一种与乳腺癌辅助诊断相关的位于X染色体上的循环miRNA标志物及其应用的制作方法

文档序号:15457547发布日期:2018-09-15 01:32

本发明属于基因工程及肿瘤学领域,涉及一种与乳腺癌辅助诊断相关的位于X染色体上的循环miRNA标志物及其应用。



背景技术:

乳腺癌(Breast Cancer,BC)是女性最常见的恶性肿瘤,据最新世界癌症报告(World Cancer Report 2014),其占全球女性所患恶性肿瘤的25.2%。在中国,乳腺癌发病率呈上升趋势,2015年中国女性乳腺癌发病率居恶性肿瘤第一位,致死率居第六位。目前现有的检查手段如乳腺超声检查、钼靶检查、核磁共振检查以及空心针穿刺活检,均需有一定体积的肿瘤组织方能检测,在乳腺癌的早期诊断存在一定的局限性;而临床常用的如糖类抗原15-3(CA15-3)等肿瘤标志物,其敏感性或特异性不高。随着基因组学、蛋白组学以及代谢组学等生物技术的发展,越来越多的生物标志物已被发现或研究。因此,发现新的能够早期诊断乳腺癌的标记物指日可待,从而促进乳腺癌早期干预和治疗,延长病人的生存期。

微小RNA(miRNAs)是一类进化保守、长度在18-25个左右的核苷酸的小非编码RNA分子,其通过转录后调控广泛参与机体的众多生理病理过程,包括肿瘤的发生、侵袭及转移等。miRNA的表达具有时间特异性以及组织特异性,一些miRNA能够参与特定的生理病理以及特异的疾病过程。研究发现,miRNA的表达在肿瘤中有不同程度的上调和下调,为其能够作为一种新兴的肿瘤标志物奠定了基础。2008年,Mitchell在外周血中检测到游离的miRNA,发现其能够稳定存在于外周血中,并且可以作为诊断肿瘤的无创标志物。这一研究发现拉开了全球众多研究者开始探索循环miRNA作为无创标志物的大幕。现已有研究证实了循环miRNA在乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌等肿瘤中的潜在诊断价值。但由于研究方法及纳入人群的差异,导致研究结果不完全一致。因此,本研究基于qRT-PCR的绝对定量法,通过对大样本的乳腺癌血清及血浆的研究,旨在寻找对乳腺癌具有潜在诊断价值的循环miRNA。并对这些miRNA在乳腺癌组织中以及外周外泌体中的表达进行验证,以进一步明确其与乳腺癌的关系。若根据这类miRNA设计针对于乳腺癌的诊断试剂盒,将会推动我国乳腺癌的诊治水平,也为将来对乳腺癌的进一步研究提供思路。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一种与乳腺癌辅助诊断相关的位于X染色体上的循环miRNA标志物。

本发明的另一目的在于提供上述循环miRNA标志物及其引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒以及在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

本发明的又一目的在于提供用于乳腺癌辅助诊断和治疗的试剂盒及药物。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现:

一种与乳腺癌辅助诊断相关的循环miRNA标志物,该标志物为血浆标志物miR-106a-3p(CUGCAAUGUAAGCACUUCUUAC),miR-106a-5p(AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG),miR-20b-5p(CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG),miR-92a-2-5p(GGGUGGGGAUUUGUUGCAUUAC),miR-500a-5p(UAAUCCUUGCUACCUGGGUGAGA),miR-501-5p(AAUCCUUUGUCCCUGGGUGAGA),miR-188-3p(CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA),miR-let-7f-5p(UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU)和miR-98-5p(UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU)以及血清标志物miR-106a-5p(AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG),miR-19b-3p(UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA),miR-20b-5p(CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG),miR-92a-3p(UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU),miR-501-3p(AAUGCACCCGGGCAAGGAUUCU),miR-502-3p(AAUGCACCUGGGCAAGGAUUCA),miR-532-3p(CCUCCCACACCCAAGGCUUGCA),miR-532-5p(CAUGCCUUGAGUGUAGGACCGU)和miR-188-3p(CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA)中的一种或多种。该循环miRNA标志物优选为血浆标志物miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-501-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p和miR-98-5p以及血清标志物miR-106a-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p,miR-532-3p,miR-532-5p和miR-188-3p中两种或两种以上的组合,进一步优选为血浆miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-501-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p和miR-98-5p以及血清miR-106a-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p,miR-532-3p,miR-532-5p和miR-188-3p十八种miRNA所组成的组合。

上述的循环miRNA标志物在辅助诊断乳腺癌中的应用。

上述的循环miRNA标志物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒或治疗乳腺癌药物中的应用。

一种与乳腺癌辅助诊断相关的循环miRNA标志物的引物,该引物包含血浆miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-501-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p和miR-98-5p以及血清miR-106a-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p,miR-532-3p,miR-532-5p和miR-188-3p中的一种或多种miRNA的引物;优选为包含血浆miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-501-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p和miR-98-5p以及血清miR-106a-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p,miR-532-3p,miR-532-5p和miR-188-3p中两种或两种以上miRNA的引物;进一步优选为包含血浆miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-501-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p和miR-98-5p以及血清miR-106a-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p,miR-532-3p,miR-532-5p和miR-188-3p十八种miRNA的引物。

