一种光控基因表达系统及其应用的制作方法

文档序号：15457456发布日期：2018-09-15 01:30阅读：1233来源：国知局

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种利用光控细胞裂解的方法。

背景技术：

因为基因工程技术开发的许多产品在细胞内生成，不容易跨越细胞膜和细胞壁进入培养液中，所以分离纯化这些产品之前往往需要裂解细胞。传统的生产工艺中，人们需要通过较苛刻的物理或化学手段(如高温、强碱等)破坏细胞壁，从而获得目的产物。然而，这些细胞破裂的方法存在诸多弊端，不仅会降低产品的稳定性，而且对设备、场地、人员、能耗和废弃物治理等方面要求较高。因此，市场迫切需要一种较温和的细胞裂解的方法，从而降低细胞内生成的产品的生产成本以及相应的废弃物治理成本。

自然环境中，病毒(噬菌体)可以高效地降解细胞。这往往和病毒表达的裂解酶相关。例如，大肠杆菌λ噬菌体表达的裂解酶lysin可以十分迅速地裂解大肠杆菌细胞。因此，通过克隆裂解酶的编码基因并在合适的条件下诱导其表达，将可实现细胞的高效裂解。其中，选择合适的基因诱导条件是制约该细胞裂解工艺生产的关键。

目前，调控基因表达的诱导剂主要为小分子化合物(如：异丙基硫代半乳糖苷、阿拉伯糖、木糖等)。然而，通过化学诱导剂诱导微生物细胞裂解的方法给现有生产工艺带来了较大挑战。因为诱导细胞裂解需要在细胞完成目的产物表达或合成之后进行，所以诱导剂的进料时间需严格控制；细胞培养装置中残留的化学诱导剂将可能导致后续生产中细胞在生长过程中裂解，从而对目的产物的产量造成难以预计的影响。此外，化学诱导剂的价格相对较高，进一步增加了相应的生产成本。

光在自然环境中十分容易获取，相对于传统的化学诱导剂而言，光作为基因表达调控的诱导剂不仅成本低廉，而且还能够实现时空上的精确调控，因此利用光作为诱导剂来调控裂解基因的表达可以解决生产工艺中化学诱导剂带来的诸多问题。本发明利用光控系统调控细胞裂解，其顺利实施将不仅大幅降低传统工艺中细胞裂解的生产成本和环境治理成本，而且避免了化学诱导剂诱导细胞裂解技术对现有生产工艺带来的潜在影响，具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种利用光控制细胞裂解的方法，利用全基因合成技术和基因工程技术建立了一套光控基因表达系统，该光控基因表达系统与裂解基因相连形成一套光控细胞裂解系统，成功应用该光控系统裂解细胞。该发明在基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程等领域具有广阔的应用价值。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供一种光控基因表达系统，所述光控基因表达系统是由yf1基因、fixj基因和egfp基因组成，所述yf1基因采用bba_j23100启动子(seqidno.2所示)，所述egfp基因采用p’fixk2启动子(seqidno.4所示)，并在fixj基因和egfp基因后分别添加bba_b0015转录终止子(seqidno.3所示)。

进一步，所述光控基因表达系统核苷酸序列为seqidno.5所示。

本发明还提供一种所述光控基因表达系统在细胞可控培养中的应用，所述应用是将细胞裂解基因与光控基因表达系统共同导入宿主菌，在37℃进行细胞培养，若光诱导培养，则实现细胞生长；若避光培养，则实现细胞裂解。

进一步，所述细胞裂解基因为lys基因(seqidno.6所示)。

进一步，所述光控基因表达系统在导入宿主菌前，先将光控基因表达系统导入质粒puc57后再导入宿主菌。

进一步，所述宿主菌构建方法为：将光控基因表达系统导入载体puc57，获得重组质粒pzjutigem0001；将细胞裂解基因lys转入质粒puc57，酶切后与含阿拉伯糖启动子的载体pglo连接，获得重组质粒pglo-lys；将lys基因从重组质粒pglo-lys上克隆至重组质粒pzjutigem0001后转入宿主菌。

进一步，所述的细胞培养是将宿主菌置于光诱导装置中进行培养；所述光诱导装置由筒体和遮光盖构成，所述筒体内壁设有可控光源，筒体顶部设有固定微生物培养瓶的支撑架，所述微生物培养瓶的瓶口有遮光塞，所述支撑架和微生物培养瓶与筒体内壁遮光配合。所述筒体外设有控制光源的开关，打开电源即为光诱导培养，关闭电源则为避光培养。

