本发明涉及一种绵羊促卵泡激素基因重组表达制备方法。
背景技术：
卵泡刺激素又称促卵泡激素(folliclestimulatinghormone，fsh)，是一种糖蛋白激素，分子量约为30kd，属于糖蛋白激素家族。它能促进颗粒细胞增生，刺激类固醇生成，调节配子细胞的发育和成熟，由动物垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，属于下丘脑-垂体-性腺轴中的主要激素之一，fsh是由两个非共价结合可解离的亚基所组成，称为α-亚基和β-亚基，α-亚基由92～96个氨基酸组成，β-亚基由109～115个氨基酸组成。两亚基通过内部二硫键维持自身正确的三级结构，c端残基的位置决定其折叠的三维空间结构。糖基是以n-糖苷键的方式连接在α和β两个亚基各自的区域。在同一种内α-亚基是确定的，甚至在所有哺乳动物中的α-亚基的氨基酸序列都是保守的，它们的α-亚基可以互换，而β-亚基不能互换，β-亚基具有激素各自的特异性，又具有种间特异性，是激素生物活性和免疫活性的决定因素。α-亚基和β-亚基单独都不具有生物活性，只有当两者结合在一起引起立体结构上的变化，才具有生物活性。一般认为，α-亚基负责信号传导作用，β-亚基是功能亚基，参与受体结构。后经研究发现，α-亚基和β-亚基均参加受体结合和信号传导作用。
对fsh的研究始于20世纪20年代，早在1920年，zondek和aschheim就提出雌性动物垂体可能还有两种促性腺物质：一种是刺激卵泡成熟，另一种是促进排卵形成黄体。1927年，smith等证明动物在切除脑垂体后性器官萎缩，而移植垂体则可使其恢复。1931年，ferold等首次成功地将垂体提取物分为两种不同的成分后被其他学者定义为卵泡刺激素(fsh)和促黄体生成激素(lh)。
根据fsh基因序列比对分析，绵羊fsh基因与牛的fsh基因同源性较高，在临床上也可以交叉使用。一般来说在动物生产和临床医药上，fsh常用于诱导雌性动物的发情和超数排卵，以及治疗卵巢机能疾病。由于fsh与促黄体素的结构相似，且存在结构不均一性，采用常规生化方法从脑垂体分离纯化的制品均不同程度的混杂有促黄体素。据报道外源性促黄体素过高会严重影响超排结果，造成排卵量减少，受精率以及胚胎的质量、存活率都会下降。近年来，随着规模化养殖水平越来越高，对于动物繁殖疾病的治疗、辅助生殖以及相关的研究工作逐步成为研究和应用的热点。特别是规模化养殖的辅助生殖技术越来越成熟，相对而言对于生殖激素的需求也越来越大。常用的都是尿源性fsh(ufsh)，纯度比较高，促黄体素含量极低，但收集工作且分离纯化且工艺复杂。重组表达的fsh与天然相比，纯度更高，特异性强且不含促黄体素，同时由于是在体外重组表达的，从而避免了使用脑垂体组织来源感染阮病毒的危险，在一定程度上避免了疯牛病、羊痉痒病的传播。
基因工程制备蛋白类药物是生物技术发展的必然趋势，相对与提取工艺具有生产批量自由、不受原料限制、安全可控、可修饰、易于纯化等优点。目前尚未有基因重组绵羊fsh制备方法公布。
技术实现要素：
本发明提供了一种绵羊促卵泡激素基因重组表达制备方法。
本发明提供一种绵羊促卵泡激素基因重组表达制备方法，所述绵羊促卵泡激素基因重组表达制备方法包括以下步骤：
(1)获取绵羊fsh-αβ氨基酸序列，依照cho-k1细胞对外源基因表达密码子偏好，对绵羊fsh-αβ氨基酸序列进行密码子优化，并在上游依次添加了bamhi酶切位点、kozak序列和tg，下游添加了ctp序列和ecori酶切位点，得到重组fsh-αβ，将重组fsh-αβ连接至pcdna3.1(+)载体上，得到pcdna3.1-fshαβ；
(2)将pcdna3.1-fshαβ在大肠杆菌中进行表达，提取重组质粒pcdna3.1-fshαβ；
(3)将步骤(2)提取的重组质粒pcdna3.1-fshαβ转染cho-k1-s2全悬浮细胞，转染后，加入g418继续培养细胞，收集细胞上清液。
作为优选，步骤(1)中，所述重组fsh-αβ的核苷酸序列为序列表中序列1。
作为优选，步骤(2)中，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21感受态细胞。
作为优选，步骤(3)中，所述g418的终浓度为400-1000μg/ml。
作为进一步优选，步骤(3)中，所述g418的终浓度为400μg/ml。