上述的引物在辅助诊断乳腺癌或制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

一种乳腺癌辅助诊断试剂盒,该试剂盒中含有血浆miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-501-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p和miR-98-5p以及血清miR-106a-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p,miR-532-3p,miR-532-5p和miR-188-3p中的一种或多种miRNA的引物;优选为含有血浆miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-501-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p和miR-98-5p以及血清miR-106a-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p,miR-532-3p,miR-532-5p和miR-188-3p中两种或两种以上miRNA的引物;进一步优选为含有血浆miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-501-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p和miR-98-5p以及血清miR-106a-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p,miR-532-3p,miR-532-5p和miR-188-3p十八种miRNA的引物。

该试剂盒中还包括PCR技术常用的试剂,如逆转录酶,缓冲液,dNTPs,MgCl2,DEPC水和Taq酶等;还可以含有标准品和/或对照品。

本发明所涉及的与乳腺癌诊断相关的循环miRNA标志物miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-501-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p,miR-98-5p,miR-19b-3p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p,miR-532-3p和miR-532-5p中的每种miRNA的序列均已公开,但是将各miRNA标志物进行组合作为乳腺癌辅助诊断标志物需要本领域技术人员付出创造性劳动。各miRNA标志物的扩增引物均可通过市场购买获得,本发明实施例中使用的循环miRNA标志物的引物为购自广州锐博公司所合成生产的特异性miRNA茎环RT-PCR引物。

具体地说,本发明解决问题的技术方案包括:(1)建立统一标准的标本库和数据库:以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本,系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)血清及血浆miRNA差异表达谱分析:分析乳腺癌和正常对照人群中差异表达的循环miRNA,并对差异表达miRNAs进行进一步大样本多阶段验证。(3)通过多阶段的验证,明确这些miRNA诊断乳腺癌的能力。(4)循环miRNA诊断试剂盒的研制:根据乳腺癌患者与正常人群血清及血浆中的差异表达miRNA开发miRNAs诊断试剂盒,实现对乳腺癌患者的无创辅助诊断。(4)分析这些miRNA在乳腺癌组织以及外泌体中的表达情况,揭示这些miRNA与乳腺癌的关系,为将来研制可能与这些miRNA相关的治疗乳腺癌的药物提供依据。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本,系统收集完整的人口学资料、临床资料,并采用了qRT-PCR方法等。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分:

1.研究样本选择:初治、未行手术以及放化疗干预且经病理确认为乳腺癌的患者。正常对照为在医院进行体检的正常人群。

2.训练集、验证集:利用AM1556试剂盒(ABI公司)对每个血清、血浆样本进行RNA提取,通过逆转录反应得到cDNA样品,加入PCR引物和SYBR Green荧光染料进行PCR反应。通过比对标准品的Ct值,得出样本中的miRNA含量。

3.利用TRIZOL-LS试剂提取乳腺癌和癌旁组织中的RNA,ExoQuick试剂盒(SBI公司)和AM1556试剂盒(ABI公司)提取外泌体中的RNA,通过qRT-PCR的方法,检测miRNA在组织以及外泌体中的表达差异。

4.统计分析:运用χ2检验、配对t检验以及非参数秩和检验比较miRNA表达水平在不同研究组中的差异。通过计算ROC曲线分析证实血清及血浆miRNA的诊断价值。

本发明研究组目前通过对乳腺癌病人的外周血清及血浆中的miRNA进行系统的表达分析,现已发现了一组18个具有临床诊断潜能的乳腺癌循环microRNA标志物(血浆标志物miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-501-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p和miR-98-5p以及血清标志物miR-106a-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p,miR-532-3p,miR-532-5p和miR-188-3p)。

本发明的有益效果:

1.相较于传统的肿瘤标志物,循环miRNA作为新型的生物标志物,具有稳定性好、微创易获取、灵敏性和特异性高的特点。这类分子标志物的开发利用将为包括肿瘤在内的各种疾病的诊断以及进一步治疗提供新的方向。

2.研究者通过qRT-PCR的相对定量法,对乳腺癌和正常对照人群血清及血浆中的差异表达miRNA进行严密、多阶段的验证和评价。证实了这组miRNA作为诊断乳腺癌的无创标记物的可靠性以及可重复性。

3.研究者发现miR-106a-5p和miR-20b-5p在乳腺癌组织中的表达均与血浆及血清中表达均显著升高;同时,血浆中miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p和miR-98-5p以及血清中miR-106a-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p和miR-188-3p在乳腺癌外泌体中的表达亦明显高于正常人群。均显示了这组miRNA与乳腺癌之间的紧密关系。此外,血浆miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p和miR-92a-2-5p在I期和II期乳腺癌患者中的表达水平明显高于III期的乳腺癌患者,血浆miR-106a-5p,miR-20b-5p和miR-92a-2-5p在激素受体阳性的患者中表达远高于激素受体阴性者,血浆miR-106a-5p和miR-20b-5p在HER2无扩增的患者中表达远高于HER2有扩增者。这些结果将给未来研究这些miRNA对于乳腺癌的机制以及针对这些miRNA对于乳腺癌的治疗提供新的思路。

