与bm2表型相关的基因、变异及其分子标记物的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及与玉米红棕色叶脉突变体bm2相关的基因mthfr启动子区插入的mite转座子及其分子标记物，所述改变的基因促成玉米木质素成份变化的表型，进而提高玉米细胞壁消化率。

背景技术：

玉米（zeamaysl.）属禾本科玉蜀黍属一年生c4草本植物，是“粮-能-饲”三用作物。植物细胞壁主要由木质素、纤维素和半纤维素组成，它们是决定生物质能源转化效率和牧草品质的重要因素。解析与玉米的木质素代谢途径相关的调控机制，改变木质素成份进而增加细胞壁消化率，对玉米的遗传育种具有重要的现实指导意义。

木质素是一类苯丙烷类单体化合物聚合而成的多聚化学物，包括三种单体成份，分别为紫丁香基木质素（syringyllignin，s-木质素）、愈创木基木质素（guaiacyllignin，g-木质素）和对-羟基苯基木质素（hydroxy-phenyllignin，h-木质素）。其中，s型和g型木质素都属于甲基化单体，甲基化反应由木质素合成途径的两个甲基转移酶催化进行，它们分别是咖啡酰辅酶a氧甲基转移酶（ccoaomt）和咖啡酸氧甲基转移酶（comt）。而甲基供体则是来源于一碳代谢途径的s-腺苷甲硫氨酸（s-adenosylmethionine,sam）。

一碳代谢途径主要包括四氢叶酸（thf）循环和甲硫氨酸（methionine）循环，其中，thf循环主要负责一碳单位的转运，而methionine循环主要负责一碳单位的活性供体sam的生成。thf循环中的关键酶亚甲基四氢叶酸还原酶（mthfr）能够为同型半胱氨酸（homocysteine，hcy）提供甲基，进而形成甲硫氨酸。因此，mthfr功能缺失能够显著影响sam及其下游产物s-腺苷高半胱氨酸（s-adenosylhomocysteine，sah）在细胞中的浓度和比例，进而干扰依赖sam的甲基转移酶的正常功能[chenetal,regulationofhomocysteinemetabolismandmethylationinhumanandmousetissues,2010,fasebj,24:2804-2817]。植物的木质素单体合成中，s型和g型木质素单体分别含有2个和1个甲基，其甲基供体均来自于一碳代谢途径的sam。因此，一碳代谢途径关键酶的变化，会影响到木质素单体（尤其是s型和g型单体）的含量。

brown-midrib突变体是一类木质素合成相关的突变体，目前已发现天然突变体6个，分别命名为bm1-6。美国先锋-杜邦公司已经利用bm突变体实现了商业化品种的培育和推广，因此，研究bm突变体的突变机制对低木质素玉米的培育具有重要意义。前期鉴定玉米bm2突变体的突变座位为一碳代谢途径关键酶基因mthfr[tangetal,themaizebrownmidrib2(bm2)geneencodesamethylenetetrahydrofolatereductasethatcontributestoligninaccumulation.plantj,2014,77:380-392]。玉米中mthfr基因只有1个拷贝（gramzm2g347056），因此其突变会导致mthfr功能丧失，但其突变机制并不清楚。本发明主要针对其突变机制进行分析，通过基因克隆、体外活性检测和体内生理变化等方案确立bm2突变体中mthfr的具体突变机制，并以此为依据，开发分子标记物，为深入理解玉米及其它禾本科植物木质素代谢调控机制提供理论基础，也为定向分子遗传育种提供现实指导意义。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种mite转座子插入mthfr基因启动子区，导致mthfr活性降低的突变机制；该mite转座子的序列如seqidno.2。