本发明成功构建了真核表达载体pcdna3.1-fshαβ，在转染cho-k1-s2细胞后，在第24h观察时，细胞已出现荧光。经western-blot及elisa方法检测发现，fsh蛋白为分泌性表达，在培养48小时后cho-k1-s2-fsh细胞上清中检测到fsh的平均含量为87miu/ml。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为绵羊fsh-αβ密码子优化位点。
图2为pcdna3.1-fshαβ质粒酶切结果，其中，m：100bpdna分子质量标准；1：pcdna3.1-fshαβ；2：用bamh1和ecori酶切pcdna3.1-fshαβ。
图3为cho-k1-s2-fsh细胞与对照组细胞绿色荧光观察结果。其中，a：pcdna3.1-fsh转染组(100×)；b：pcdna3.1-fsh转染组(200×)；c：pcdna3.1-egfp对照组转染24h；d：pcdna3.1-egfp对照组转染48h。
图4为elisa检测标准曲线及fsh含量计算公式。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
1、基因优化及合成
从ncbi数据库中获取绵羊fsh-αβ氨基酸序列，结果如下所示：
dyyrkyaaailailslflqilhsfpdgeftmqgcpecklkenkyfskpdapiyqcmgccfsrayptparskktmlvpknitseatccvakaftkatvmgnvrvenhtechcstcyyhksksvqfcflfccwraiccrsceltnititvekeecsfcisinttwcagycytrdlvykdparpniqkactfkelvyetvkvpgcahhadslytypvatechcgkcdrdstdctvrglgpsycsfsdire。
本申请人依照cho-k1细胞对外源基因表达密码子偏好，由南京金瑞斯genscript'soptimumgenetmgenedesignsystem对氨基酸序列进行了密码子优化，并在上游添加了bamhi酶切位点(ggatcc)、kozak序列(accatgg)和tg，下游添加了ctp序列(tccagctcttccaaggctccacctccatccctgccatctccatccaggctgcctggaccaagcgatacccctatcctgccacagtga)和ecori酶切位点(gaattc)，见下划线部分。酶切位点是为了将合成的基因插入表达载体中，kozak序列为了提高蛋白可溶性表达，由于kozak序列中含有atg其实密码子，为了防止基因移码，补充了tg核苷酸，下游添加的ctp序列，是为了增加蛋白的半衰期。密码子优化位点见图1。
图1为绵羊fsh-αβ密码子优化位点。
ggatccaccatggtggactactatagaaagtacgccgctgccatcctggctatcctgtccctgtttctgcagatcctgcacagctttcccgacggcgagttcaccatgcagggctgccctgagtgtaagctgaaggagaacaagtactttagcaagcccgatgcccctatctatcagtgcatgggctgctgtttctctagagcttatcccacccctgcccgctccaagaagacaatgctggtgcctaagaatatcacctctgaggctacatgctgcgtggctaaggccttcaccaaggccacagtgatgggcaacgtgcgcgtggagaatcacaccgagtgccattgttctacatgctactatcataagagcaagtctgtgcagttctgttttctgttctgctgttggagggctatctgctgtcggtcctgtgagctgaccaacatcaccatcacagtggagaaggaggagtgcagcttttgtatctctatcaataccacatggtgcgccggctactgttatacaagagacctggtgtacaaggaccccgctcgccccaacatccagaaggcctgcaccttcaaggagctggtgtatgagacagtgaaggtgccaggctgtgctcaccatgccgactccctgtacacctatcccgtggctacagagtgccactgtggcaagtgcgacagggatagcaccgactgtacagtgcggggactgggaccatcttactgctcctttagcgatatcagggagtccagctcttccaaggctccacctccatccctgccatctccatccaggctgcctggaccaagcgatacccctatcctgccacagtgagaattc
