一种小型鱼类DNA无损伤提取方法及DNA提取液与流程

文档序号:15457434发布日期:2018-09-15 01:29

本发明涉及一种基因组DNA提取方法,特别是一种一种小型鱼类DNA无损伤提取方法及DNA提取液。



背景技术:

随着环境污染的日趋严重,造成鱼类的生存空间和繁殖都遇到了巨大的问题,对鱼类种植资源的遗传选育已提上日程。对鱼类进行人工遗传选育是保持鱼类种质资源的重要手段和途径,分子遗传育种通常要涉及到到鱼类的非致命性取样,目前通常采用麻醉剪尾鳍的方法。这种方法对鱼类虽然不损害鱼的生命,但是对鱼类还是会造成一定的伤害,不利于鱼类的生存。

鳑鲏是杂食性鱼类,栖息在缓慢流动或静止的水域,依靠淡水河蚌(无齿蚌属:Anodonta)繁殖,活动范围小,寿命短。广泛分布于东亚、东南亚和欧洲。鳑鲏类鱼有着极高的观赏价值和药用价值,因此被许多鱼类饲养爱好者和医药学家的青睐。但随着环境栖息地的破坏,对其种质资源的保护已提上日程。

文献“一种鱼类DNA的非损伤检测方法”(宋君等,四川动物,2013)公开了一种利用鲫鱼体表粘液提取基因组DNA的方法,但该方法仅适用于体表粘液丰富的大型鱼类,其采用任何工具都可以提取到体表粘液;中国专利申请201310122540.2公开了一种从大鲵体表粘液中提取基因组DNA的方法、中国专利申请201510956095.9则公开了一种从黄鳝体表粘液提取基因组DNA的方法,然而这两篇专利所适用的对象范围均有其特殊性,大鲵身上的鳞片已经退化,直接暴露在外的皮肤中,有不少特殊的黏液腺,能分泌出大量的黏液,形成一个黏液层;黄鳝属于无鳞鱼类,其粘液腺更发达,因此两者均不存在取样难的问题。

而长度为2-5cm的小型鱼类的体表分泌粘液较少,体表粘液的提取较为困难,并不适用于上述提取方法。而在斑马鱼等小型鱼类模式动物研究中通常采用的剪尾鳍的方法,会对鱼类造成较强的机械刺激和损伤,不利于后期保种及人工繁育。因此,在遗传育种中无损伤提取小型鱼类基因组DNA已成为本领域亟待解决的技术问题。



技术实现要素:

针对上述问题,本发明提供一种DNA提取液及其应用,以实现对小型鱼类的基因组DNA提取,本发明是这样实现的:

一种小型鱼类DNA无损伤提取方法,其具体步骤如下:

1、采集鱼类体表粘液:

(1)双手带上一次性无菌医用橡胶手套,取一个白色瓷盘,并在白色瓷盘上覆盖保鲜膜,然后取鱼放置在保鲜膜上;

(2)取一根棉签,然后一只手的食指和中指分别按住鱼的头部和尾部进行动物保定,另一只手用棉签按着鱼体的侧面刮取粘液;从鱼体的腮盖后缘向尾部刮取5-10次;

(3)步骤(2)粘液刮取完成后,将鱼翻转,按照步骤(2)的方法对鱼体的另一侧刮取粘液;

(4)刮取完成后,将棉签放置在干净的试管中密封保存,并将鱼放回饲养;

2、基因组DNA提取:

(1)将DNA提取液预热至55℃;

(2)在1.5mL离心管中加入400μLDNA提取液,将步骤1获得的棉签剪断长柄,置于提取液中,涡旋10-15s, 室温静置15min;

(3)将棉签在管壁上拧干,加入400μL异丙醇(-20℃预冷),手动混匀3-5次;然后将该样品置于-80℃超低温冰箱环境中过夜处理,或液氮处理10min;

(4)取出样品后自然解冻,然后13000g/min离心10min,弃上清;向离心管中加入190μL 质量分数为70%的乙醇,13000g/min离心2min;取沉淀自然干燥后,即为所提取的基因组DNA,加入30μL ddH2O溶解。

所述DNA提取液(100mL)配置方法如下:20mL 1M Tris(pH值7.5)、5mL 0.5M EDTA、12.5mL 2M NaCl以及57.5mLddH2O,120℃灭菌后加入5mL质量分数为10%的SDS(十二烷基硫酸钠)。