本发明的第二个目的是提供一种鉴定mthfr基因启动子区mite转座子插入的分子标记；利用该分子标记可以用于鉴定玉米bm2突变体。

本发明的第三个目的是提供玉米mthfr基因启动子区的mite转座子插入导致mthfr活性降低，进而改变木质素组份、提高细胞壁消化率方面的应用。

所述玉米bm2突变体突变基因mthfr基因启动子区的插入序列，经pcr-电泳检测和测序分析，发现其为一个tourist-likemite转座子，序列长度为347bp；根据其旁侧序列，我们设计了特异性保守探针，可用于快速鉴定bm2突变体；该mite转座子的插入能够导致mthfr转录活性降低，进而抑制其酶活性；mthfr活性的降低，能够导致一碳代谢关键化合物sah和sam的比值升高，进而降低了bm2突变体的g型和s型木质素，并提高其细胞壁消化率。

本发明的核心特点和发明理念包括：

1、本发明利用分子生物学手段，通过pcr扩增获得mite转座子的mthfr基因启动子区的插入位点，并以此位点开发分子标记，可用于快速鉴定bm2突变体；

2、本发明从调控一碳代谢途径的基因mthfr着手，分析玉米木质素合成途径的调控机制，进一步深入解析了单子叶禾本科植物中木质素对细胞壁消化率的影响。

本发明的有益效果如下：

1、本发明中bm2突变体的突变基因mthfr是一碳代谢过程中的关键酶基因，这对于研究一碳代谢途径和木质素合成途径的联系具有重要的理论指导意义；

2、本发明中针对mthfr基因启动子区插入的mite转座子设计的分子标记，对于在低木质素玉米突变体育种工作中快速鉴定bm2突变体具有重要的实践意义；

3、本发明中所获得的bm2突变体的细胞壁消化率数据资源，对于低木质素玉米育种的应用前景具有重要的实践指导意义。

附图说明

图1玉米bm2突变体表型图。

图2玉米bm2突变体中mthfr基因的实时荧光定量pcr检测。

图3玉米bm2突变体mthfr基因启动子区mite转座子的二级结构图示。

图4玉米bm2突变体中mthfr基因启动子区mite转座子pcr检测。

图5玉米bm2突变体mthfr基因启动子区mite转座子对mthfr基因转录本的影响。

图6玉米bm2突变体的牧草消化率（a）和可溶性糖产量（b）分析。

图7玉米bm2突变体回交群体bc1[(bm2xb73)♂xbm2♀]的分子标记检测。其中，单株1、2、3、4、8、9、10、13和16是bm2纯合株系（片段大小为406bp）。

具体实施方式

下面对与bm2表型相关的基因、变异及其分子标记物的具体数据进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂和分子标记探针等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购买。

实施例1：玉米bm2突变体表型及分子鉴定

玉米bm2突变体种子来源于maizegdb（www.maizegdb.org）中的突变体库，其stockid为114abm2-pi586725。使用普通营养土，发种、培育，持续观察表型，待幼苗大约生长至六叶期，叶脉出现红棕色的表型（图1）。取红棕色叶脉新鲜组织，同时取非红色（b73）叶脉组织作为对照，用trizolreagent（invitrogen公司，货号15596026）提取叶脉总rna，使用琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪（nanodrop）检测总rna的含量和纯度，取2.0μg总rna做逆转录反应，所采用的逆转录酶为m-mlv（promega公司，货号m1701），逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录反应合成的第一链cdna为模板，分别使用引物zmmthfr-5’utrf/r、zmmthfr-orff/r和zmmthfr-3’utrf/r作为探针，进行实时荧光定量pcr检测，引物序列如下：

zmmthfr-5’utrf:cctgcctcgcctcaccaccattag

zmmthfr-5’utrr:ccatcccccgccgcctccag

zmmthfr-orff:ctggaggcggcgggggatgg

zmmthfr-orfr:cggttggcgatttcgagggtaagg

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zmmthfr-3’utrr:tccagaaagccaagagaaatcaag

实时荧光定量pcr反应体系为25μl，其中正/反向引物各1μl，cdna模板2μl，sybrgreenqrtmastermix（购自宝生物工程有限公司）12.5μl，ddh2o补足至25μl。实时荧光定量pcr仪使用roche480，反应程序使用两步法。经检测，zmmthfr的表达量在utr区和orf区均显著下降（图2）。根据先前的报道，其orf区域并未发生变异[tangetal,themaizebrownmidrib2(bm2)geneencodesamethylenetetrahydrofolatereductasethatcontributestoligninaccumulation.plantj,2014,77:380-392]。

实施例2：bm2突变体检测探针设计

随后，我们提取了对照植株（b73）和突变体植株（114a）的基因组dna（ctab法），使用引物zmmthfr-prof/r，进行常规pcr扩增zmmthfr基因的启动子区，pcr反应体系为：2μlcdna，5μl10×buffer，4μldntp（2.5mm），正/反向引物（10μm）各1μl，0.5μltaq酶（5u/μl）和36.5μlddh2o。在冰上加样后混匀。pcr反应条件为：94^oc5min；94^oc30sec，56^oc45sec；72^oc2min，34个循环；72^oc10min。pcr扩增获得约2.7kb的片段。引物序列如下：

zmmthfr-prof:ttagagtgtggataaaatgtactacc

zmmthfr-pror:ctcgaaaacctcaccacgagctt

电泳结果显示，bm2突变体中扩增片段比b73中扩增片段长约400bp。随后，我们对两个扩增片段进行凝胶回收（使用promega凝胶回收试剂盒），常规测序（北京六合华大基因科技有限公司），测序结果显示：bm2突变体中mthfr基因启动子区（seqidno.1）插入一个长347bp的转座子（seqidno.2）。经分析表明，该转座子属于tourist亚家族mite转座子（图3）。

根据该转座子的插入位置，我们设计了检测引物，分别检测野生型（b73）、突变体（114a）和b73与114a的杂合株系。使用常规pcr检测方法，pcr反应体系为：2μlcdna，5μl10×buffer，4μldntp（2.5mm），正/反向引物（10μm）各1μl，0.5μltaq酶（5u/μl）和36.5μlddh2o。在冰上加样后混匀。pcr反应条件为：94^oc5min；94^oc30sec，56^oc30sec；72^oc30sec，32个循环；72^oc7min，pcr扩增获得约500bp左右的片段（图4）。其中，b73中为参考基因组序列长度，bm2中为参考基因组序列长度加上mite转座子（347bp），而杂合植株中有两条带，分别来源于b73和bm2。随后，我们将该引物优化并设计成检测探针，用于bm2（114a）的突变体检测，探针序列如下：

zm114af:cctgcctcgcctcaccaccattag

zm114ar:ctcgaaaacctcaccacgagctt

实施例3：mite转座子对mthfr转录水平的影响

基于实施例1所示的bm2突变体中zmmthfr表达量下降和实施例2所示的zmmthfr基因启动子区插入的mite转座子，我们分析了mite转座子插入对zmmthfr转录的影响。使用的方法为启动子转录活性检测，使用的载体为pgreenii0800-luc[hellensetal,transientexpressionvectorsforfunctionalgenomic,quantificationofpromoteractivityandrnasilencinginplants,plantmethods,2005,1:13]。首先，我们分别将实施例2中分别获得的b73中mthfr基因启动子（约2.7kb）和bm2中mthfr基因启动子（约3.1kb）使用凝胶回收试剂盒（promega）进行回收，随后使用in-fusion酶（abm公司）连接进入pgreenii0800-luc载体，分别形成b73-5’ncr和bm2-5’ncr重组质粒，转化玉米原生质体。为了防止bm2中mthfr基因启动子其它位点可能对mthfr转录水平的影响，我们同时使用实施例2中zm114af/r探针扩增获得的mite转座子，融合进入b73中mthfr基因启动子区的相应位置，随后使用in-fusion酶连接进入pgreenii0800-luc载体，形成cb73-5’ncr重组质粒。玉米原生质体制备参考sheen的方法[sheen,signaltransductioninmaizeandarabidopsismesophyllprotoplasts,plantphysiol,2001,127:1466-1475]。