以上序列由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成并克隆至pcdna3.1(+)载体上，命名为pcdna3.1-fshαβ。
2、表达载体pcdna3.1-fshαβ扩增及检测
2.1转化感受态细胞bl21
在-80℃冰箱中取出感受态细胞bl21，将其放入冰盒中，立即加入10μlpcdna3.1-fshαβ，将两者混合均匀，冰浴20min左右，在42℃水浴锅中放置90s。继续冰浴3min，加入0.6ml无抗lb液体培养基，37℃200r/min振荡培养约60min后，取200μl涂布含有ampicillin的lb固体平板，后置于37℃静置培养。
2.2单克隆
挑取单一、圆润的菌斑加入至含ampicillin的lb液体培养基中，放在37℃，200rmp/min的摇床中培养8h。将菌液4℃保存备用。
2.3重组质粒pcdna3.1-fshαβ的提取
使用质粒提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司的高纯质粒小提试剂盒)进行提取，具体提取过程如下：
取上述菌液各1.2ml，加入到1.5ml的ep管中，12000rpm离心1-2min，尽量吸除上清液，并向沉淀中加入250μl的p1溶液(使用前，需按说明书将rnasea加入到p1中，并混合均匀)，用枪尖吹打混匀沉淀，待沉淀完全混匀后，加入250μl的p2溶液，将ep管轻柔颠倒混匀10次以便菌体裂解均匀。向ep管中加入350μl的溶液p3溶液，立即将ep管轻柔颠倒混匀10次，此时，ep管中的溶液会出现白色絮状沉淀，将其放入到离心机中12000rpm离心5min。用移液枪吸取500μl的平衡液bl加入到吸附柱cp3中平衡，12000rpm离心2min，弃去收集管中的平衡液，将吸附柱cp3放回收集管中备用，经5min离心后，吸取ep管中的上清，注意不要吸到沉淀，然后将上清转移到已用平衡液bl平衡过的吸附柱cp3中，12000rpm离心2min，弃去滤液，加入500μl去蛋白液pd，12000rpm离心1min，弃去收集管中的滤液，将吸附柱cp3放回收集管中，再向吸附柱中加入600μl洗液pw，12000rpm离心2min，弃去洗液，重复加入pw洗液一次，弃掉废液后，将吸附柱cp3空离2min后，将其重新放入一个新的1.5mlep管中，室温晾干5-10min，向吸附柱cp3的中央部位滴加100μl洗脱缓冲液eb，室温静置约2min，12000rpm离心2min，洗脱质粒，取出约10μl用来检测提取的质粒的浓度，其余质粒冻存于-80℃冰箱中备用。pcdna3.1-fshαβ质粒浓度为775μg/ml。
2.4测序鉴定
测序结果与设计的序列进行对比，发现没有碱基突变，序列正确。重组质粒的核苷酸序列如下：
pcdna3.1-fshαβ
ggatccaccatggtggactactatagaaagtacgccgctgccatcctggctatcctgtccctgtttctgcagatcctgcacagctttcccgacggcgagttcaccatgcagggctgccctgagtgtaagctgaaggagaacaagtactttagcaagcccgatgcccctatctatcagtgcatgggctgctgtttctctagagcttatcccacccctgcccgctccaagaagacaatgctggtgcctaagaatatcacctctgaggctacatgctgcgtggctaaggccttcaccaaggccacagtgatgggcaacgtgcgcgtggagaatcacaccgagtgccattgttctacatgctactatcataagagcaagtctgtgcagttctgttttctgttctgctgttggagggctatctgctgtcggtcctgtgagctgaccaacatcaccatcacagtggagaaggaggagtgcagcttttgtatctctatcaataccacatggtgcgccggctactgttatacaagagacctggtgtacaaggaccccgctcgccccaacatccagaaggcctgcaccttcaaggagctggtgtatgagacagtgaaggtgccaggctgtgctcaccatgccgactccctgtacacctatcccgtggctacagagtgccactgtggcaagtgcgacagggatagcaccgactgtacagtgcggggactgggaccatcttactgctcctttagcgatatcagggagtccagctcttccaaggctccacctccatccctgccatctccatccaggctgcctggaccaagcgatacccctatcctgccacagtgagaattc
下划线部分为酶切位点，分别是bamhi(ggatcc)和ecori(gaattc)。
3、cho-k1-s2悬浮细胞准备及g418最小致死浓度的筛选
复苏cho-k1-s2悬浮细胞，传代2-3次，挑选处于对数生长期并生长良好的细胞将按1×105个/孔铺24孔板，然后取不同浓度梯度的g418加入24孔板中，g418的浓度梯度为0μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml。培养10-14d并每天观察细胞状态，确定g418最小致死浓度为400μg/ml。
4、pcdna3.1-fshαβ转染cho-k1-s2全悬浮细胞
取出电转试剂(cho-k1细胞专用)置室温平衡，然后取出细胞进行计数，确保细胞量达到200万个/ml。分别吸取细胞悬液500ul至4个1.5ml离心管中，900rpm离心10min。取一干净6孔板，分别吸取1mlsfm4cho培养基(hyclone)至4个孔，置于37℃培养箱平衡。取4支1.5ml离心管，分别加入82μlvolumeofnucleofectorsolution和18μlvolumeofsupplement混匀备用。将离心好的细胞取出，弃去上清液，加入混匀的100ul电转液试剂，轻轻吹打混匀，分组加入4ugpcdna3.1-fshαβ和pcdna3.1-egfp(对照组)，重悬细胞，立即将混合液转入电转杯中。最后将电转杯放入lonza电转仪中进行电转染，使用lonza公司的4d-nucleofectortm电转仪，选择程序dt133进行电转。电转完成后取出电转杯，加入500μlsfm4cho培养基(hyclone)后，立即将电转液和细胞吸至预平衡好的6孔板中，置于37℃5％co2培养箱中培养。
转染24h后，向细胞培养基中加入g418，使g418终浓度为400μg/ml，继续培养细胞。分别在转染24和48h后在荧光显微镜下观察细胞的生长状态以及对照组绿色荧光的表达情况，以初步判断转染效率。
其中，电转试剂配方为：lonza公司的商品电转缓冲液：由nucleofectorsolution和supplement组成，使用时分别82μl和18μl。
5、cho-k1-s2-fsh细胞克隆
用含400μg/ml的g418培养基稀释细胞，按1个细胞/孔接种96孔板，每孔200μl培养基，培养7-14d，在第一周后每天按时用倒置显微镜观察细胞克隆情况。
6、克隆细胞保存
将克隆细胞株从96孔板中吸出，加入1ml含400μg/mlg418的sfm4cho培养基中培养，置于24孔板中培养，然后同法置于6孔板培养，最后到75ml细胞培养瓶中。取一部分细胞继续培养，然后收取细胞上清液，其余部分细胞冻存。冻存方法：取10ml新鲜培养基将细胞重悬，然后将10ml细胞悬液加入到50ml离心管中，取约500μl细胞悬液进行计数并计算细胞总数，将细胞1000rpm，离心10min，然后取适量冻存液(7％二甲基亚砜、93％sfm4cho培养基)将细胞吹打均匀，使细胞密度为300万/ml。然后按每管300万/支分装细胞，将分装并标记好的冻存管放于4℃冰箱中静置2h，然后将其塞入棉包中，-80℃冰箱放置过夜，第2d将其放入液氮罐中长期保存。
7、重组fsh表达检测分析
7.1elisa检测重组fsh
7.1.1样品的制备
将cho-fsh阳性克隆细胞在sfm4cho培养基中进行培养，37℃、50ml/lco2培养箱培养2d后，分别收取细胞上清做为检测样品，并将样品培养基稀释5倍。
7.1.2检测方法