附图说明

图1:实验流程图

图2:在乳腺癌患者血浆样本中高表达的9个miRNA

图3:在乳腺癌患者血清样本中高表达的9个miRNA

图4:对所获得的乳腺癌患者血浆miRNA进行ROC曲线分析

其中,A1:训练集;A2:验证集;A3:训练集与验证集的合集

图5:对所获得的乳腺癌患者血清miRNA进行ROC曲线分析

其中,B1:训练集;B2:验证集;B3:训练集与验证集的合集

图6:血浆miRNA在乳腺癌患者不同组织学分期、激素受体状态以及HER2有无扩增状态的差异表达

其中,A:组织学分期;B:激素受体状态;C:HER2有无扩增状态

图7:miR-106a-5p和miR-20b-5p在乳腺癌组织中高表达

图8:血浆样本中9个miRNA在乳腺癌患者外泌体中的表达情况

图9:血清样本中9个miRNA在乳腺癌患者外泌体中的表达情况

具体实施方式

发明人于2014年至2016年从南京医科大学第一附属医院收集了大量的乳腺癌患者和正常体检人群的静脉血清及血浆样品,通过对样品资料的整理,从中选择了290例乳腺癌和402例正常对照的样本作为qRT-PCR验证的实验样品。同时还留取了32例乳腺癌组织和32例癌旁组织。所选择的患者血清样本均来自于初治、未行手术以及放化疗干预且经病理确认为乳腺癌的病人。并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料。

参照流程图(图1),对于位于X染色体上来自三个簇的32个miRNA,通过训练集和验证集,采用基于qRT-PCR的相对定量法进行验证,具体步骤为:

1.血清/血浆RNA提取:选用ABI公司血清RNA提取试剂盒(AM1556),参照试剂盒说明,每个样本吸取200ul进行提取RNA,并最后用100ul DEPC水进行溶解。

2.cDNA的制备:

1)采用50μL反应体系进行逆转录实验

以上反应体系混匀,瞬时离心后,以下列程序进行反应:

2)上述反应之后再反应体系中再加入如下反应物

3.qPCR

1)采用5μL反应体系,按以下比例进行试验

反应体系混匀,瞬时离心后,放置于实时定量PCR仪中,以下列程序进行反应:

反应结束后添加溶解曲线。

数据分析:利用SPSS 16.0软件进行统计分析,得到了一组在训练集和验证集中均一致于乳腺癌循环中高表达的9个血浆miRNA:miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-501-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p和miR-98-5p以及9个血清:miR-106a-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p,miR-532-3p,miR-532-5p和miR-188-3p(在训练集和验证集中P值都小于0.05,图2和图3)。通过这18个miRNA,可以计算每个样本的ROC曲线。如图4和图5,这18个miRNA组成的分子标志物能够很好的区分乳腺癌患者和正常人群。并且通过亚组分析,发现血浆miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-20b-5p和miR-92a-2-5p在I期和II期乳腺癌患者中的表达水平明显高于III期的乳腺癌患者,血浆miR-106a-5p,miR-20b-5p和miR-92a-2-5p在激素受体阳性的患者中表达远高于激素受体阴性者,血浆miR-106a-5p和miR-20b-5p在HER2无扩增的患者中表达远高于HER2有扩增者(图6)。

研究组之后进一步检测了这18个miRNA在乳腺癌组织以及血清和血浆中外泌体的表达,乳腺癌组织提取RNA利用TRIZOL,外泌体提取试剂盒为ExoQuick试剂盒(SBI公司)。200ul血清/血浆所提取出的外泌体用200ul DEPC水重悬后,利用AM1556试剂盒(ABI公司)对外泌体RNA进行提取,步骤同血清/血浆RNA提取过程。

运用非参数检验分析发现,miR-106a-5p和miR-20b-5p在乳腺癌组织中的表达要高于癌旁组织(图7)。血浆中miR-106a-3p,miR-106a-5p,miR-92a-2-5p,miR-500a-5p,miR-188-3p,miR-let-7f-5p和miR-98-5p以及血清中miR-106a-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p,miR-92a-3p,miR-501-3p,miR-502-3p和miR-188-3p在乳腺癌外泌体中的表达亦明显高于正常人群(图8和图9)。

试剂盒包括一批血清及血浆miRNA qRT-PCR引物,还可以有相应PCR技术所需的常用试剂,如:逆转录酶,缓冲液,dNTPs,MgCl2,DEPC水,荧光探针,RNA酶抑制剂,Taq酶等,可根据具体采用的实验方法选用,这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的,另外还可以有标准品和对照(如定量标化的正常人样本等)。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品,通过最精简的荧光法检测血清/血浆样本中miRNA的表达含量,来辅助诊断该样本来源患者的患乳腺癌的可能性。血清及血浆miRNA检测方便,且定量精确,大大提高疾病诊断的敏感性和特异性,因此将此试剂盒投入实践,可以帮助指导诊断以及进一步的个体化治疗。

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