时设置酶反应管、酶空白管、标准品管和样品管;在反应启动前加入二氯甲 烷使酶失活,设为酶空白管;用0.1mL 50%乙醇替代受试物,设为酶反应管;

S1-5,5α还原酶抑制率测定:

色谱条件:色谱柱:Luna C18(2)柱(4.6×250mm,5μm);

柱温:40℃,进样量:10μL,流速:1mL/min,流动相:70%甲醇

检测波长:242nm;

S1-6,结果分析:

结果显示:10%和1%的姜汁提取物对5α还原酶有一定的抑制作用,表明其可 能具有抑制雄性激素脱发的功效。

实例2当归提取物细胞功效分析

S2,细胞功效分析

S2-1,细胞毒性

S2-1-1,试剂配制:10%FBS细胞培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、PBS和 DMSO;MTT溶液配制:称取MTT 0.5g,溶于100mL的0.01mol/L磷酸缓冲液配 制成5mg/mL的溶液,0.22μm滤器过滤除菌,分装,4℃避光保存;

S2-1-2当归提取物:取100g的当归药材,开水清洗2-3次,按照一定料液比加入一定浓度 的乙醇,加热回流提取,过滤,收集滤液。减压浓缩至一定生药浓度,加入1,3丁二醇和苯氧乙 醇,混合均匀,离心过膜,即得当归提取物。细胞毒性测试时在0.5~80%范围内设置8个浓度。 功效测试时,在无毒性的范围内选择5个浓度进行分析。

S2-1-3,细胞制备:

将生长至80%-90%融合的HaCaT细胞用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化, 1200rpm/min,3-5min离心,得到的细胞沉淀,用完全培养基制成悬液,密度1.0×104/ 孔(每孔100uL)接种于96孔板;在37℃,5%CO2,饱和湿度下的培养箱中培养 1-2天,待细胞长至80%汇合;

S2-1-4,暴露:

受试物用完全培养基溶解稀释至待测浓度;将96孔板中原来的培养基移走, 每孔加入200uL新鲜的含有受试物的培养基,至少8个系列浓度,同时设立阳性 对照孔:有细胞,受试物为5%SDS;阴性对照孔:有细胞,不加受试物;空白孔: 无细胞,不加受试物,培养液;培养箱中培养24和48h;

S2-1-5,细胞活性测定:

每孔加入5mg/mL的MTT溶液20uL,培养箱中孵育4h,移走培养基,每孔中 加入DMSO 150uL,培养箱中孵育30min,充分混匀后用酶标仪在570nm处测量 每孔的吸光度;

S2-2,细胞增殖能力:

S2-2-1,试剂配制:含10%FBS的DMEM培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、 PBS、MTT溶液、DMSO,维持培养基:含1%FBS的DMEM培养基

S2-2-2,细胞制备:

将生长至80%-90%融合的细胞用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化,1200rpm/min, 3-5min离心,得到的细胞沉淀,用完全培养基制成悬液,密度2.0-3.0×104/mL(每 孔100uL)接种于96孔板,或密度1×105/mL(每孔2mL)接种于6孔板;在37℃, 5%CO2,饱和湿度下的培养箱中培养18-24h;更换维持培养液,继续培养18-24h。

S2-2-3,暴露:

去除孔中旧培养基,加入含不同浓度受试物的培养基,受试物最大浓度为IC20, 向下设置7个系列浓度,并设置空白对照组;暴露时间24和48h;

S2-2-4,细胞增殖能力测定:

在暴露后的96孔细胞培养板中,每孔加入5mg/mL的MTT溶液20uL,培养箱 中孵育4小时,移走培养基,每孔中加入DMSO 150uL,培养箱中孵育30min,充 分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度;

S2-2-5,结果分析:

细胞毒性结果见图1。

细胞增殖结果见图2。

结果显示:细胞毒性试验显示,浓度在<20%时,对角质细胞不产生明显细胞毒 性。细胞增殖试验显示,浓度在20%时,对角质细胞产生较明显的促进作用,随 浓度较低,促进作用也随之减弱。

实例3首乌提取物促进改善血液循环

S3,血管生成分析

S3-1,样品制备

首乌提取物:取100g的首乌药材,开水清洗2-3次,按照一定料液比加入一定浓度的乙醇, 加热回流提取,过滤,收集滤液。减压浓缩至一定生药浓度,加入1,3丁二醇和苯氧乙醇,混合 均匀,离心过膜,即得首乌提取物。

S3-2,CAM制备

SPF级受精鸡胚置于培养箱中进行孵育(37.5℃,RH40-70%),每天翻转,检 查鸡胚发育情况;取发育良好的鸡胚于第7天,酒精消毒蛋壳,在气室端开一约 2cm×2cm的区域;小心分离气室膜,完全暴露CAM;

S3-3,暴露:

取直径约0.5cm定性滤纸片,轻置于CAM表面血管较少的部位,加入50μL 受试物,浓度10%,透明膜封口,返回培养箱孵育72h;

S3-4,血管分析:

体视镜下直接观察血管,采集图像,做定性分析。

S3-5,结果:见附图3。

结果显示:图3.1显示,阴性对照无明显促进作用,图3.2和3.3可以看出不同 浓度受试物对血管生成具有一定的促进作用,高浓度下促进作用较明显。

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