(1)从-20℃冰箱中取出elisa板及其他试剂，室温放置约1h，待试剂均溶化后方可开始试验；
(2)每孔加入100μl标准品及得到的稀释后的样品，室温孵育3h(置于平板摇床上，并将其调至最慢转速)；
(3)甩去板中样品，并用1×washbuffer洗板6-7次，每孔加入洗液约300μl(或加满)，每次洗完后均用卫生纸和毛巾拍干；
(4)每孔加入100μl1×biotinylatedfshdetectionantibody，室温孵育1h(置于平板摇床上，并将其调至最慢转速)；
(5)甩去板中样品，并用1×washbuffer洗板6-7次，每孔加入洗液约300μl(或加满)，每次洗完后均用卫生纸和毛巾拍干；
(6)每孔加入100μl1×hrp-streptavidinsolution，室温孵育45min(置于平板摇床上，并将其调至最慢转速)；
(7)甩去板中样品，并用1×washbuffer洗板6-7次，每孔加入洗液约300μl(或加满)，每次洗完后均用卫生纸和毛巾拍干；
(8)每孔加入100μltmbone-stepsubstratereagen，室温避光孵育30min(置于平板摇床上，并将其调至最慢转速)；
(9)向每孔中加入终止液50μl，并以450nm读板，分别得到fsh标准品和样品的od450值，以fsh标准品的od450值绘制标准曲线。
7.2克隆细胞株的高表达
根据elisa检测结果，得到fsh表达较强的细胞，将该细胞株连续传代10代，表达量没有明显下降。
二、试验结果
1、细胞g418最小致死浓度的筛选
加入不同浓度的g418培养14d发现，当g418浓度为400μg/ml时，cho-k1-s2细胞恰好全部死亡，所以cho-k1-s2细胞g418的最小致死量400μg/ml。
2、转染细胞观察
将pcdna3.1-fshαβ与对照组pcdna3.1-egfp转染cho-k1-s2细胞后，在24h就可观察到对照组出现绿色荧光，在48h时达到最强，说明pcdna3.1-fsh成功转染cho-k1-s2细胞，如图2所示。
由于实验组没办法观察，采用同载体加绿色荧光质粒作为对照，同期实验，通过观察对照组荧光，初步判断实验组的转染率，等于间接对照。
图3为cho-k1-s2-fsh细胞与对照组细胞绿色荧光观察结果。其中，a：pcdna3.1-fsh转染组(100×)；b：pcdna3.1-fsh转染组(200×)；c：pcdna3.1-egfp对照组转染24h；d：pcdna3.1-egfp对照组转染48h。
3、cho-k1-s2-fsh细胞克隆
将cho-k1-s2-fsh细胞用含400μg/ml的g418的培养基稀释，按1个细胞/孔接种96孔板，培养2周，在第一周后每天按时观察细胞，共发现cho-k1-s2-fshαβ单克隆细胞株6个。
4、克隆细胞株cho-k1-s2-fshαβ中fsh表达elisa检测
将cho-k1-s2-fsh细胞在细胞瓶中培养2d后，收取细胞上清做为检测样品，并将样品用培养基稀释，elisa检测结果如表1所示。
表1cho-k1-s2-fsh细胞的elisa检测结果
elisa检测标准曲线及fsh含量计算公式如图3所示。
图4为fsh标准品的标准曲线绘制及标准曲线方程。
5、冻存细胞的复苏
5.1细胞复苏
cho-k1-s2-fsh细胞在冻存前，平均活力为92％，复苏后，细胞活力为90％。细胞冻存前及复苏后活力均保持较好。
复苏的方法为：
根据细胞冻存记录从液氮中取出cho-k1-s2-fsh细胞，然后立即投入约40℃左右温水中快速摇晃并解冻，将冻存管以1000rpm离心10min后，在无菌条件下吸除细胞冻存液，并用1ml新鲜培养基重悬细胞，将其转移至细胞摇瓶中，取少许样品，进行细胞计数，测定细胞活力。37℃5％co2培养箱中培养。
5.2细胞观察
cho-k1-s2-fsh细胞复苏后生长良好，活力为90％。
三、小结
本发明成功构建了真核表达载体pcdna3.1-fshαβ，在转染cho-k1-s2细胞后，在第24h观察时，细胞已出现荧光。经western-blot及elisa方法检测发现，fsh蛋白为分泌性表达，在培养48小时后cho-k1-s2-fsh细胞上清中检测到fsh的平均含量为87miu/ml，可进一步优化实验条件，提高fsh的蛋白表达量。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。