进一步，所述可控光源为40w的led蓝光灯。

进一步，所述光诱导装置在摇床中180rpm条件下培养。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

传统细胞裂解方法存在高能耗、高成本、高污染等弊端。本发明利用光控系统调控细胞裂解，无需传统细胞裂解工艺必需的设备、场地、人员等，可大幅降低细胞裂解成本；无需高温高压、强碱等高能耗高污染条件，降低环境污染治理成本；此外，光诱导细胞裂解技术可有效地避免了化学诱导剂诱导细胞裂解技术对细胞培养的不利影响，解除对基因诱导表达时空条件的限制，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为光控基因表达系统改造示意图。

图2为细胞裂解光控基因表达系统构建示意图。

图3为用于培养含光控基因表达系统细胞的光诱导装置；a为正面照片；b为顶部照片；c为结构示意图，1-支撑架，2-筒体；3-试管；4-可控光源；5-控制光源的电源及其开关；6-遮光盖；7-试管塞。

图4为实施例1中原光控基因表达系统的活性检测结果图。

图5为实施例1中含新光控基因表达系统的pzjutigem0001质粒图谱。

图6为实施例1中新光控基因表达系统诱导gfp表达的结果图。

图7为实施例2中阿拉伯糖启动子诱导裂解基因lys表达导致细胞裂解结果图。

图8为实施例2中含新光控细胞裂解系统的pzjutigem0002质粒图谱。

图9为实施例2中光控基因表达系统诱导细胞裂解的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1光控基因表达系统构建及其活性检测

1、光诱导装置

参照图3，光诱导装置由筒体2和遮光盖6构成，所述筒体内壁设有可控光源4，筒体顶部设有固定培养微生物试管3的支撑架1，所述微生物试管3的瓶口有遮光塞7，所述支撑架和微生物培养瓶与筒体内壁遮光配合。所述筒体外设有控制光源的电源开关5，所述可控光源为40w的led蓝光灯。

2、光控基因表达系统的构建

(1)核苷酸序列为seqidno.1所示的原始光控基因表达系统由上海交通大学马钢博士馈赠，基因测序结果表明该系统由yf1、fixj和mrfp报告基因组成，采用placiq启动子启动yf1基因，pfixk2启动子启动mrfp基因。原始光控基因表达系统存在于中等拷贝质粒载体pbr322上。将上述携带光控基因表达系统的质粒载体通过化学转化的方法导入大肠杆菌bl21中，具体方法如下：生长至对数期的大肠杆菌bl21(1ml)离心获得菌体沉淀，经50mmcacl2水溶液洗涤菌体2次后重悬于0.2ml、50mm、cacl2水溶液，从而制备相应的感受态细胞；质粒加至50ul感受态细胞重悬液中，经42℃热激90秒后加入950ullb培养基(酵母膏5g/l、蛋白胨10g/l、nacl5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然)，涂布于含氨苄青霉素抗性的选择性平板上筛选获得含质粒的抗性菌落。采用步骤3的实验条件进行光控基因表达系统活性检测，未能检测出明显的光控效果，与导入了不含光控基因表达系统的空载体pbr322菌液样品相比，无明显的红色荧光检出(图4中a)。

(2)将步骤(1)中placiq启动子更换为核苷酸序列为seqidno.2所示的启动子bba_j23100、lacz启动子或阿拉伯糖启动子，但仍未检出明显的光控效果(图4中b)。

(3)将步骤(1)中红色荧光报告基因mrfp更换为核苷酸序列为seqidno.7的增强型绿色荧光报告基因egfp(图4中c)，但仍未检出明显的光控效果。

(4)在上述改造无效的情况下，本发明对seqidno.1光控基因表达系统进行了如下系列改造：a)bba_j23100启动子替换placiq启动子，b)fixj基因后添加igem标准组件bba_b0015转录终止子，c)以启动子p’fixk2(jmolbiol,2012,416:534-42)替换原启动子pfixk2，d)报告基因egfp替换mrfp报告基因，e)efgp基因末尾添加igem标准组件bba_b0015转录终止子，最终构建出核苷酸序列为seqidno.5所示的光控基因表达系统，通过全基因合成的方式完成，并用高拷贝数的puc复制子替换中等拷贝数的pbr322复制子，将光控基因表达系统导入载体puc57，相应的重组质粒命名为pzjutigem0001，其质粒图谱见图5，其序列详见seqidno.8。