一种如本发明所述小型鱼类DNA无损伤提取方法专用DAN提取液,其包括以下组分(100mL):

20mL 1M Tris、5mL 0.5M EDTA、12.5mL 2M NaCl,57.5mL ddH2O,5mL质量分数为10%的SDS。

本发明中所述“小型鱼类”是指体长度2-5cm的鱼类,包括鳑鲏、泰国斗鱼、草金鱼、孔雀鱼、曼龙等小型观赏鱼类、斑马鱼、稀有鮈鲫等模式动物、麦穗鱼等小型野杂鱼等。

本方法中的DNA提取叶配方不同于传统的酚氯抽提(对人体有害)以及目前常用的将样品浸泡在NaoH中再用Tris缓冲液中和的“hotshot”方法,能够在含量较少的体表粘液中提取到鱼基因组DNA,打破目前体表粘液提取DNA法仅适用于大型体表粘液丰富的鱼类现状,成功实现在不损伤鱼的前提下提取体长2-5cm小型鱼的体表粘液作为DAN检测的样本,此外,该DNA提取液还可适用于传统剪尾鳍法提取DNA,本发明提供的方法操作简便,检测准确性高,对鱼类产生的应激反应低,应用广泛。

附图说明

图1 为实施例1采用是本发明提供的方法和采用Takara minibest universal genomic DNA extraction Kit 5.0试剂盒提取DNA的电泳结果示意图;

其中M:DNAmarker;T:对照组试剂盒提取;P:实验组方法提取。

图2为实施例2本发明提供的皮肤粘液和尾鳍提取DNA的电泳结果示意图;

其中M:DNAmarker;F:尾鳍提取;N:皮肤粘液提取。

图3为实施例3中华鳑鲏微采用尾鳍和皮肤粘液提取DNA的RS1-F微卫星扩增电泳检测结果示意图。

图4为实施例3中华鳑鲏微采用尾鳍和皮肤粘液提取DNA的RS4-F微卫星扩增电泳检测结果对比。

图5为实施例3中华鳑鲏微采用尾鳍和皮肤粘液提取DNA的RS18-F微卫星扩增电泳检测结果对比。

图3-5中,M:DNAmarker;1为空白对照组;2、3、4是采用试剂盒提取尾鳍DAN的扩增结果;5、6、7是采用试剂盒提取皮肤粘液DNA的扩增结果;8、9、10是采用本发明方法提取尾鳍DNA的扩增结果;11、12、13是采用本发明方法提取皮肤粘液DNA的扩增结果。

图6为对中华鳑鲏进行皮肤粘液采样示意图。

具体实施方式

实施例中华鳑鲏(取自江苏农牧科技职业学院 水产科技学院鳑鲏人工繁殖试验基地,体长范围2-5cm);

DNA提取液(100mL)配置方法如下:20mL 1M Tris(pH7.5)、5mL 0.5M EDTA、12.5mL 2M NaCl以及57.5mL ddH2O,120℃灭菌后加入5mL质量分数为10%的SDS(十二烷基硫酸钠)。

实施例1 中华鳑鲏皮肤粘液基因组DNA提取

1、随机选取4条大小相近的中华鳑鲏进行皮肤粘液采样:采样方法如下:

(1)双手带上一次性无菌医用橡胶手套,取一个白色瓷盘,并在白色瓷盘上覆盖保鲜膜,然后取鱼放置在保鲜膜上;

(2)取一根棉签,然后一只手的食指和中指分别按住鱼的头部和尾部进行动物保定,另一只手用棉签按着鱼体的侧面刮取粘液;从鱼体的腮盖后缘向尾部刮取5-10次(如图6所示);

(3)步骤(2)粘液刮取完成后,将鱼翻转,按照步骤(2)的方法对鱼体的另一侧刮取粘液;

(4)刮取完成后,将棉签放置在预先装有DNA提取液的1.5mL灭菌离心管中密封保存,并将中华鳑鲏放回饲养;

获得的4份中华鳑鲏体表粘液样品。

1、提取中华鳑鲏体表粘液基因组DNA

实验组:

(1)将DNA提取液预热至55℃;

(2)在1.5mL离心管中加入400μLDNA提取液,将步骤1获得的棉签(随机选取2份)剪断长柄,分别置于提取液中,涡旋10-15s, 室温静置15min;