将上述三个质粒（b73-5’ncr、bm2-5’ncr和cb73-5’ncr）同时转化玉米原生质体，使用luc-pair™duo-luciferasehsassaykit进行luc和ren的荧光系数测定，结果显示mite转座子的插入抑制了mthfr基因启动子的转录活性（图5）。

实施例4：bm2突变体的细胞壁消化率评估

mthfr是一碳代谢途径的关键酶，其活性受抑制会影响木质素甲基化反应的进行。为了评估bm2突变体的细胞壁消化率，我们分别检测了牧草消化率和可发酵糖产量。首先，分别取生长90天的玉米叶脉，40^oc干燥96h，研磨粉碎后测定牧草消化率。测定方法为近红外光谱法，使用仪器为pertenda7200（瑞典波通），扫描波长为1100nm-2500nm。每个样品重复8次。结果显示，bm2突变体的中性洗涤纤维消化率ndfd和体外干物质消化率ivtdmd均显著增加6%-8%（图6a）。随后，我们检测了可发酵糖产量，使用苯酚硫酸酯法[duboisetal，colorimetricmethodfordeterminationofsugarsandrelatedsubstances.1956,analyticalchemistry,28:350-356]，具体测定方法如下：使用纤维素酶和纤维二糖酶混合物直接酶解细胞壁残留物72h，作为对照；使用1.5%h2so4在121^oc条件下预处理60min，再使用相同量的纤维素酶和纤维素二糖酶混合物酶解细胞壁残留物72h，作为处理组。酶解产物使用苯酚硫酸酯法测定可发酵糖含量。糖化效率是酶解前后可发酵糖含量的差值与酶解前可发酵糖含量的比值。因此，依据公式：可发酵糖产量（g/plant）=地上部细胞壁碳水化合物产量（g/plant）×糖化效率，计算出转基因植株的可发酵糖产量。测定结果显示，酸解法和酶解法获得的可发酵糖产量分别增加了19%和32%（图6b）。

实施例5：bm2突变体检测探针的应用

考虑到玉米红棕色叶脉突变体的巨大利用价值，但表型鉴定却需要其生长至六叶期之后才能确定，因此本发明利用分子标记物在基因组dna水平对bm2突变体进行鉴定，鉴定方法如实施例2所示，具体见图4。为了进一步验证该探针的有效性，我们使用bm2突变体回交群体bc1[(bm2xb73)♂xbm2♀]的16个单株进行了验证分析。取种子胚乳，使用碱煮法提取dna。具体方法：切少量胚乳，加100μl0.1mnaoh，90^oc加热15min，冷却至室温，加入100μlte缓冲液，取5μl作为模板，进行pcr反应。反应体系为20μl，分别加zm114a/r各1μl，taqmix10μl，加水至20μl。反应程序为：94^oc5min；94^oc30sec，56^oc30sec；72^oc30sec，32个循环；72^oc7min。凝胶电泳结果如图7所示，16株样品中，10株为bm2纯合株系，6株为杂合株系。该方法可快速鉴定bm2突变体。

序列表

<110>中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120>与bm2表型相关的基因、变异及其分子标记物

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2982

<212>dna

<213>玉米(zeamaysl.)

<400>1

ttagagtgtggataaaatgtactacccacccagcacacccccctctcgatggaagccatt60

acttaactggggattagtcgaactagctacctttcttcctttgttgctcgcttttcttcc120

ttcccaaccaccgaagaacgggaggaaatgcgggtcggtggactctagcagtctagagct180

agccattttggtacagtcacagagcggcggtggaccactactagccaactgagaggagca240

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<212>dna

<213>玉米(zeamaysl.)

<400>2

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