3、光控基因表达系统活性检测

下面介绍光控基因表达系统活性的检测方法。

(1)通过化学转化的方法将携带光控基因表达系统的质粒pzjutigem0001导入大肠杆菌bl21宿主菌中，具体方法如下：生长至对数期的大肠杆菌bl21(1ml)离心获得菌体沉淀，经50mmcacl2水溶液洗涤菌体2次后重悬于0.2ml、50mm、cacl2水溶液，从而制备相应的感受态细胞；质粒加至50ul感受态细胞重悬液中，经42℃热激90秒后加入950ullb培养基(酵母膏5g/l、蛋白胨10g/l、nacl5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然)，涂布于含氨苄青霉素抗性的选择性平板上筛选获得含质粒的抗性菌落，即可获得携带光控基因表达系统的重组大肠杆菌bl21/pzjutigem0001。

(2)光控基因表达系统活性检测：重组大肠杆菌bl21/pzjutigem0001接种至lb培养基中，37℃自然光照条件下过夜培养。次日，按体积浓度1％接种至新鲜lb培养液中，分别置于步骤1所述光诱导装置和黑暗条件下，37℃恒温培养。培养过程中取两种条件下的培养液，通过酶标仪测定各自的绿色荧光值，测定绿色荧光的激发波长(ex)和发射波长(em)分别为488nm和516nm。

检测结果显示，光诱导装置中培养的重组大肠杆菌bl21/pzjutigem0001表达的绿色荧光强度显著低于黑暗条件表达的绿色荧光强度(图6)，证明所构建的光控基因表达系统能够调控其下游基因egfp表达。

实施例2光控基因表达系统诱导细胞裂解

(1)检测裂解基因lys的活性：seqidno.6所示裂解基因lys通过全基因合成的方法获得，采用同源重组介导的一步克隆的方法将该lys基因克隆至pglo质粒的阿拉伯糖启动子para后，构建受阿拉伯糖启动子调控的裂解系统，具体方法如下：以核苷酸序列为seqidno.9和seqidno.10所示的引物进行pcr扩增lys基因，扩增模板为全基因合成获得的质粒puc57-lys，pcr产物上携带nheiandecori酶切位点；nheiandecori酶酶切上述pcr产物和含阿拉伯糖启动子的质粒载体pglo，二者连接后转化大肠杆菌，所采用的转化方法如实施例1所述，所获得的转化子中含有目的重组质粒pglo-lys，其上携带受阿拉伯糖启动子调控的裂解基因lys。含pglo-lys的大肠杆菌在添加2.7mm阿拉伯糖的lb培养基和不添加阿拉伯糖的lb培养基中培养(温度：37℃，转速180rpm)，培养过程中监测细菌培养物的光密度(od600)。检测结果表明，加入阿拉伯糖后细菌培养物的od600值显著降低，表明裂解基因可表达裂解蛋白，导致细胞裂解(图7)。

(2)构建光控细胞裂解系统及其活性检测。采用同源重组介导的一步克隆的方法将lys基因从pglo-lys质粒上克隆至pzjutigem0001质粒上，使其受光控系统调控，从而构建光控细胞裂解系统。具体方法如下：以核苷酸序列为seqidno.11和seqidno.12所示的引物，以重组质粒pglo-lys为模板进行pcr扩增lys基因，使其携带载体上的同源臂，获得pcr产物a；以核苷酸序列为seqidno.13和seqidno.14所示的引物，以质粒pzjutigem0001为模板进行pcr扩增，获得pcr产物b；采用一步克隆试剂盒(vazymebiotech公司)，连接pcr产物a和pcr产物b，连接产物转化大肠杆菌，所得转化子的重组质粒pzjutigem0002上携带受光信号调控的裂解基因lys，其质粒图谱见附图8，其序列如seqidno.15所示。

将pzjutigem0002通过化学转化的方法导入大肠杆菌bl21菌株中，具体方法如实施例1所述，从而构建携带光控细胞裂解系统的重组大肠杆菌bl21/pzjutigem0002。将重组大肠杆菌bl21/pzjutigem0002接种至新鲜lb培养基中，置于光诱导装置中和黑暗条件下37℃恒温培养。培养过程中取两种条件下的培养液，通过酶标仪测定各自在600nm处的吸光值，得到其od600值，据此判断细胞裂解状况。检测结果显示，光诱导装置中培养液的od600值显著高于黑暗条件培养液的od600值，证明所构建的光控系统能够调控其下游基因lys表达(图9)，导致细胞裂解。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>一种光控基因表达系统及其应用

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