(3)将棉签在管壁上拧干,加入400μL异丙醇(-20℃预冷),手动混匀3-5次,然后将该样品置于-80℃冰箱中过夜(具体实施中,也可以液氮处理10min后使用);

(4)取出样品自然解冻,13000g/min离心10min,弃上清;加入190μL 质量分数为70%的乙醇,13000g/min离心2min;

(5)取沉淀自然干燥后,即为提取获得的皮肤粘液基因组DNA,加入30μL ddH2O溶解。

对照组:

采用Takara minibest universal genomic DNA extraction Kit 5.0(购自Takara公司)对两份样品进行提取,提取步骤严格依照试剂盒说明书。

2、电泳检测

将步骤2中实验组和对照组提取的DNA样品(缓冲溶液1XTAE,电压120V,1%琼脂糖,上样量10uL,电泳25min),检测结果如图1所示。由图1可见,实验组的DNA提取量虽然没有对照组高,但得到的DNA模板条带清晰,无拖尾现象,证明了本发明方法提取基因组DNA的可靠性 。

实施例2 中华鳑鲏尾鳍与皮肤粘液提取

1、随机选取1条中华鳑鲏,采用实施例1实验组相同的提取方法提取中华鳑鲏皮肤粘液基因组DNA;

2、中华鳑鲏尾鳍DNA提取

(1)采用灭菌过的手术剪剪取部分中华鳑鲏尾鳍(大小不超过尾鳍一半)

(2)a)向DNA提取液中加入15μL 20mg/mL蛋白酶K,57℃孵育30min,获得提取液;

b)然后取1.5mL离心管,加入400μL步骤a)获得的提取液,将步骤(1)获得的尾鳍分别置于提取液中,涡旋10-15s, 室温静置15min;

c)将尾鳍取出,分别加入400μL异丙醇(-20℃预冷),手动混匀3-5次;然后13000g/min离心10min,弃上清;加入190μL 质量分数为70%的乙醇,13000g/min离心2min;取沉淀自然干燥后,即为提取后的尾鳍基因组DNA,加入30μL ddH2O溶解。

3、电泳检测

将步骤2中实验组和对照组提取的DNA样品进行电泳检测,缓冲溶液1XTAE,电压120V,25min;1%琼脂糖,上样量10uL,电泳检测结果如图2所示。

由图2可见,皮肤粘液DNA提取量虽然没有传统剪尾鳍提取方法高,但得到的DNA模板条带清晰,无拖尾现象,证明了本申请方法提取基因组DNA的可靠性。

实施例3 中华鳑鲏微卫星扩增检测试验

分别采用3条微卫星引物Rs1-F、Rs4-F及Rs18-F(参见文献:Xiong L W, Wang Q, Wang S B, et al. Description of 21 microsatellites for the Chinese bitterling, Rhodeus sinensis Günther, 1868[J]. Journal of Applied Ichthyology, 2017, 33(5): 940-942. RS1.RS4 RS18 公开内容),分别对实施例2获得的尾鳍及皮肤粘液提取样品进行PCR产物扩增,

PCR扩增体系:总反应体系50ul,诺唯赞2×mixTap酶25ul, 上下游引物各2ul, 基因组模板2ul,无菌水19ul

PCR扩增参数: 94℃预变性3min, 94℃变性30S, 58℃退火30s, 72℃延伸30s, 35个循环,72℃延伸7min, 4℃保温;

上样量40uL,PCR扩增产物电泳检测条件同实施例2,3条微卫星引物电泳检测结果分别如图3-5所示。

附图3-5中, M 为分子量标准( Marker) ; 泳道1 为扩增实验的空白对照; 泳道2、3、4 是以尾鳍DNA为模板的扩增结果(试剂盒提取DNA); 泳道5、6、7 是以皮肤粘液DNA为模板的扩增结果(试剂盒提取DNA); 泳道8、9、10是以实施例2中获得的尾鳍DNA为模板的扩增结果; 泳道11、12、13 是以实施例2中获得的皮肤粘液DNA为模板的扩增结果。

图3-5中所述试剂盒均为Takara minibest universal genomic DNA extraction Kit 5.0试剂盒。

图3-5检测结果说明,PCR微卫星扩增结果显示从皮肤粘液提取扩增的效果与传统剪尾鳍提取扩增结果一致,试剂盒提取扩增效果与本发明方法提取扩增结果一致,验证了申请DNA提取方法的有效性与可靠性。

对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

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